賈 璐 ,徐幸杰 ,樊慧杰 ,王 青 ,李彥青 ,杭 薇 ,王惠潔 ,郭敏芳 ,肖保國 ,柴 智 ,馬存根 ,
(1.山西中醫(yī)藥大學(xué)多發(fā)性硬化益氣活血重點研究室神經(jīng)生物學(xué)研究中心,山西晉中030619;2.山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所,山西大同037009; 3.復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所,上海200025)
帕金森?。≒D)是一種在中老年人群中發(fā)病率僅次于阿爾茲海默病的神經(jīng)退行性疾病,該病的臨床表現(xiàn)除運(yùn)動功能障礙外,還常伴有消化功能紊亂[1]。在 PD 患者和 PD 模型小鼠體內(nèi),不僅存在中腦黑質(zhì)的典型病變,也檢測到腸道氧化應(yīng)激、炎癥增強(qiáng)、腸黏膜屏障功能受損等異常的生理現(xiàn)象[2-4]。五味子乙素(Schisandrin B,Sch B)是五味子的一種重要成分,在多種疾病模型中被證實具有神經(jīng)保護(hù)作用[5-7]。但Sch B 能否將腸道作為靶標(biāo)保護(hù)PD 小鼠仍是未知。因此,本研究擬建立1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)誘導(dǎo)的PD 小鼠模型,通過檢測小鼠的行為學(xué)改變及結(jié)腸氧化應(yīng)激指標(biāo)和結(jié)腸上皮屏障功能相關(guān)蛋白變化,聚焦腸道來探究Sch B 對PD 小鼠的治療效果及潛在機(jī)制。
1.1.1 實驗動物 30 只體質(zhì)量為20~25 g 的雄性C57BL/6 小鼠(8~10 周齡)購自北京維通利華實驗動物有限公司,許可證號:SCXK(京)2016-0006。動物在溫度、濕度適宜的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行實驗。
1.1.2 試劑與儀器 Sch B 購自成都曼斯特生物科技有限公司;MPTP 購于美國 Sigma 公司;丙二醛(Malonaldehyde,MDA)和谷胱甘肽(Glutathione,GSH)試劑盒購于南京建成生物工程研究所;ZO-1(ab276131)抗體購自英國 Abcam 公司;Occludin(27260-1-AP)抗體購自美國 Proteintech 公司;βactin(AP0060)抗體購自美國 Bioworld 公司;HRP羊抗兔IgG(BA1054)購自武漢博士德生物工程有限公司。多功能酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices 公司,凝膠成像儀購自上海天能科技有限公司。
1.2.1 分組與造模 將小鼠隨機(jī)分為正常組(Normal group)、模型組(Model group)和 Sch B(Sch B group)治療組,每組10 只。模型組與Sch B 組每日腹腔注射MPTP 1 次,共7 d(第1 天注射劑量為25 mg/kg,第 2 天注射劑量為 20 mg/kg,第 3~7 天注射劑量為 30 mg/kg),正常組腹腔注射等量生理鹽水[8]。
1.2.2 給藥 將Sch B 溶于0.5 %羧甲基纖維素鈉,自造模第1 天起,Sch B 組小鼠每日按照80 mk/kg 劑量予以 Sch B 灌胃(0.2 mL),正常組和模型組給予等體積羧甲基纖維素鈉灌胃,給藥共持續(xù)2 周。
1.2.3 懸掛實驗 將小鼠雙前爪置于直徑約為2 mm 的水平電線之上,使小鼠處于懸掛狀態(tài)。若小鼠雙后爪均能抓住電線記為3 分,若小鼠僅有一只后爪能抓住電線記為2 分,若小鼠雙后爪均無法抓握電線則記為 1 分[9]。
1.2.4 取材與氧化因子檢測 腹腔注射0.2 %水合氯醛麻醉小鼠,迅速取出結(jié)腸組織,稱重后按照質(zhì)量∶體積=1∶9 加入0.9%生理鹽水,在冰上用組織勻漿器充分研磨,3000 rpm 離心15 min 取上清,按照試劑盒說明書步驟,采用比色法測定各組小鼠結(jié)腸組織上清中MDA 和GSH 含量。
1.2.5 Western blot 檢測 ZO-1 與 Occludin 表達(dá)結(jié)腸組織稱重,按照質(zhì)量∶體積=1∶9 加入RIPA 裂解液,利用組織勻漿器在冰上提取結(jié)腸蛋白,BCA法測定蛋白濃度。各組結(jié)腸蛋白經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳分離后濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜,5%脫脂奶室溫封閉 1 h,ZO-1、Occludin 和 β-actin 一抗 4 ℃孵育過夜。次日用PBS 洗膜3 次后,室溫孵育二抗2 h,化學(xué)發(fā)光液顯影,用Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析。
采用GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較使用Turkey-t 檢驗,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
與正常組比較,模型組小鼠肌僵直嚴(yán)重、震顫明顯,懸掛評分顯著下降(P<0.001),符合 PD 的典型臨床特征。經(jīng)Sch B 治療后,小鼠的懸掛評分明顯提高(P<0.01),見圖 1。表明 Sch B 能夠改善PD 小鼠的運(yùn)動協(xié)調(diào)性,緩解運(yùn)動功能障礙。
圖1 各組小鼠懸掛評分比較
與正常組比較,模型組小鼠結(jié)腸組織中MDA含量升高(P<0.05),GSH 水平下降(P<0.01);與模型組比較,Sch B 組小鼠結(jié)腸組織中MDA 含量下降(P<0.01),GSH 水平上升(P<0.05),見圖 2。表明Sch B 可緩解PD 小鼠結(jié)腸的氧化應(yīng)激損傷。
圖2 各組小鼠結(jié)腸組織中MDA、GSH 水平比較
與正常組比較,模型組小鼠結(jié)腸組織中ZO-1、Occludin 的表達(dá)均顯著降低(P<0.001,P<0.01);與模型組比較,Sch B 組小鼠結(jié)腸組織中ZO-1、Occludin 的表達(dá)均顯著升高(P<0.01,P<0.05),見圖3。表明Sch B 能夠在一定程度上緩解PD 小鼠結(jié)腸組織ZO-1 和Occludin 的丟失。
圖3 各組小鼠結(jié)腸組織中ZO-1 和Occludin 蛋白表達(dá)量比較
Sch B 是從中藥五味子中分離出的一種有效成分,在抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗焦慮等方面都起著至關(guān)重要的作用。研究表明,Sch B 可以增強(qiáng)細(xì)胞中超氧化物歧化酶活性,提高GSH 抗氧化系統(tǒng)水平,激活谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽還原酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性,并抑制脂質(zhì)過氧化,減少乳酸脫氫酶和MDA 釋放,從而發(fā)揮抗氧化作用[10]。近來 Wu Ying 等[11]報道,在急性氧化應(yīng)激造成的神經(jīng)損傷疾病模型中,Sch B 能夠通過靶定Nrf2 通路減少活性氧類(Reactive oxygen species,ROS)和 MDA 產(chǎn)生,同時上調(diào) GSH 水平,從而提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的抗氧化能力。此外,Sch B 對阿爾茲海默病模型小鼠的預(yù)防保護(hù)作用也與其激活Nrf2 信號通路提高抗氧化酶活性有關(guān)[7]。在抑郁癥和 2 型糖尿病模型中,Sch B 均能夠上調(diào)大鼠體內(nèi)超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性,并減少 MDA 產(chǎn)生,從而緩解疾?。?,12]。因此,作為一種低毒性、低成本的天然非酶抗氧化劑,Sch B 具有廣泛的應(yīng)用前景。
PD 是一種以運(yùn)動功能障礙為主要特征的神經(jīng)退行性疾病。MPTP 是一種常用于PD 造模的神經(jīng)毒素,MPTP 作為一種高度親脂的分子,很容易穿過血腦屏障,然后由星形膠質(zhì)細(xì)胞中的單胺氧化酶 B 轉(zhuǎn)化為 1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+),MPP+通過多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入多巴胺能神經(jīng)元,抑制線粒體電子轉(zhuǎn)運(yùn)鏈的復(fù)合物I,阻止三磷酸腺苷(ATP)合成,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[13]。鑒于 MPTP 能夠選擇性并快速地破壞黑質(zhì)紋狀體中的多巴胺能神經(jīng)元,復(fù)制出與PD 相關(guān)的功能缺陷,它已被廣泛運(yùn)用于各種模型動物的PD 模型制備。在本項研究中,我們采用MPTP 連續(xù)7 d 腹腔注射制造PD 小鼠模型,造模后第14 天,通過懸掛實驗檢測小鼠行為學(xué)改變。我們觀察到模型組小鼠肌僵直、震顫明顯,后爪的抓握能力明顯比正常組差,懸掛得分與正常組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,提示造模成功,使小鼠出現(xiàn)了PD 的典型臨床癥狀——運(yùn)動功能障礙。經(jīng)過2 周Sch B 灌胃治療后,小鼠的肌僵直和震顫有所緩解,后爪的抓握能力明顯優(yōu)于模型組,表明Sch B 能夠有效改善PD 小鼠的運(yùn)動功能。
目前,關(guān)于PD 的發(fā)病機(jī)制尚無準(zhǔn)確定論。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,PD 的發(fā)生是環(huán)境因素、氧化應(yīng)激、炎癥等共同作用的結(jié)果。腸道功能紊亂是PD 重要的非運(yùn)動性癥狀,臨床數(shù)據(jù)顯示,80%的PD 患者都伴有便秘現(xiàn)象[14],PD 腸道病理生理癥狀的出現(xiàn)甚至早于運(yùn)動功能障礙,因此有學(xué)者認(rèn)為PD 的發(fā)生與腸道密切相關(guān),甚至PD 的起病就在于腸道[15-16]。來自早期PD 患者的數(shù)據(jù)表明,氧化應(yīng)激水平的升高是PD 初始階段的一個重要特征,發(fā)生在明顯的神經(jīng)元丟失之前[17]。研究發(fā)現(xiàn),過度氧化不僅多發(fā)生于PD 患者和PD 模型動物腦內(nèi),也存在于腸道[18-19]。在本實驗中,我們檢測到模型組小鼠結(jié)腸組織中GSH 和MDA 這兩個氧化應(yīng)激重要指標(biāo)的水平均發(fā)生了顯著變化。GSH 是機(jī)體氧化防御體系的一個重要成員,模型組小鼠結(jié)腸組織中GSH 水平的下降表明PD 小鼠腸道的抗氧化能力有所減弱,MDA 含量增加則反映腸道出現(xiàn)了過度的脂質(zhì)過氧化,二者共同說明MPTP 誘導(dǎo)的PD 小鼠結(jié)腸確實發(fā)生了氧化應(yīng)激,這與之前的報道一致[20-21]。經(jīng) Sch B 干預(yù)后,PD 小鼠結(jié)腸中 GSH水平有所增加,MDA 含量顯著降低,表明Sch B能夠通過靶定PD 小鼠結(jié)腸發(fā)揮抗氧化作用,減輕結(jié)腸的氧化損傷。
越來越多的研究表明,腸上皮屏障損傷在PD的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色[3,22]。腸上皮屏障是腸上皮細(xì)胞在血液循環(huán)和腸腔內(nèi)容物之間形成的調(diào)節(jié)性屏障,其通透性包括旁細(xì)胞途徑和跨細(xì)胞途徑[23]。上皮緊密連接是腸上皮屏障最重要的結(jié)構(gòu)之一,它將腸細(xì)胞緊密連接在一起,維持腸上皮屏障的旁細(xì)胞通透性[24]。研究發(fā)現(xiàn),PD 患者腸道通透性增加,且腸道中Occludin 的表達(dá)顯著減少[24-26]。Occludin 是一種典型的緊密連接蛋白,它可以通過與ZO-1 相互作用連接到肌動蛋白細(xì)胞骨架上,從而促進(jìn)緊密連接裝配,并維持其功能和完整性[27]。在本實驗中我們觀察到模型組小鼠結(jié)腸組織中ZO-1 和Occludin 表達(dá)下降,提示MPTP能夠損傷小鼠的腸上皮屏障,這一現(xiàn)象與其他團(tuán)隊的研究結(jié)果相一致[28]。與模型組比較,Sch B 組小鼠結(jié)腸中ZO-1 和Occludin 蛋白水平明顯升高,表明Sch B 能夠作用于緊密連接,從而對MPTP 誘導(dǎo)的PD 小鼠結(jié)腸屏障起到保護(hù)作用。
綜上所述,我們的研究證實Sch B 能夠改善PD 小鼠的運(yùn)動功能,這可能與其緩解結(jié)腸氧化應(yīng)激損傷及保護(hù)結(jié)腸屏障功能有關(guān),但其中涉及的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。