唐雙陽(yáng) 丁 霜 申海艷 伍虹蓉 胡 煜 廖雅琪 熊雨棱 李 樂(lè)

1（南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所 特殊病原體防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 衡陽(yáng) 421001）

2（南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 衡陽(yáng) 421001）

3（南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 衡陽(yáng) 421001）

電離輻射能通過(guò)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引發(fā)細(xì)胞損傷，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［1］。有研究報(bào)道，凋亡是放射線導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡的主要方式之一［2］，腫瘤細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性主要取決于輻射后細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷修復(fù)水平和輻射引發(fā)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，從而導(dǎo)致凋亡相關(guān)基因表達(dá)、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期進(jìn)程的改變。

人死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白（hDaxx）是一種高度保守的多功能蛋白，能使受損DNA無(wú)法修復(fù)而使細(xì)胞發(fā)生凋亡［3-4］，從而可能促進(jìn)放射治療后腫瘤細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞凋亡是由Caspase-8誘導(dǎo)的一種“細(xì)胞自殺程序”，Caspase-8不會(huì)引起組織損傷，是死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑的關(guān)鍵啟動(dòng)子。Daxx在影響細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制方面尚未完全明確。Daxx作為HIF-1a/HDAC1/Slug軸介導(dǎo)癌細(xì)胞浸潤(rùn)的抑制子，有可能成為抑制癌癥轉(zhuǎn)移的一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)［5］。

課題組前期研究表明，Daxx高表達(dá)可下調(diào)宮頸癌HeLa細(xì)胞中HPV16E6蛋白對(duì)Caspase-8的抑制作用，從而促進(jìn)凋亡［6］。本研究選用HeLa細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)研究過(guò)表達(dá)Daxx對(duì)經(jīng)γ射線照射細(xì)胞的凋亡的影響，探討Daxx與輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系及其機(jī)制，為開(kāi)辟宮頸癌放射治療新途徑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）/Daxx以及pcDNA3.1（+）-C1空載體由南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所提供；改良eagle培養(yǎng)基（DMEM）購(gòu)自Gibco公司（USA）；MTT，LipofectamineTM2000購(gòu)于Invitrogen公司（USA）；鼠抗人Daxx單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司（USA）；Hoechst33342、Caspase-8活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京Solarbio公司；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海聯(lián)科生物公司。

1.2 細(xì)胞及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

人宮頸癌HeLa細(xì)胞株由南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所提供。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期宮頸癌HeLa細(xì)胞，分別接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，次日細(xì)胞生長(zhǎng)至約75%時(shí)，將pcDNA3.1（+）/Daxx真核表達(dá)載體按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，同時(shí)設(shè)pcDNA3.1（+）-C1空載體陰性轉(zhuǎn)染組，加入含1%青霉素和1%鏈霉素的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基，5%CO2、37℃培養(yǎng)6h，然后更換成含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)轉(zhuǎn)染將HeLa細(xì)胞分為正常對(duì)照組（NC組）、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組（Mock組）與Daxx真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組（Daxx組）。

1.3 電離輻射

使用137Cs γ射線生物細(xì)胞輻照儀照射細(xì)胞，劑量率為321cGy/min，劑量分別為0Gy、2Gy、4Gy和8Gy，照后培養(yǎng)0h、6h、12h和24h觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4 Western blot檢測(cè)Daxx蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)24h后，分別給予0Gy、2Gy、4Gy、8Gy γ射線照射，12h后收獲細(xì)胞，細(xì)胞裂解，BCA法測(cè)定蛋白濃度，上樣20μg蛋白行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳。使用凝膠成像系統(tǒng)拍照掃描顯色條帶，使用ImageJ灰度掃描軟件分析光密度值，檢測(cè)Daxx蛋白表達(dá)水平。

1.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖

細(xì)胞培養(yǎng)24h后，給予4Gy γ射線照射，繼續(xù)培養(yǎng)8h后棄上清液，每孔加200μL無(wú)血清培養(yǎng)基及20μL MTT，37℃孵育4h后棄上清液，每孔加入200μL二甲基亞砜，置渦旋振蕩器上振蕩裂解10min，使藍(lán)色結(jié)晶溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定450nm吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率（PI率），檢測(cè)Daxx過(guò)表達(dá)對(duì)輻照后宮頸癌細(xì)胞增殖的影響。

1.6 ELISA檢測(cè)Caspase-8相對(duì)活性

細(xì)胞培養(yǎng)24h后，給予4Gy γ射線照射，繼續(xù)培養(yǎng)12h后，收集細(xì)胞并裂解，取上清液，經(jīng)酶標(biāo)儀測(cè)定樣品。Caspase水解底物的pNA吸光度為樣品A405減去空白對(duì)照A405。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將密度為5.0×105mL-1的細(xì)胞培養(yǎng)于含有蓋玻片的24孔培養(yǎng)皿中24h，4Gy γ射線照射，繼續(xù)培養(yǎng)6h，加入終濃度為10μg/mL的Hoechst33342，37℃孵育30min，固定封片，于熒光顯微鏡下觀察。

培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24h后，給予4Gy吸收劑量照射，照射結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)6h，離心收集細(xì)胞，按照AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)避光染色，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件完成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，采用GraphPad Prism5軟件繪圖，計(jì)量資料結(jié)果以（xˉ±s）表示，兩組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，p＜0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 輻照細(xì)胞的形態(tài)觀察

生物顯微鏡觀察經(jīng)0Gy、2Gy、4Gy和8Gy γ射線照射的宮頸癌細(xì)胞形態(tài)。輻照后6h各輻射組細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的形態(tài)異常，隨著吸收劑量增加，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，部分細(xì)胞變圓，細(xì)胞間隙加大；隨著照后時(shí)間的延長(zhǎng)，各輻射組細(xì)胞數(shù)量逐漸減少、變形、皺縮，漂浮細(xì)胞逐漸增加；其中4Gy照射組在輻照后12h，出現(xiàn)少部分細(xì)胞皺縮、變形，8Gy組在輻照后12h，已少見(jiàn)正常形態(tài)細(xì)胞，大部分細(xì)胞皺縮、變形（圖1）。

圖1 顯微鏡觀察輻照細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Morphology of irradiated cells observed by microscope

2.2 輻照細(xì)胞中Daxx的表達(dá)

收取經(jīng)0Gy、2Gy、4Gy和8Gy γ射線照射后12h的細(xì)胞，經(jīng)Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Daxx的表達(dá)水平，Daxx表達(dá)水平隨著吸收劑量增加而升高，4Gy組、8Gy組與0Gy組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05，p＜0.01）（圖2）。表明Daxx表達(dá)水平與吸收劑量相關(guān)。

圖2 輻照細(xì)胞中Daxx的表達(dá)：(a)各組的Western blot條帶圖;(b)各組的蛋白表達(dá)水平；★p＜0.05，★★p＜0.01Fig.2 Expression of Daxx protein in irradiated cells:(a)representative Western blot for protein expression;(b)densitometry analysis of protein levels;★p＜0.05,★★p＜0.01

2.3 Daxx對(duì)輻照細(xì)胞增殖的影響

MTT檢測(cè)輻照12h后細(xì)胞的增殖情況，以未輻照組為對(duì)照，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖抑制率。轉(zhuǎn)染Daxx的輻照細(xì)胞組明顯高于其對(duì)應(yīng)的未輻照組、空質(zhì)粒輻照組以及正常細(xì)胞輻照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）（圖3）。提示Daxx有利于輻照導(dǎo)致的細(xì)胞增殖抑制。

圖3 MTT檢測(cè)Daxx對(duì)輻照細(xì)胞的增殖抑制的影響；★★p＜0.01Fig.3 Proliferation inhibition of Daxx protein on irradiated cells by MTT;★★p＜0.01

2.4 Daxx對(duì)輻照細(xì)胞Caspase-8活性的影響

ELISA檢測(cè)輻照后12h各組細(xì)胞的Caspase-8相對(duì)活性。轉(zhuǎn)染Daxx的輻照組細(xì)胞的A405值明顯高于其對(duì)應(yīng)的未輻照細(xì)胞組、空質(zhì)粒輻照組以及正常細(xì)胞輻照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）（圖4）。提示Daxx能增強(qiáng)輻照細(xì)胞Caspase-8的相對(duì)活性。

2.5 Daxx對(duì)輻照細(xì)胞凋亡的影響

熒光顯微鏡觀察輻照12h后細(xì)胞的凋亡。輻照組核固縮細(xì)胞的比例高于未輻照組，其中轉(zhuǎn)染Daxx的輻照組核固縮細(xì)胞最高（圖5）。

圖5 熒光顯微鏡觀察輻照細(xì)胞凋亡形態(tài)Fig.5 Apoptotic morphology of irradiated cells observed by fluorescence microscope

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染Daxx的輻照組的細(xì)胞凋亡率明顯高于其對(duì)應(yīng)的未輻照組、空質(zhì)粒輻照組以及正常細(xì)胞輻照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）（圖6）。提示Daxx參與輻照細(xì)胞的凋亡。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Daxx對(duì)輻照細(xì)胞凋亡的影響：(a)各組的代表性流式細(xì)胞圖；(b)各組的凋亡率；★p＜0.05Fig.6 Daxx protein on apoptosis of irradiated cells detected by flow cytometry:(a)representative flow cytometry data;(b)apoptotic rate;★p＜0.05

3 討論與結(jié)論

放射治療已經(jīng)成為治療宮頸癌的主要手段之一，約80%的宮頸癌患者接受單獨(dú)或聯(lián)合的放射治療，尤其對(duì)不能手術(shù)的Ⅱ期以下或晚期宮頸癌患者，可取得較為理想的效果。Daxx在細(xì)胞中的不同表達(dá)情況有可能導(dǎo)致細(xì)胞的生長(zhǎng)與凋亡不同。有研究認(rèn)為，Daxx在胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組織病變中出現(xiàn)基因突變［7］或表達(dá)缺失［8］；在泌尿道上皮組織癌細(xì)胞中，Daxx的分布區(qū)域及其核分布區(qū)域的大小都有變化［9］；食管鱗癌組織內(nèi)Daxx的定位和表達(dá)與臨床患者的生存指數(shù)密切相關(guān)［10］。

本研究結(jié)果顯示：Daxx表達(dá)水平隨著吸收劑量增加而升高，由此推測(cè)Daxx參與細(xì)胞中輻照引發(fā)某些生物學(xué)效應(yīng)；而過(guò)表達(dá)Daxx能明顯上調(diào)輻照細(xì)胞的Caspase-8活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。有研究表明：增強(qiáng)Caspase-8與Fas-Daxx之間的相互作用能促進(jìn)細(xì)胞凋亡［11］。Caspase-8是Fas/FasL系統(tǒng)的重要效應(yīng)子。經(jīng)典的Fas誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑是Fas受體通過(guò)FADD-Caspase-8通路及其下游的Caspase家族成員而實(shí)現(xiàn)的。因?yàn)镕ADD（Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域）能夠與Caspase-8（或-10）前體蛋白結(jié)合形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC），激活Caspase-8（或-10），進(jìn)一步激活Caspase級(jí)聯(lián)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［12］，故Daxx通過(guò)與Fas受體結(jié)合，激活級(jí)聯(lián)酶，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［13］。有研究表明：在輻射條件下，γ干擾素誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶（GILT）可通過(guò)上調(diào)Daxx表達(dá)而抑制盒配對(duì)基因3，從而誘導(dǎo)自噬，增加人黑色素瘤細(xì)胞死亡［14］。Daxx對(duì)0.7Gy電離輻射誘導(dǎo)的腫瘤也具有抑制作用［4］。高表達(dá)果蠅的Daxx樣蛋白，能有效通過(guò)Daxx-ASK1-JNK途徑誘導(dǎo)凋亡，而該蛋白的缺失增強(qiáng)了對(duì)氧化應(yīng)激以及UV照射的抵抗作用［15］。然而，也有研究認(rèn)為，在卵巢癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Daxx能保護(hù)癌細(xì)胞免受X射線以及化療誘導(dǎo)的DNA損傷，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)放療與化療等的抵抗性［16］。

綜上所述，在宮頸癌HeLa細(xì)胞中，Daxx能夠促進(jìn)經(jīng)γ射線照射的細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能是在輻照細(xì)胞內(nèi)，Daxx通過(guò)正反饋Caspase-8活性，從而抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。