孔秀琴 趙雅靜 鉏曉艷 李海藍 邱建輝

1（蘭州理工大學(xué)石油化工學(xué)院 蘭州 730000）

2（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所 武漢 430064）

輻照提取主要利用60Co γ射線攜帶的能量使生物大分子發(fā)生降解，是一種節(jié)能、環(huán)保、高效的提取方法，控制好吸收劑量，可以有效提取目標(biāo)物質(zhì)［1-2］。目前，輻照輔助植物降解的研究集中于秸稈和草藥的輻照預(yù)處理中。武小芬等［3］發(fā)現(xiàn)400kGy γ射線處理能夠破壞稻草木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)，將大分子物質(zhì)降解成水溶性組分。張勇等［4］采用800kGy γ射線處理玉米秸稈，再進行糖化發(fā)酵，可有效提高乙醇轉(zhuǎn)化率至55.9%。龍金花等［1］發(fā)現(xiàn)五倍子粉末經(jīng)800kGy γ射線處理后再進行熱水提取，可提高單寧酸得率至65.13%。Song等［5］發(fā)現(xiàn)黑人參水提物經(jīng)100kGy γ射線輻照后，還原糖含量提高，對DPPH自由基、2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸 （2，2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）自 由基的清除作用顯著增強。以上方法多數(shù)利用60Co γ射線輻照預(yù)處理植物粉末，再進行溶劑提取，使用的吸收劑量較高，處理時間較長。本實驗室使用液體輻照提取法，通過低劑量（5kGy）60Co γ射線輻照三氯甲烷提取物，成功獲得花生莖葉（Arachis hypogaeaL.stems and leaves，AHSL）生物堿類物質(zhì)，并提高了提取效率［6］。

AHSL是一種優(yōu)良的中草藥［7］，目前主要用于治療各種原因引起的睡眠紊亂［8-9］、焦慮癥［10］等。Deng等［11］研究顯示，AHSL的乙酸乙酯和石油醚萃取物中富含生物堿、黃酮類及苷類物質(zhì)，能夠通過對多巴胺信號通路的6種神經(jīng)遞質(zhì)實施有效干預(yù)，進而降低小鼠自主活動能力。Zu等［12-13］研究表明，AHSL水提物中的芳樟醇、1-辛烯-3-醇等可提高大鼠大腦中的腺苷酸和三磷酸腺苷水平，通過γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）調(diào)控路徑改善失眠大鼠的睡眠行為。Cossetin等［14］研究表明，大鼠口服AHSL醇提物1000mg/kg28d以上，其血液生化參數(shù)、體重和運動協(xié)調(diào)性均無變化，認為AHSL醇提物是安全無毒的。以上研究主要集中于AHSL鎮(zhèn)靜催眠成分的提取、功效驗證及動物安全性中，關(guān)于其酚酸類物質(zhì)的提取及抗氧化作用的研究較少。酚酸屬于多酚類物質(zhì)，是分子中具有羧基和羥基的芳香族化合物［15］，不能由人和動物體自身合成，但可以多種形式存在于植物中，如AHSL含有阿魏酸等酚酸類物質(zhì)［11］，具有抗氧化、抗腫瘤、消炎殺菌等多種藥理學(xué)作用［16-17］。

本文以AHSL為原料，利用60Co γ射線輻照結(jié)合乙醇同步萃取的方法提取AHSL酚酸類物質(zhì)；采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝參數(shù)，有機溶劑法進一步萃取純化，并對獲得的AHSL酚酸的抗氧化性進行系統(tǒng)研究，為花生莖葉的高值化利用和深度開發(fā)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

AHSL，湖北省荊門市楚花花生加工專業(yè)合作社提供，取落花生根部以上枝葉部分，清洗后50℃干燥24h至恒重，粉碎并通過孔徑0.425mm的篩，即得AHSL粉末。茶多酚、無水乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、FeSO4、水楊酸、鐵氰化鉀等，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供；1，1-二 苯 基-2-三 硝 基 苯 肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%），上海源葉生物科技有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

60Co γ射線輻照源（裝源量9.435×1015Bq，放射活度1.11×1016Bq），湖北省輻照實驗中心；紫外可見光分光光度計UV-2800，尤尼柯上海儀器有限公司；冷凍干燥機LGJ-25C，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；分析天平BAS224S，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；高速離心機TGL-1601，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 吸收劑量對酚酸得率的影響

稱取10g AHSL粉末6份置于密封袋中，分別加入300mL50%乙醇，密封袋封口后送至湖北省輻照實驗中心進行輻照，吸收劑量分別設(shè)為0kGy、2kGy、4kGy、6kGy、8kGy、10kGy。輻照過后樣品抽濾濃縮，冷凍干燥后進行酚酸含量檢測，每組3個平行。樣品實際吸收劑量用重鉻酸銀劑量計（自制玻璃安瓶劑量計，其中低劑量量程含重鉻酸銀0.35mmol/L，高劑量量程含重鉻酸銀2.5mmol/L）進行標(biāo)定，劑量計常溫保存，跟隨樣品輻照后送湖北省輻照工程中心進行劑量檢測，得實際吸收劑量分別為0kGy、2.15kGy、3.62kGy、6.30kGy、8.26kGy、9.73kGy。

1.3.2 液料比對酚酸得率的影響

稱取10gAHSL粉末5份，分別加入50%無水乙醇100mL、200mL、300mL、400mL、500mL，按§1.3.1 獲得的最優(yōu)劑量進行輻照，然后抽濾并濃縮。獲得的液體冷凍干燥后進行酚酸含量檢測，并計算酚酸得率。每組設(shè)置3個平行。

1.3.3 乙醇濃度對酚酸得率的影響

稱取10g AHSL粉末6份，按§1.3.2 獲得的最優(yōu)液料比分別加入0%、20%、40%、60%、80%、100%的乙醇，按§1.3.1 獲得的最優(yōu)劑量進行輻照，然后抽濾并濃縮，獲得的液體凍干后進行酚酸含量檢測并計算酚酸得率。每組設(shè)置3個平行。

1.3.4 AHSL酚酸提取工藝優(yōu)化

與單因素試驗結(jié)果相結(jié)合，采用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計，以酚酸得率為響應(yīng)值，采用Design-Expert10.0.4 進行吸收劑量、乙醇濃度、液料比3個因素的二次響應(yīng)面模型實驗，優(yōu)化AHSL酚酸提取工藝。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table1 Factors and levels of response surface analysis

1.3.5 AHSL酚酸的純化

采用氯仿和乙酸乙酯對輻照后乙醇提取物中的AHSL酚酸進行萃取純化。方法1：用乙酸乙酯萃取，再用等體積氯仿萃取乙酸乙酯相，取上層液旋蒸后凍干得到萃取物，記為EC。方法2：用氯仿萃取，再用等體積乙酸乙酯萃取氯仿相，取上層液旋蒸后凍干得到萃取物，記為CE。進行酚酸含量測定，比較酚酸含量較高的方法，進行萃取次數(shù)對酚酸含量的影響實驗，獲得物濃縮凍干后即為AHSL酚酸。殘余物濃縮凍干后備用，響應(yīng)面優(yōu)化工藝后的乙醇提取物（Ethanol extracts）設(shè)為對照組，記為EE。

1.3.6 AHSL酚酸抗氧化性研究

準(zhǔn)確稱取0.2g EE、AHSL酚酸和殘余物粉末，用蒸餾水定容至100mL，得到濃度為2mg/mL的溶液，分別吸取0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、3.5mL、5.0mL、7.5mL溶液，定容至50mL，得濃度依次為20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、100μg/mL、140μg/mL、200μg/mL、250μg/mL和300μg/mL的樣品，測定不同濃度樣品對DPPH自由基、羥基自由基的清除能力及其鐵離子還原力。配制等濃度的茶多酚溶液為對照。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 AHSL酚酸得率及含量測定

取沒食子酸對照品溶液2μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、8μg/mL各1mL，加無水乙醇，再加0.3%十二烷基硫酸鈉溶液、0.6%三氯化鐵和0.9%鐵氰化鉀（1∶0.9）混合溶液，混勻，在暗處放置5min，用0.1mol/L鹽酸溶液定容至25mL，以顯色劑為空白，在736nm處測定吸光度［18］，得 到 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線y=106.3x+0.0283（R2=0.9999）。取1mL樣品，按上述方法進行吸光度檢測，按式（1）計算AHSL酚酸得率Y（%），按式（2）計算酚酸在萃取物中的質(zhì)量濃度（cm，μg/mL）。

式中：c0為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的樣品濃度，μg/mL；v0為樣品體積，mL；m0為AHSL樣品質(zhì)量，mg。

式中：c為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的樣品濃度，μg/mL；n為樣品稀釋倍數(shù)。

1.4.2 AHSL酚酸對羥基自由基的清除作用

在試管中依次加入1.8mmol/L FeSO4溶液1mL、1.8mmol/L水楊酸-乙醇溶液1mL、樣品液1mL和0.03%H2O2溶液1mL，在37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30min后，以蒸餾水為參比，在510nm下測定樣品吸光度值，按式（3）計算AHSL酚酸對羥基自由基的清除率K1（%）。

式中：A0為樣品液換為蒸餾水后的吸光度值；Ax為加入樣品液的吸光度值；Ax0為H2O2溶液換為蒸餾水后的吸光度值。

1.4.3 AHSL酚酸對DPPH自由基的清除作用

根據(jù)參考文獻方法［19］，在試管中依次加入3.5mL6.5×10-5mol/L DPPH溶液和0.5mL樣品液，混合搖勻，在室溫下反應(yīng)20min，以3.5mL無水乙醇加上0.5mL60%乙醇調(diào)零，在517nm處測定樣品吸光值，按式（4）計算AHSL酚酸對DPPH自由基的清除率K2（%）。

式中：A0為將樣品液換為60%乙醇的吸光度值；As為加入樣品液的吸光度值；Ar為DPPH自由基換為無水乙醇的吸光度值。

1.4.4 AHSL酚酸還原能力測定

在試管中分別加入適量的樣品液、pH為6.6的磷酸鹽緩沖溶液以及1%的鐵氰化鉀溶液，混合搖勻后，在50℃恒溫水浴鍋中水浴30min，冷卻至室溫，加入10%三氯乙酸溶液，混合搖勻，4000r/min離心10min，移取上清液至另一試管中，加入蒸餾水和0.1%的三氯化鐵溶液，搖勻后在室溫下靜置10min，在700nm處測吸光度值，以不加樣品液為參比［20］。

1.5 數(shù)據(jù)處理

運用Microsoft Excel2007和OriginPro8.5對實驗數(shù)據(jù)進行處理和繪圖，各數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。運用Design-Expert10.0.4 軟件進行響應(yīng)面多元回歸擬合和方差分析，運用SPSS20.0軟件中單因素ANOVA程序進行統(tǒng)計學(xué)分析，p＜0.05，即為統(tǒng)計學(xué)差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸收劑量、乙醇濃度和液料比對酚酸得率的影響

由圖1（a）和（b）可知，隨著吸收劑量和乙醇濃度的增加，酚酸得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，乙醇濃度為60%時，AHSL酚酸得率顯著高于其他各組（p＜0.05）。當(dāng)吸收劑量為6kGy時，酚酸得率達到（2.09±0.03）%，顯著高于對照組（p＜0.05）。原因可能為γ射線作用于溶劑體系（乙醇和水）產(chǎn)生了大量·OH、·H等自由基，自由基攻擊大分子物質(zhì)促進其氧化或者降解［6，21］，使得植物細胞中酚酸類物質(zhì)溶出；吸收劑量過大，酚酸類物質(zhì)的羧基和羥基在自由基氧化作用下轉(zhuǎn)化成醛或酮，導(dǎo)致AHSL酚酸得率下降。由圖1（c）可知，酚酸得率隨液料比而升高。當(dāng)液料比為30∶1（mL∶g）時，AHSL酚酸得率最高，此后無法再顯著增加，這可能與單位質(zhì)量AHSL中該類酚酸含量的極限值有關(guān)。

圖1 不同吸收劑量（a）、乙醇濃度（b）和液料比（c）下的AHSL酚酸得率（不同小寫字母代表組間差異達顯著水平p＜0.05）Fig.1 Yields of AHSL phenolic acid under different absorbed doses(a),ethanol concentrations(b),and ratios of ethanol to AHSL(c)(The different lower-case letters mean significant at p＜0.05)

2.2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及方差分析

響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果如表2所示。通過多元回歸擬合分析得出吸收劑量（A）、乙醇濃度（B）和液料比（C）對AHSL酚酸得率（Y）的影響。用二次多項回歸方程表示為Y=2.16＋0.11A＋0.054B-0.016C＋0.13AB＋0.050AC-0.087BC-0.29A2-0.13B2-0.075C2。方差分析結(jié)果見表3，其中響應(yīng)面回歸模型p＜0.01，表明該模型具有顯著性。R2=0.9474，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.8798，說明該模型能解釋87.98%響應(yīng)值的變化。根據(jù)p值，對AHSL酚酸得率具有顯著性影響的因素有吸收劑量、乙醇濃度及兩者的交互因素。

表2 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果Table2 Experimental design and results of response surface analysis

表3 方差分析結(jié)果Table3 Results of ANOVA

2.3 雙因素交互作用分析

圖2表示因素兩兩交互作用對酚酸得率的影響。總體而言，隨因素值的增加，酚酸得率呈先上升后下降的趨勢。從響應(yīng)面圖的陡峭程度和等高線密度可直觀反映出兩因素交互作用的強弱［22-23］，圖2中，吸收劑量與乙醇濃度的曲面比較陡峭，交互作用對酚酸得率的影響較強（p=0.0091＜0.01）；乙醇濃度與液料比曲面比較平緩，等高線密度較低，兩者交互作用對酚酸得率的影響不顯著（p=0.0538）。此外，根據(jù)等高線圖，沿著吸收劑量移動的等高線密度，明顯高于沿著乙醇濃度或者液料比移動的等高線密度，說明吸收劑量對響應(yīng)值的影響最為顯著，這與數(shù)據(jù)結(jié)果一致（p=0.0001＜0.01）。

圖2 吸收劑量與乙醇濃度(a)，(b)；吸收劑量與料液比(c)，(d)；乙醇濃度與料液比(e)，(f)對酚酸得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2 Response surface map and contour map of the effects between absorbed dose and ethanol concentration(a),(b);absorbed dose and ethanol∶AHSL(c),(d);and ethanol concentration and ethanol∶AHSL(e),(f)on the yield of phenolic acid

通過響應(yīng)面實驗分析預(yù)測酚酸提取的最優(yōu)參數(shù)：吸收劑量6.57kGy，乙醇濃度69.39%，液料比26.43∶1（mL∶g），在此條件下AHSL酚酸得率可達2.23%，高于生木瓜的1.58%［18］。為方便實際操作，將提取條件進行修正，分別為實測吸收劑量6.70kGy，乙醇濃度70%，液料比27∶1（mL∶g），以此條件進行提取得到的AHSL酚酸得率為（2.25±0.11）%，與理論預(yù)測值僅相差0.9%。

2.4 萃取方式對酚酸含量的影響

根據(jù)圖3，酚酸含量隨著乙酸乙酯萃取次數(shù)的增加而顯著增加（p＜0.05），CE3中的酚酸含量可達到（85.19±8.54）μg/mL，是對照組（EE組）的1.80倍。AHSL中含有較多的甾醇類物質(zhì)［24］，而氯仿對甾醇有較好的萃取作用［25］。因此先用氯仿萃取出大部分甾醇，再用乙酸乙酯萃取可得到較高的酚酸類物質(zhì)。

圖3 不同萃取方式下的酚酸含量（不同小寫字母代表組間差異達顯著水平p＜0.05）Fig.3 Concentration of phenolic acid obtained from different extraction methods(The different lower-case letters means significant at p＜0.05)

2.5 AHSL酚酸抗氧化效果

由圖4可知，對自由基的清除作用和對鐵離子的總還原力由大到小均為AHSL酚酸、乙醇提取物EE和殘余物。隨著添加物濃度的升高，AHSL酚酸對兩種自由基的清除作用逐漸增強，當(dāng)濃度為100μg/mL時，可以清除50%以上的DPPH自由基和羥基自由基。與其他植物提取物相比，AHSL酚酸對DPPH自由基的清除率高于艾葉精油和艾葉乙醇提取物［26］，對羥基自由基的清除率高于山茱萸葉提取物［27］，且AHSL酚酸對由H2O2/Fe2+體系反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基的清除作用與同濃度的茶多酚無顯著性差異（p＞0.05）。在總還原力方面（圖4（c）），隨著添加物濃度的升高，各組對鐵離子的還原作用逐漸增強，而殘余物對鐵離子基本無還原能力。酚酸類化合物主要分為C6-C1型和C6-C3型，化學(xué)結(jié)構(gòu)上均含有苯環(huán)和酚羥基［28］，其分子中氫原子供體的脫氫能力、電子給體的自由基淬滅能力對其抗氧化活性有很大影響［29］。根據(jù)本文研究結(jié)果，AHSL酚酸除了文獻報道的阿魏酸［11］外，還含有較多的沒食子酸。有研究表明，沒食子酸C1位和阿魏酸C2位O-H鍵的解離焓較低，OH鍵斷裂釋放的氫易與活潑基團或自由基發(fā)生反應(yīng)［30-31］。此外，該兩種酚酸分子中電子轉(zhuǎn)移的電離勢較低，可提供多余電子直接淬滅自由基和加速鐵離子還原反應(yīng)［16，32］。因此AHSL酚酸表現(xiàn)出較強的抗氧化能力。

圖4 AHSL酚酸對DPPH自由基（a）、羥基自由基（b）和總還原力（c）的影響Fig.4 Effects of AHSL phenolic acid on DPPH free radicals(a),hydroxyl radicals(b),and ferric reducing power(c)

AHSL富含的酚酸類物質(zhì)具有抗菌、抗癌、抗炎等保健作用［28］，對進行高效提取可增加其作為藥物開發(fā)的潛力，并促進我國AHSL等農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物資源的可持續(xù)利用。60Co γ輻照技術(shù)，利用γ射線攜帶的大量能量可使植物大分子發(fā)生電離效應(yīng)［5］，加速植物細胞中目標(biāo)活性物質(zhì)的溶出與提取［1-2，6］。本文采用60Co γ輻照結(jié)合有機溶劑的方法提取AHSL酚酸，與傳統(tǒng)浸漬法、滲漉法、熱回流提取法等［33］相比，具有能耗低、時間短、處理高效等優(yōu)點，有利于工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)，應(yīng)用前景廣闊。

3 結(jié)論

經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化，AHSL酚酸提取的最佳工藝參數(shù)為吸收劑量6.70kGy，乙醇濃度70%，液料比27∶1（mL∶g），在此條件下，AHSL酚酸得率可達（2.25±0.11）%。工藝條件中，吸收劑量對AHSL酚酸得率的影響最為顯著（p=0.0001＜0.01）。氯仿和乙酸乙酯可以很好地萃取純化AHSL酚酸，含量可達萃取前的1.80倍。AHSL酚酸的抗氧化性顯著高于乙醇提取物和殘余物，對羥基自由基的清除作用與同濃度的茶多酚無顯著性差異；AHSL酚酸濃度為100μg/mL時，可以清除50%以上的DPPH自由基和羥基自由基。該提取和純化工藝可為花生莖葉的進一步開發(fā)利用提供新的思路。