周鋒盛，張 雨，丁 炎，朱曉巍，秦 安，鄒 健，常艷華，吳鵬西*

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院超聲科，2內(nèi)分泌科，3甲乳外科，4中心實驗室，5病理科，江蘇 無錫 214023

甲狀腺癌是常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年增長的趨勢。其中最常見的病理類型是甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）［1］。超聲引導(dǎo)下甲狀腺結(jié)節(jié)細針穿刺（fine?needle aspiration，F(xiàn)NA）細胞學(xué)檢查是術(shù)前診斷甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性最可靠和最有效的方法，對于甲狀腺結(jié)節(jié)的術(shù)前診斷有一定價值［2］。但也有研究報道［3］，對于直徑≤5 mm的甲狀腺結(jié)節(jié)，由于FNA穿刺樣本的質(zhì)量不佳，給細胞學(xué)診斷帶來了一定困難。因此臨床上對于直徑≤5 mm高度可疑結(jié)節(jié)的處理多采取保守治療。但對于一些位于特殊部位或甲狀腺內(nèi)多灶性的結(jié)節(jié)而言，極易發(fā)生外侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［4-5］，因此盲目保守治療會錯過治愈疾病的最佳時機，也會影響手術(shù)方案的制定。而PTC的侵襲性與多基因突變相關(guān)，其中BRAFV600E基因突變最常見［6］。有研究報道FNA 細胞學(xué)檢查聯(lián)合BRAFV600E基因突變可以明顯提高對甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性診斷的準(zhǔn)確性。因此本研究旨在對美國放射學(xué)會（American College of Radiology，ACR）［7］甲狀腺超聲影像數(shù)據(jù)報告系統(tǒng)（TI?RADS）中評分為5 的甲狀腺微小結(jié)節(jié)進行FNA及BRAFV600E基因檢測，評估其對直徑≤5 mm的良惡性微小甲狀腺結(jié)節(jié)的術(shù)前診斷價值及意義。

1 對象和方法

1.1 對象

2018 年7 月—2019 年12 月在南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院行甲狀腺切除術(shù)，并且術(shù)前在超聲引導(dǎo)下對直徑≤5 mm 的微小甲狀腺結(jié)節(jié)行FNA 的患者75 例，共96 枚結(jié)節(jié)。其中，女48 例，男27 例，年齡（48±12）歲（24～71歲）。納入研究的標(biāo)準(zhǔn)為：①根據(jù)ACR TI?RADS 分類標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)前行常規(guī)超聲檢查，甲狀腺結(jié)節(jié)評分為TI?RADS 5；②甲狀腺結(jié)節(jié)的最大直徑≤5 mm；③甲狀腺引流區(qū)域存在明顯異常的淋巴結(jié)；④無FNA手術(shù)禁忌證。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者知情同意。

儀器采用飛利浦IU?22和GE LOGIQ E8超聲診斷儀，高頻線陣探頭，探頭頻率分為5～12 MHz、3～12 MHz。穿刺針采用BD醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)的23 G、0.6×32.0 mm 針頭；意大利GALLINI 公司生產(chǎn)的23 G活檢針；KDL集團生產(chǎn)的25 G無菌牙科注射針。BRAFV600E基因檢測試劑采用廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司的人類BRAF基因V600E突變熒光PCR檢測試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 超聲檢查

患者取仰臥位，頸部墊高，使頭稍向后仰，充分暴露頸部。由甲狀腺結(jié)節(jié)超聲診斷5年以上高年資醫(yī)師對其進行檢查，掃查甲狀腺左右葉、峽部及頸部淋巴結(jié)。嚴(yán)格根據(jù)ACR TI?RADS 指南中的分類標(biāo)準(zhǔn)（結(jié)節(jié)的成分、內(nèi)部回聲、縱橫比、邊緣、鈣化的有無及類型），對直徑≤5 mm 甲狀腺微小結(jié)節(jié)進行評分和TI?RADS 分類。其中直徑≤5 mm 并且評分≥7 分（TI?RADS 5）的甲狀腺結(jié)節(jié)納入本研究。

1.2.2 FNA

所有患者在行FNA前，完善凝血功能檢查并簽署知情同意書。醫(yī)生坐于患者頭側(cè)，患者取仰臥位，頸部稍墊高，使頭稍向后仰，充分暴露頸部。本研究中所有結(jié)節(jié)的穿刺均由10 年以上超聲引導(dǎo)下徒手穿刺經(jīng)驗的高年資醫(yī)生完成。穿刺前首先對甲狀腺結(jié)節(jié)進行常規(guī)超聲掃查，選取合適的進針路徑和角度。然后常規(guī)消毒、鋪巾，探頭套無菌護套，一手持探頭，一手持連接注射器的細針，使用平面內(nèi)穿刺的方法，小角度進針，沿預(yù)設(shè)路線進針至結(jié)節(jié)內(nèi)，穿刺過程中穿刺針貫穿結(jié)節(jié)，保持針芯內(nèi)零壓或負壓的狀態(tài)，對結(jié)節(jié)進行多點位的多次抽吸和提插，每個結(jié)節(jié)至少進行3次細針穿刺操作，當(dāng)穿刺針尖清晰到達結(jié)節(jié)內(nèi)部時，由助手進行規(guī)范存圖留證。取材結(jié)束后快速拔針，將穿刺物用5 mL針筒噴于載玻片上，之后迅速均勻涂片，放于無水乙醇中固定送檢細胞學(xué)檢查。FNA細胞病理診斷結(jié)果參照甲狀腺細胞病理學(xué)Bethesda分類法（the bethesda sys?tem for reporting thyroid cytopathology，TBSRTC）［8］：Ⅰ級為細胞成分不足或無法明確診斷；Ⅱ級為良性病變；Ⅲ級為濾泡性病變或意義不明確的細胞異型性；Ⅳ級為濾泡性腫瘤或可疑濾泡性腫瘤；Ⅴ級為可疑甲狀腺癌；Ⅵ級為甲狀腺癌。將≥Ⅵ級視為細胞學(xué)陽性，Ⅰ級和Ⅲ級視為細胞學(xué)無法診斷，Ⅱ級視為細胞學(xué)陰性。

1.2.3 BRAFV600E基因檢測

標(biāo)本來源于FNA，檢測試劑盒由廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)，嚴(yán)格按照說明書進行檢測。取患者每次FNA后的沖洗液，其中的DNA信息利用DNA提取試劑盒進行獲取，然后通過熒光定量PCR法得到突變信號或內(nèi)控信號的CT值，最后根據(jù)CT值的大小來判斷甲狀腺結(jié)節(jié)是否發(fā)生了基因突變。若得到的CT值≥28，則判定為陰性，若得到的CT值<28，則判定為陽性。

1.2.4 FNA聯(lián)合BRAFV600E基因檢測

FNA 聯(lián)合BRAFV600E基因突變檢測中細胞學(xué)或基因檢測其一陽性則視為陽性結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，并采用t檢驗；組間計數(shù)資料的比較采用配對χ2檢驗，并分別計算FNA細胞學(xué)檢查、BRAFV600E基因突變檢測以及FNA細胞學(xué)檢查聯(lián)合BRAFV600E基因突變檢測判斷直徑≤5 mm并且評分為TI?RADS 5的甲狀腺微小結(jié)節(jié)性質(zhì)的敏感性、準(zhǔn)確性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值。以術(shù)后病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，靈敏度為縱坐標(biāo)，1-特異度為橫坐標(biāo)，構(gòu)建受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，ROC曲線分析采用非參數(shù)Mann?Whieney 統(tǒng)計，并計算曲線下面積（area under curve，AUC）。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

本組96 枚結(jié)節(jié)術(shù)前全部進行了FNA 細胞學(xué)檢查和BRAFV600E基因突變檢測，并且取得術(shù)后病理結(jié)果。本組96枚結(jié)節(jié)中良性結(jié)節(jié)36枚（結(jié)節(jié)性甲狀腺腫20枚，甲狀腺腺瘤11枚，橋本氏甲狀腺炎5枚）；惡性結(jié)節(jié)60 枚，均為甲狀腺微小乳頭狀癌（papillary thyroid microcarcinoma，PTMC）。96 枚結(jié)節(jié)中，F(xiàn)NA細胞學(xué)檢查陽性結(jié)節(jié)共計30枚，最終得到病理證實為惡性的結(jié)節(jié)27枚（27/30）；FNA細胞學(xué)檢查陰性結(jié)節(jié)共計43枚，最終得到病理證實為惡性的結(jié)節(jié)19枚（19/43）；FNA細胞學(xué)檢查無法確定良惡性結(jié)節(jié)共計23 枚，最終得到病理證實為惡性的結(jié)節(jié)14 枚（14/23）。BRAFV600E基因突變檢測陽性結(jié)節(jié)40 枚，最終病理證實為惡性的結(jié)節(jié)40 枚（40/40）；BRAFV600E基因突變檢測陰性結(jié)節(jié)56枚，最終病理證實為惡性的結(jié)節(jié)20枚（20/56）。FNA 聯(lián)合BRAFV600E基因突變檢測診斷陽性結(jié)節(jié)60枚，最終病理證實為惡性的結(jié)節(jié)57 枚（57/60）；FNA 聯(lián)合BRAFV600E基因突變檢測陰性結(jié)節(jié)36 枚，最終病理證實為惡性的結(jié)節(jié)3 枚（3/36）（表1）。

表1 甲狀腺內(nèi)直徑≤5 mm并且評分為TI?RADS 5的甲狀腺微小結(jié)節(jié)FNA細胞學(xué)檢查、BRAFV600E基因檢測與臨床病理結(jié)果對照 （n）

除無法診斷結(jié)節(jié)外，F(xiàn)NA 細胞學(xué)檢查判斷直徑≤5 mm并且評分為TI?RADS 5的甲狀腺微小結(jié)節(jié)性質(zhì)的敏感性、準(zhǔn)確性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為58.6%、69.9%、88.9%、90.0%、55.8%（表2），AUC為0.738。BRAFV600E基因突變檢測判斷直徑≤5 mm并且評分為TI?RADS 5的甲狀腺微小結(jié)節(jié)性質(zhì)的敏感性、準(zhǔn)確性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為66.7%、79.2%、100.0%、100.0%、64.3%，ROC 曲線下面積為0.833。FNA 細胞學(xué)檢查聯(lián)合BRAFV600E基因突變檢測判斷直徑≤5 mm 并且評分為TI?RADS 5 的甲狀腺微小結(jié)節(jié)性質(zhì)的敏感性、準(zhǔn)確性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為95.0%、93.8%、91.7%、95.0%、91.7%，AUC 為0.933（圖1）。運用χ2檢驗，F(xiàn)NA 細胞學(xué)檢查聯(lián)合BRAFV600E基因突變檢測的敏感性、準(zhǔn)確性和AUC均高于單獨應(yīng)用FNA細胞學(xué)檢查或單獨應(yīng)用BRAFV600E基因突變檢測，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 FNA聯(lián)合BRAFV600E基因突變檢測判斷直徑≤5 mm并且評分為TI?RADS 5的甲狀腺微小結(jié)節(jié)的ROC曲線

表2 FNA 細胞學(xué)檢查、BRAFV600E基因突變檢測及兩者聯(lián)合的診斷效能比較 （%）

在96枚甲狀腺微小結(jié)節(jié)中，貼近甲狀腺包膜的微小結(jié)節(jié)共計19枚，其中惡性結(jié)節(jié)15枚，F(xiàn)NA細胞學(xué)檢查聯(lián)合BRAFV600E基因突變檢測預(yù)測貼近甲狀腺包膜微小結(jié)節(jié)良惡性的準(zhǔn)確性為89.5%；位于甲狀腺峽部的微小結(jié)節(jié)共計12枚，其中惡性結(jié)節(jié)11枚，F(xiàn)NA 細胞學(xué)檢查聯(lián)合BRAFV600E基因突變檢測預(yù)測甲狀腺峽部微小結(jié)節(jié)良惡性的準(zhǔn)確性為91.7%；甲狀腺內(nèi)存在多灶性結(jié)節(jié)共計38枚，其中惡性結(jié)節(jié)29枚，F(xiàn)NA細胞學(xué)檢查聯(lián)合BRAFV600E基因突變檢測預(yù)測甲狀腺多灶性微小結(jié)節(jié)良惡性的準(zhǔn)確性為76.3%。典型病例的超聲檢查情況見圖2～4。

圖2 甲狀腺微小結(jié)節(jié)FNA病例1

圖3 甲狀腺微小結(jié)節(jié)FNA病例2

3 討論

目前術(shù)前明確診斷甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性最可靠的方法就是超聲引導(dǎo)下的FNA細胞學(xué)檢查，但是目前大多數(shù)醫(yī)者因為穿刺取材結(jié)果不滿意、細胞量少或無法診斷等原因，僅針對5～10 mm 的結(jié)節(jié)進行FNA，對于≤5 mm 的甲狀腺結(jié)節(jié)只進行臨床隨訪。但這對于一些位于特殊位置的結(jié)節(jié)，如位于甲狀腺峽部或貼近甲狀腺包膜的結(jié)節(jié)，或者甲狀腺內(nèi)存在多個大小不等的可疑結(jié)節(jié)，在疾病早期就極有可能發(fā)生甲狀腺外的侵犯和甲狀腺淋巴引流區(qū)域的轉(zhuǎn)移［4-5］，患者預(yù)后差。因此對于這類高度懷疑惡性的結(jié)節(jié)，即使直徑≤5 mm，臨床也必須予以重視。

圖4 甲狀腺微小結(jié)節(jié)FNA病例3

BRAFV600E基因是PTC 最常見的基因突變類型，也是PTC最具特征性的一個生物學(xué)標(biāo)志。BRAFV600E基因是細胞質(zhì)內(nèi)的蛋白激酶成員之一，可以協(xié)助細胞核進行有絲分裂信號的傳遞，在促進細胞分裂和增殖中發(fā)揮重要作用，并且與RAS蛋白結(jié)合后進一步發(fā)生氨基酸突變，使得絲裂原活化蛋白激酶通路持續(xù)失控，最后導(dǎo)致甲狀腺細胞從良性到惡性的轉(zhuǎn)化［9］。研究證明BRAFV600E基因突變檢測有助于降低FNA細胞學(xué)檢查不確定類型的診斷率，從而提高甲狀腺結(jié)節(jié)的術(shù)前診斷率［10］。本研究中，判斷直徑≤5 mm并且評分為TI?RADS 5 的甲狀腺微小結(jié)節(jié)的性質(zhì)，F(xiàn)NA 細胞學(xué)檢查聯(lián)合BRAFV600E基因突變檢測的敏感性、準(zhǔn)確性以及AUC均高于單獨應(yīng)用FNA細胞學(xué)檢查或單獨應(yīng)用BRAFV600E基因突變檢測，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與既往研究結(jié)果相似［11］。故可以認為，F(xiàn)NA 聯(lián)合BRAFV600E基因突變檢測可以提高直徑≤5 mm 且評分為TI?RADS 5 的甲狀腺微小結(jié)節(jié)的術(shù)前診斷效能，減少漏診的發(fā)生。并且可以在保證穿刺成功率的基礎(chǔ)上，大幅度提高穿刺準(zhǔn)確性，對于改善患者預(yù)后、術(shù)前明確診斷、確定手術(shù)方式意義重大。

本研究中，F(xiàn)NA細胞學(xué)檢查無法確定良惡性的甲狀腺微小結(jié)節(jié)23 枚，其中14 枚術(shù)后病理為PTMC，BRAFV600E基因突變檢測全部（14/14）為陽性。FNA細胞學(xué)檢查為陰性的甲狀腺微小結(jié)節(jié)43 枚，其中19 枚術(shù)后病理為PTMC，BRAFV600E基因突變檢測16（16/19）枚陽性。說明對于部分FNA 細胞學(xué)檢查結(jié)果為陰性或者無法確定良惡性的甲狀腺微小結(jié)節(jié)，聯(lián)合BRAFV600E基因突變檢測，可以大大提高術(shù)前對甲狀腺微小結(jié)節(jié)良惡性的診斷率。本研究中，BRAFV600E基因突變檢測陰性結(jié)節(jié)56枚，最終病理證實為惡性結(jié)節(jié)20 枚（20/56）。分析其原因，可能為BRAFV600E基因突變在PTC 中的特異度較高，可達到99%，但靈敏度仍需提高［12］。在這20 枚惡性結(jié)節(jié)中，F(xiàn)NA 細胞學(xué)檢查陽性結(jié)節(jié)為17（17/20）枚，陰性結(jié)節(jié)為3（3/20）枚，F(xiàn)NA 穿刺準(zhǔn)確性為85%，這樣的結(jié)果也說明雖然結(jié)節(jié)直徑過小，但是穿刺準(zhǔn)確性仍然較高，與穿刺醫(yī)師的經(jīng)驗和手法有關(guān)。其余3 枚陰性結(jié)節(jié)，分析其原因，一方面有可能是PTMC癌灶過小，F(xiàn)NA 并未取得癌細胞；另一方面也有可能是FNA取得的細胞量過少，導(dǎo)致細胞學(xué)無法作出明確診斷。而這樣假陰性的結(jié)果卻與結(jié)節(jié)大小相關(guān)性較小，在直徑＞5 mm 結(jié)節(jié)中仍然存在。將FNA 細胞學(xué)檢查和BRAFV600E基因突變檢測相結(jié)合來作為術(shù)前預(yù)測甲狀腺微小結(jié)節(jié)良惡性的方法，可以將兩者優(yōu)勢互補，極大程度降低兩種檢查方法的假陰性率，提高診斷準(zhǔn)確性。

此外，對于一些特殊位置的甲狀腺惡性結(jié)節(jié)，如甲狀腺峽部結(jié)節(jié)或者結(jié)節(jié)緊貼甲狀腺包膜等，即使結(jié)節(jié)直徑較小但其侵襲性仍然很高，這些結(jié)節(jié)極易突破甲狀腺的被膜引起甲狀腺外侵犯或引流區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。因此，對這些高度可疑結(jié)節(jié)進行早期確診，對于患者治療方案和手術(shù)方式的選擇有著重要影響。本研究也對此類結(jié)節(jié)進行了初步分析。本組病例中，貼近甲狀腺包膜位置的微小結(jié)節(jié)19 枚，其中術(shù)后病理為惡性結(jié)節(jié)15 枚，F(xiàn)NA 細胞學(xué)檢查聯(lián)合BRAFV600E基因突變檢測的術(shù)前準(zhǔn)確性為89.5%；位于甲狀腺峽部微小結(jié)節(jié)12枚，其中術(shù)后病理為惡性結(jié)節(jié)11枚，F(xiàn)NA細胞學(xué)檢查聯(lián)合BRAFV600E基因突變檢測的術(shù)前準(zhǔn)確性為91.7%。以上結(jié)果可以說明，術(shù)前對這類位于特殊位置并且直徑≤5 mm的具有高侵犯特征的甲狀腺微小結(jié)節(jié)進行FNA 細胞學(xué)檢查聯(lián)合BRAFV600E基因突變檢測十分必要，術(shù)前穿刺結(jié)果的準(zhǔn)確性較高，可以幫助臨床盡早明確結(jié)節(jié)性質(zhì)，對于改善患者預(yù)后或為患者早期微創(chuàng)手術(shù)爭取了一定機會。同時本研究中，38枚微小結(jié)節(jié)為甲狀腺內(nèi)的多發(fā)結(jié)節(jié)，其中25枚分別分布在甲狀腺的不同側(cè)葉。這25枚微小結(jié)節(jié)中，術(shù)后病理診斷惡性結(jié)節(jié)20（20/25）枚，其中FNA 細胞學(xué)檢查聯(lián)合BRAFV600E基因突變檢測提示陽性結(jié)節(jié)19（19/25）枚；而在術(shù)后病理確診的20枚惡性結(jié)節(jié)中，12枚結(jié)節(jié)中直徑＞5 mm的可疑結(jié)節(jié)術(shù)后病理提示良性病變，而直徑≤5 mm 的微小結(jié)節(jié)術(shù)后病理提示惡性病變。這樣的結(jié)果也說明在臨床工作中需高度重視多灶性直徑≤5 mm 的甲狀腺微小結(jié)節(jié)，尤其是伴有較大可疑結(jié)節(jié)的患者。一方面因為多灶性的甲狀腺結(jié)節(jié)具有較高的侵襲性，影響患者的預(yù)后及手術(shù)方式的選擇；另一方面只對大結(jié)節(jié)進行穿刺細胞學(xué)檢查，對直徑≤5 mm 的高度可疑并侵襲性較高的結(jié)節(jié)只進行簡單的臨床隨訪和觀察，大結(jié)節(jié)的良性結(jié)果可能會指導(dǎo)臨床不做任何處理，從而使得侵襲性高的小結(jié)節(jié)成為后患。而如果大結(jié)節(jié)是惡性的，卻沒有明確小結(jié)節(jié)的性質(zhì)，對于一部分想要保留甲狀腺功能和美觀而選擇單側(cè)葉切除的患者來說，只進行了大結(jié)節(jié)所在甲狀腺單側(cè)葉的手術(shù)切除，而盲目保留性質(zhì)未定的微小結(jié)節(jié)側(cè)葉，那么不僅會貽誤患者治療的最佳時機，同時也使再度手術(shù)成為必然。

綜上所述，F(xiàn)NA 細胞學(xué)檢查聯(lián)合BRAFV600E基因突變檢測對于直徑≤5 mm且評分為TI?RADS 5的甲狀腺微小結(jié)節(jié)的診斷效能明顯高于單獨應(yīng)用FNA細胞學(xué)檢查或者BRAFV600E基因突變檢測，兩者聯(lián)合應(yīng)用后可以明顯降低FNA 細胞學(xué)診斷對于直徑≤5 mm的甲狀腺微小結(jié)節(jié)的誤診率，從而大大提高甲狀腺微小結(jié)節(jié)的術(shù)前診斷準(zhǔn)確性?；诖?，如在臨床工作中遇到位置特殊、惡性征象明顯、預(yù)判其侵襲性較強的直徑≤5 mm甲狀腺結(jié)節(jié)時，可以結(jié)合FNA和BRAFV600E基因突變檢測，不僅可以幫助患者爭取最佳治療時間，而且可以指導(dǎo)臨床制定最佳的手術(shù)方案。但是對于FNA操作經(jīng)驗不豐富的醫(yī)師，不建議對直徑≤5 mm的甲狀腺結(jié)節(jié)進行盲目穿刺。同時本研究的樣本量較小，需要進行進一步的探討和驗證。