王艷艷 常凱 劉晨霞 那琬琳 江忠勇 熊杰

（中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科 成都 610083）

髓鞘是圍繞在軸突外層的脂質(zhì)膜，保護(hù)軸突不受外界環(huán)境的影響，可加速神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)。脫髓鞘疾病發(fā)生時(shí)，機(jī)體內(nèi)的少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞（Oligodendrocyte precursor cells，OPCs）遷移到病變處快速增殖，進(jìn)而分化為成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞，產(chǎn)生髓磷脂相關(guān)蛋白以包裹受損的軸突［1］。因事故照射、應(yīng)急照射、惡性腫瘤放射治療等受到大劑量外照射引起的腦型急性放射病，以腦組織損傷為基本病變，是極其嚴(yán)重的急性放射?。?-3］。輻照損傷大鼠實(shí)驗(yàn)研究表明：其主要病理機(jī)制為大腦少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，OPCs增殖和分化障礙，整個(gè)白質(zhì)（包括胼胝體、海馬傘、海馬聯(lián)合、皮層下區(qū)域、小腦）脫髓鞘改變，胼胝體體積較正常減少25%。因此認(rèn)為，治療放射性腦病的關(guān)鍵是促進(jìn)OPCs的定向分化和增殖，增加少突膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量和形成髓鞘［4］。

已有研究表明OPCs的分化發(fā)育受到許多細(xì)胞因子及相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控，其中包括毒蕈堿受體等信號(hào)通路［5-6］。而OPCs表達(dá)乙酰膽堿的毒蕈堿 受 體 （Muscarinic acetylcholine receptors，mAChRs），故毒蕈堿通路是可以促進(jìn)OPCs分化的重要通路［7］。氯馬斯汀為治療過敏及感冒癥狀的常用抗組胺藥，其同樣具有抗毒蕈堿作用，且能高效通過血腦屏障。因而本文旨在探討氯馬斯汀在急性放射損傷后OPCs細(xì)胞分化和髓鞘形成中的作用及意義，以期為治療因事故照射或顱內(nèi)腫瘤、腦血管畸形、頭頸部惡性腫瘤等放射治療后導(dǎo)致的放射性腦病提供新的靶點(diǎn)和藥物［8］。

1 材料與方法

1.1 主要材料

杜氏改良Eagle培養(yǎng)（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）完全培養(yǎng)基（KGM12800 S-500，凱基生物）、氯馬斯汀（Sigma）、髓鞘堿性蛋白（Myelin basic protein，MBP）（10458-1-AP，protrintech）、NF（25805-1-AP，protrintech）、NG2antibody（FITC）（orb463913，biorbyt）、OLIG2（13999-1-AP，protrintech）、山羊抗兔IgG/488（ZF-0511，中山金橋）、Goat Anti-Rabbit IgG Cy3，Conjugated：（CW0159S，CWBIO）、即用型4'，6-二 脒 基-2-苯 基 吲 哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染液（KGA215-50，凱基）、LV-Chrm1-5-RNA（吉?jiǎng)P基因）、新生SD大鼠（達(dá)碩動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供）。熒光PCR儀（CFX Connect?實(shí)時(shí)，上海伯樂）、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Chemi Doc TM XRS+，上海伯樂）。

1.2 急性輻射損傷腦組織病理改變

使用中國核動(dòng)力院設(shè)備制造廠的Cs-137輻照裝置對(duì)4周齡健康SD大鼠進(jìn)行γ射線全身照射，總劑量50Gy［9］，劑量率為5.224Gy/min。1d后取腦組織進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察急性放射損傷腦組織病理變化情況。

1.3 動(dòng)物分組及處理

SD大鼠飲水、攝食1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、單純輻射模型組和氯馬斯汀組，每組6只。除正常對(duì)照組大鼠外，其余各組大鼠腦部均給予50Gy的γ射線照射，劑量率為5.224Gy/min，正常對(duì)照組和單純輻射模型組給予等量生理鹽水灌胃，氯馬斯汀組給予氯馬斯汀灌胃（劑量為0.9mg/kg），連續(xù)3d。照射后第3天處死大鼠，摘取腦組織備用。

1.4 原代細(xì)胞分離與培養(yǎng)

取新生24h的SD大鼠，用75%酒精消毒后，開顱取腦，置于預(yù)冷的hank’s中沖洗，剝離腦膜和血管，眼科剪將皮質(zhì)層剪成1mm×1mm的大小，轉(zhuǎn)移到離心管中進(jìn)行機(jī)械吹打，靜置5min，取上清液備用。

大鼠神經(jīng)元細(xì)胞原代分離。用100μmol/L的細(xì)胞篩網(wǎng)進(jìn)行過濾，收集濾液，1000r/min離心5min，棄去上清液，分別加入神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基（Neurobasal+1% B27+100nmol/L L-谷氨酰胺+100ng/mL NGF+1%P/S）進(jìn)行重懸，1×106mL-1接種在培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，1～2d換液一次，第3天加入阿糖胞苷（3μmol/L），1d后換全液。

大鼠OPCs原代分離。用70μmol/L的細(xì)胞篩網(wǎng)進(jìn)行過濾，1000r/min離心5min，棄去上清液，加入含10%FBS高糖DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，1×106mL-1密度接種于0.025%多聚賴氨酸預(yù)處理的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，2～3d換液一次，培養(yǎng)8～9d，待細(xì)胞融匯并形成明顯分層，開始OPCs振蕩分離和純化。

1.5 Cell counting kit-8(CCK8)實(shí)驗(yàn)

將OPCs細(xì)胞消化、重懸、計(jì)數(shù)、鋪板，細(xì)胞密度為7×103孔-1；待細(xì)胞貼壁后，加不同濃度的氯馬斯?。?.1μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.6 μmol/L和0.8μmol/L）處理24h，將待測(cè)的96孔板細(xì)胞換成相同的培養(yǎng)基，每孔100μL；每孔加入CCK8試劑10μL，孵育2h；在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光值。

1.6 慢病毒轉(zhuǎn)染

將慢病毒配制含終濃度為5μg/mL的Polybrenede的培養(yǎng)液，用該培養(yǎng)液按MOI值為5對(duì)病毒進(jìn)行稀釋，加入培養(yǎng)板中輕輕混勻，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，過夜培養(yǎng)，吸出含慢病毒顆粒的培養(yǎng)液，換上新鮮培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染72h后利用RT-qPCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.7 免疫熒光染色

在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的培養(yǎng)皿用PBS浸洗，用4%的多聚甲醛固定15min，PBS浸洗，0.5%Triton X-100（PBS配制）室溫通透20min。PBS浸洗，在培養(yǎng)皿上滴加5% BSA，37°C封閉30min，隨后每個(gè)培養(yǎng)皿滴加足夠量稀釋好的一抗，4℃孵育過夜。PBS浸洗后，滴加稀釋好的熒光二抗，37°C孵育30min，PBS浸洗，滴加DAPI避光孵育5min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，用20%甘油封閉培養(yǎng)皿，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）

收集細(xì)胞懸液以提取總RNA。利用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度（OD260/OD280）。將RNA通過逆轉(zhuǎn)錄HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA。利用熒光PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)體系和步驟詳見說明書。

1.9 Western blot檢測(cè)

收集細(xì)胞裂解，獲取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性，上樣，進(jìn)行SDS-PAGE2電泳2h，然后用300mA恒流轉(zhuǎn)膜80min。一抗溶液孵育，4°C過夜；二抗溶液中室溫孵育2h。在膜上滴加ECL發(fā)光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用“Quantityone”軟件分析各抗體條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用Graphpad Prism7進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，表示為“平均值±SD”。組間的顯著性差異經(jīng)T-test、One-way和Two-way ANOVA分析，以p＜0.05作為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 急性輻射損傷腦組織病理改變

為了觀察急性輻射損傷對(duì)大鼠腦組織的病理改變，依據(jù)職業(yè)性外照射急性放射病診斷中腦型急性放射病的診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］，我們用Cs-137γ射線對(duì)大鼠全身進(jìn)行一次性輻照，總劑量為50Gy，劑量率為5.224Gy/min。1d后取大鼠腦組織進(jìn)行HE染色，結(jié)果見圖1。

圖1 急性輻射損傷大鼠腦組織HE染色:(a)正常對(duì)照大鼠腦組織；(b)急性輻射損傷大鼠腦組織Fig.1 HE staining of brain tissue in rats with acute radiation injury:(a)normal control rat brain tissue;(b)acute radiation injury rat brain tissue

與未輻照的正常對(duì)照大鼠腦組織比較，急性輻射損傷后的大鼠腦組織出現(xiàn)明顯的神經(jīng)纖維增粗、斷裂，少突膠質(zhì)細(xì)胞明顯減少。

2.2 大鼠腦組織MBP蛋白表達(dá)測(cè)定

為了觀察氯馬斯汀對(duì)急性輻射損傷大鼠髓鞘再生的影響，Western blot檢測(cè)MBP蛋白的表達(dá)情況。與對(duì)照組比較，單純輻射模型組大鼠腦組織MBP蛋白量表達(dá)顯著降低（p＜0.01）；氯馬斯汀組大鼠腦組織MBP蛋白表達(dá)量降低（p＜0.05），與氯馬斯汀組比較，單純輻射模型大鼠腦組織MBP蛋白表達(dá)量降低（p＜0.05）（圖2）。

圖2 腦組織MBP蛋白表達(dá)（*p＜0.05，**p＜0.01，與對(duì)照組相比；#p＜0.05，與氯馬斯汀相比）Fig.2 Protein expression of MBP in rat brain tissue

2.3 原代神經(jīng)元細(xì)胞鑒定

為鑒定分離的大鼠原代細(xì)胞是神經(jīng)元細(xì)胞和OPCs（圖3），通過免疫熒光分別檢測(cè)標(biāo)志蛋白NF和NG2的表達(dá)［10］，結(jié)果如圖4所示。NF和NG2免疫熒光染色強(qiáng)陽性，證明所分離培養(yǎng)的原代細(xì)胞為神經(jīng)元細(xì)胞和OPCs。

圖3 原代分離培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元細(xì)胞和OPCs：(a)大鼠神經(jīng)元細(xì)胞；(b)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞Fig.3 Primary isolated and cultured rat neuron cells and oligodendrocyte precursor cells:(a)rat neuron cells;(b)oligodendrocyte precursor cells

圖4 大鼠神經(jīng)元細(xì)胞和OPCs鑒定Fig.4 Identification of rat neuronal cells and oligodendrocyte precursor cells

2.4 氯馬斯汀對(duì)OPCs細(xì)胞增殖的影響

為探究不同濃度的氯馬斯?。?.1μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.6μmol/L、0.8μmol/L）對(duì)OPCs細(xì)胞增殖的影響，利用CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果如圖5所示。

圖5 CCK8檢測(cè)氯馬斯汀對(duì)OPCs細(xì)胞增殖的影響;*p＜0.05，與對(duì)照組相比Fig.5 CCK8detects the effect of clemastine on the proliferation of OPCs cells;*p＜0.05,compared with the control group

氯馬斯汀濃度梯度（0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.6μmol/L、0.8μmol/L）作用于OPCs細(xì)胞，0.1μmol/L、0.2μmol/L組與對(duì)照組比較細(xì)胞存活率無明顯差異（存活率分別為84.26±7.76和69.22±9.26），當(dāng)氯馬斯汀濃度為0.4μmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖受到抑制，存活率為61.26±11.27（p＜0.01），且隨著濃度的增加，細(xì)胞活力越來越低（藥物濃度為0.6μmol/L、0.8μmol/L時(shí)，存活率分別為41.86±7.37、2.65±0.35），表明氯馬斯汀能夠抑制OPCs細(xì)胞增殖，且具有濃度效率，因此選擇0.2μmol/L的氯馬斯汀進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.5 轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

為了驗(yàn)證毒蕈堿型受體1（CHRM1）、CHRM2和CHRM3干擾表達(dá)的轉(zhuǎn)染效率，通過RTqPCR和Western blot檢測(cè)mRNA和蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果見圖6。與對(duì)照組相比，CHRM1干擾顯著降低了CHRM1的mRNA和蛋白的表達(dá)水平（圖6（a））；CHRM2設(shè)計(jì)了3條干擾序列（M2R-1、M2R-2和M2R-3），結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，M2R-2和M2R-3干擾顯著降低了CHRM2的mRNA和蛋白的表達(dá)水平（圖6（b）），其中第3條干擾序列（M2R-3）的干擾效率最佳，用于后續(xù)研究；與對(duì)照組相比，CHRM3、CHRM4、CHRM5干擾顯著降低了CHRM3、CHRM4和CHRM5的mRNA和蛋白的表達(dá)水平（圖6（c）、（d）、（e））。結(jié)果表明，CHRM1、CHRM2、CHRM3、CHRM4和CHRM5轉(zhuǎn)染成功。

圖6 RT-qPCR和Western blot檢測(cè)CHRM1、CHRM2、CHRM3、CHRM4和CHRM5干擾的轉(zhuǎn)染效率；**p＜0.01，與對(duì)照組相比Fig.6 RT-qPCR and Western blot to detect the transfection efficiency of CHRM1,CHRM2,CHRM3,CHRM4,and CHRM5 interference;**p＜0.01,compared with the control group

2.6 氯馬斯汀對(duì)OPCs細(xì)胞分化和髓鞘形成的影響

為探究氯馬斯汀對(duì)OPCs細(xì)胞分化和髓鞘形成的影響，通過免疫熒光檢測(cè)髓鞘堿性蛋白（MBP）和少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2（OLIG2）的表達(dá)，以及Western blot檢測(cè)MBP的表達(dá)［11-12］。與正常組相比，CHRM2干擾（M2R）顯著促進(jìn)了MBP的表達(dá)，而氯馬斯汀處理后進(jìn)一步促進(jìn)了MBP的表達(dá)（圖7（a））；此外，免疫雙熒光也得到了類似的結(jié)果，CHRM2干擾（M2R）顯著促進(jìn)了MBP和OLIG2的表達(dá)，而氯馬斯汀處理進(jìn)一步促進(jìn)了MBP和OLIG2的表達(dá)（圖7（b））；結(jié)果表明氯馬斯汀可作用于M2R，促進(jìn)OPCs細(xì)胞分化和髓鞘形成。

圖7 氯馬斯汀對(duì)OPCs細(xì)胞分化和髓鞘形成的影響：(a)Western blot檢測(cè)MBP的蛋白表達(dá)水平；(b)免疫熒光檢測(cè)MBP和OLIG2的表達(dá);*p＜0.05，與對(duì)照組相比Fig.7 Effect of clemastine on cell differentiation and myelination of OPCs:(a)western blot to detect the protein expression level of MBP;(b)immunofluorescence to detect the expression of MBP and OLIG2;*p＜0.05,compared with the control group

3 討論

隨著核技術(shù)在醫(yī)學(xué)及科研等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，核與輻射事故引發(fā)的腦型急性放射病及防治越發(fā)引起人們的重視。Piao等［4］研究發(fā)現(xiàn)，將4周齡健康SD大鼠進(jìn)行放射線照射，全顱總劑量50Gy，水迷宮和加速條件下的旋轉(zhuǎn)等行為學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，被照射大鼠的認(rèn)知力、理解力、記憶力嚴(yán)重下降，運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力和情緒障礙。其主要病理機(jī)制為大腦少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，OPCs增殖和分化障礙，整個(gè)白質(zhì)脫髓鞘改變［5］，目前對(duì)該疾病的治療仍處于探索階段。因此，尋找一種能夠有效促進(jìn)自體OPCs增殖與分化的藥物或者治療方式，是我們面臨的問題和挑戰(zhàn)。

急性放射損傷、顱內(nèi)腫瘤、腦血管畸形、頭頸部惡性腫瘤放射治療以及自身免疫反應(yīng)性疾病等多種脫髓鞘疾病發(fā)病多由OPCs分化障礙所引起。研究并明確OPCs分化的分子機(jī)制，對(duì)于闡明脫髓鞘疾病的發(fā)病機(jī)制和尋找疾病治療的新靶點(diǎn)均有重要意義［13］。在本研究中，我們驗(yàn)證了急性放射損傷大鼠腦組織髓鞘脫失，而應(yīng)用氯馬斯汀后，髓鞘形成增加。并通過進(jìn)一步研究，明確了氯馬斯汀在OPCs細(xì)胞分化中的作用。發(fā)現(xiàn)氯馬斯汀能夠抑制OPCs細(xì)胞增殖，且具有濃度效率，排除其對(duì)OPCs細(xì)胞增殖的影響后，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氯馬斯汀能夠增強(qiáng)CHRM2干擾（M2R）促進(jìn)OPCs細(xì)胞分化的能力。

mAChRs藥理分型依據(jù)受體與選擇性激動(dòng)劑或拮抗劑親和力不同，將M受體分為4種亞型［14］；分子生物學(xué)分型則依據(jù)M受體的核苷酸序列差異分為5種亞型，藥理學(xué)的M1～M4分別與分子生物學(xué)的M1～M4型相對(duì)應(yīng)［15］?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，M受體均與細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的G蛋白相偶聯(lián)，而神經(jīng)遞質(zhì)通過相應(yīng)的受體與各種G蛋白偶聯(lián)，以激活相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，為實(shí)現(xiàn)各種神經(jīng)遞質(zhì)功能和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子網(wǎng)絡(luò)的相互作用提供了分子基礎(chǔ)［16］。本文研究顯示，M1～M5亞型在OPCs細(xì)胞上均有表達(dá)，且M1～M4表達(dá)較強(qiáng)，而M5表達(dá)較低，結(jié)果印證了上述論斷，可作為上述論斷的證據(jù)補(bǔ)充［17］。

氯馬斯汀為治療過敏及感冒癥狀的常用抗組胺藥，具有抗毒蕈堿作用，且能高效通過血腦屏障［18］。Green等［19］將氯馬斯汀用于治療多發(fā)性硬化（Multiple sclerosis，MS）患者且具有一定影響，然而該研究并未明確表明干預(yù)機(jī)制。也有研究發(fā)現(xiàn)，氯馬斯汀能夠改善小鼠神經(jīng)精神癥狀并在脫髓鞘模型中促進(jìn)小鼠髓鞘再生，其作用機(jī)制可能是在脫髓鞘病變中穿過血腦屏障，通過抗毒蕈堿作用促進(jìn)OPCs增殖分化為成熟OLs［20］。本研究基于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明：氯馬斯汀能夠增強(qiáng)抗毒蕈堿作用，促進(jìn)OPCs細(xì)胞分化為OLs，通過上調(diào)MBP的表達(dá)進(jìn)而修復(fù)受損髓鞘。