周小暉，貢葉清，劉曉蓉，林 凡

南京醫(yī)科大學(xué)細胞生物學(xué)系，江蘇 南京 211166

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界上癌癥死亡的主要原因，每年確診的結(jié)直腸癌新發(fā)病例約184萬例，且大部分確診病例發(fā)現(xiàn)于晚期，姑息治療是晚期轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的主要治療方法，總體療效有限，5 年生存率僅為12%［1］。結(jié)直腸癌是一種高度異質(zhì)性的癌癥類型，這意味著基因突變、表觀遺傳調(diào)控和腫瘤微環(huán)境復(fù)雜性的增加，對結(jié)直腸癌的靶向治療構(gòu)成了嚴峻挑戰(zhàn)［2-3］。因此，有效且多功能的結(jié)直腸癌靶向治療亟待開發(fā)。

近年來，CDK4/6抑制劑為細胞周期靶向治療開辟了新途徑，在多種類型的腫瘤血腦屏障治療中顯示出了良好的療效。雖然cyclin/CDK復(fù)合物基因突變很少見［4］，但cyclin D1［5-6］在結(jié)直腸癌中常過表達，且受到上游表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、KRAS、PTEN 等基因異常突變的影響導(dǎo)致細胞周期失調(diào)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，帕博西尼（Palbociclib，商品名愛博新）作為首個批準上市的CDK4/6抑制劑，可誘導(dǎo)細胞衰老［7］、凋亡［8］、增強放療［9］和靶向治療［10］的敏感性。由于研究有限，目前尚不清楚帕博西尼治療結(jié)直腸癌是否有效，因此，本研究的首要目標是評估帕博西尼在結(jié)直腸癌模型中的有效性。

EGFR 作為致癌驅(qū)動因子，在60%～80%的CRC中過表達，為結(jié)直腸癌的治療提供了重要靶點［11］。厄洛替尼（Erlotinib，商品名特羅凱）是一種有效的小分子EGFR 酪氨酸激酶抑制劑，已被批準用于晚期胰腺癌和非小細胞肺癌的治療［12］。之前在CRC 的臨床試驗評估中顯示毒性可耐受［13］。在食管鱗狀細胞癌中，厄洛替尼聯(lián)合帕博西尼在體內(nèi)表現(xiàn)出良好的效果［14］。因此，本研究的第二個目標是評估帕博西尼聯(lián)合厄洛替尼治療結(jié)直腸癌是否存在協(xié)同作用，并相互增強抗腫瘤活性。

1 材料和方法

1.1 材料

人結(jié)直腸癌細胞系HT29購自于中國科學(xué)院細胞庫，p?EGFR、p?AKT、AKT、p?ERK1/2、p?MEK1/2、p?RB、RB、GSK3β、p?GSK3β、FoxM1、p?4EBP1 和GAPDH等抗體購自美國CST公司，帕博西尼和厄洛替尼（MCE 公司，上海），L?乳酸鈉和Captisol（阿拉丁，上海），DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、青/鏈霉素雙抗和PBS緩沖液（Gibco公司，美國），細胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、Alamar blue（上海翊圣生物），吉姆薩染色液（南京凱基生物），20，70?二氯熒光素二乙酸酯（DCFH?DA）活性氧熒光探針（北京索萊寶），20 只4 周齡雌 性SPF 級NCG（NOD ? Prkd?cem26Il2rgem26/Gpt）購于江蘇集萃藥康生物科技公司。結(jié)直腸癌組織通過江蘇省腫瘤醫(yī)院獲得，來自于1 例因原發(fā)腫瘤而接受化療后復(fù)發(fā)的患者，命名為P328。動物實驗全程將按照南京醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準的實驗方案進行飼養(yǎng)和維護。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和藥物配制

人結(jié)直腸癌細胞系HT29的培養(yǎng)基為DMEM 加10%胎牛血清和100 μg/mL青霉素/鏈霉素。所有細胞置于含5%CO2培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)液每2 d更換1次，常規(guī)PCR檢測支原體。所有實驗都采用對數(shù)生長期細胞進行。

帕博西尼和厄洛替尼細胞用藥以200 μmol/L和10 mmol/L 的濃度溶解于DMSO 中，并在-80 ℃下儲存。體內(nèi)用藥前現(xiàn)配現(xiàn)用，帕博西尼和厄洛替尼以2 mg/mL的濃度分別溶于pH=4的50 mmol/L L?乳酸鈉溶液和6%Captisol溶液。

1.2.2 細胞活力測定

取狀態(tài)良好并處于對數(shù)生長期的細胞，消化后細胞計數(shù)，以每孔2 000個細胞的密度、100 μL的體積接種于96 孔板中。每個實驗組設(shè)置3～6 個重復(fù)孔。細胞鋪板24 h后使用完全培養(yǎng)基將藥物儲存液梯度稀釋成不同的工作濃度，每孔加入100 μL的含藥培養(yǎng)基處理3 d。每孔加入10 μL Alamar blue 溶液，同時設(shè)置3～6個陰性對照。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后使用化學(xué)發(fā)光儀檢測每孔的吸光度值，激發(fā)光波長為534 nm，發(fā)射光波長為584 nm。細胞相對增殖率=（加藥3 d實驗組吸光度值-陰性對照吸光度值）/（未處理組吸光度值-陰性對照吸光度值）×100%。

1.2.3 克隆形成實驗

取對數(shù)生長期的細胞，以每孔400～800 個細胞的密度、1 mL 的體積接種于12 孔板中。細胞鋪板24 h 后加入1 mL 的含藥培養(yǎng)基，每3 d 換藥，直至對照組細胞密度達到80%～90%。每孔加入4%多聚甲醛固定30 min，后加入吉姆薩染色液，避光染色60 min。染色結(jié)束后每孔用去離子水洗去殘留的染色液，晾干后拍照。圖像使用Image J軟件進行細胞密度分析。

1.2.4 細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）測定

采用熒光探針DCFH?DA 檢測細胞內(nèi)ROS 水平。細胞鋪板后用不同濃度藥物處理3 d，細胞經(jīng)PBS 清洗后，使用活性氧反應(yīng)試劑盒檢測細胞內(nèi)ROS 累積水平，反應(yīng)結(jié)束后，將細胞消化收集使用流式細胞分析儀檢測染色陽性的細胞發(fā)光值。氧化后的激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。

1.2.5 細胞周期分布測定

采用DNA 含量定量法測定細胞周期分布。細胞鋪板后第2天更換無血清培養(yǎng)基處理24 h進行周期同步化，不同濃度的藥物處理3 d后，將細胞消化收集至離心管中，1 000 r/min 離心3 min 去除上清液，用預(yù)冷的PBS 清洗細胞后再次離心，將預(yù)冷的75%酒精逐滴添加至離心管中，放置-20 ℃固定2 h后將樣品離心用1%牛血清白蛋白重懸于PBS中。將細胞用碘化丙啶（PI）和RNaseA以終濃度0.1 mg/mL，在37 ℃下避光染色15 min后流式細胞儀檢測。

1.2.6 蛋白免疫印跡實驗

總細胞蛋白通過標準流程提取和定量。細胞經(jīng)過PBS清洗后加入蛋白裂解液置于冰上裂解30 min，13 000g4 ℃離心15 min后收集上清。采用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。取等濃度的蛋白樣品經(jīng)SDS?PAGE膠分離后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用3%BSA室溫封閉2 h，隨后4 ℃孵育一抗過夜。TBST 洗膜后室溫孵育二抗2 h，TBST洗膜后，化學(xué)發(fā)光儀檢測蛋白表達情況。

1.2.7 結(jié)直腸癌患者來源的異種移植（PDX）模型的建立與藥效實驗

4周齡雌性NCG小鼠在4%水合氯醛麻醉后，用75%酒精消毒小鼠左側(cè)腋下。做1個切口形成皮下口袋，將約3 mm3大小的患者腫瘤組織植入，用手術(shù)縫線縫合切口。當腫瘤體積達到80～120 mm3時，將小鼠隨機分為4組，每組5只。分別為對照組、帕博西尼治療組（25 mg/kg）、厄洛替尼治療組（50 mg/kg）和聯(lián)合治療組。治療方式為口服灌胃，每周5 d，治療至少4 周。小鼠每隔1 d 稱重1 次，用游標卡尺測量腫瘤體積，腫瘤體積=長×寬2×0.5。治療期間監(jiān)測腫瘤生長情況，直到腫瘤達到2 000 mm3的倫理范圍最大體積后，對小鼠行安樂死并收集腫瘤組織和器官。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

對于帕博西尼和厄洛替尼藥物聯(lián)用效應(yīng)的評價，使用Compusyn 軟件計算協(xié)同分數(shù)（combination index），使用Combenefit 軟件繪制量?效曲線并計算HAS分數(shù)。體外數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，體內(nèi)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤（）表示。使用GraphPad Prism 8.0 對數(shù)據(jù)進行雙尾Student?t檢驗或方差分析。實驗中至少有3 個重復(fù)孔，并在2 個以上的獨立實驗中重復(fù)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 帕博西尼抑制結(jié)直腸癌HT29 細胞增殖、誘導(dǎo)HT29細胞周期阻滯和胞內(nèi)ROS累積

采用Alamar blue 法檢測的0～2 μmol/L 的帕博西尼作用于結(jié)直腸癌細胞HT29 后的增殖情況（圖1A）；通過克隆形成實驗，檢測HT29 在0.1、0.5 和1.0 μmol/L的帕博西尼處理下細胞克隆形成的情況（圖1B），結(jié)果顯示帕博西尼呈現(xiàn)出劑量依賴性抗增殖和克隆形成抑制作用。

為了探討帕博西尼在短期增殖實驗和長期克隆形成實驗中發(fā)生藥效的機制，檢測了帕博西尼治療后對HT29細胞周期和胞內(nèi)ROS累積的影響?；贑DK4/6 抑制劑的作用機制，帕博西尼能夠誘導(dǎo)細胞發(fā)生G1期阻滯。低濃度（0.1 μmol/L）的藥物處理使得HT29 細胞G1 期阻滯將近80%，隨著濃度增加，阻滯率甚至高達90%（圖1C、D）。同時發(fā)現(xiàn)，帕博西尼處理導(dǎo)致HT29 細胞內(nèi)ROS 水平顯著提高，這表明活性氧在細胞內(nèi)積累可能是帕博西尼發(fā)揮作用的重要原因（圖1E、F）。

圖1 帕博西尼抑制HT29細胞增殖抑制、誘導(dǎo)細胞周期阻滯和胞內(nèi)ROS積累Figure 1 Palbociclib inhibited HT29 cell proliferation，induced cell cycle arrest and intracellular ROS accumulation

2.2 帕博西尼聯(lián)合厄洛替尼的協(xié)同抗腫瘤作用和對多條致癌信號通路的抑制

如圖2A 和2B 所示，厄洛替尼的加入顯著增強了帕博西尼對HT29細胞的抗增殖活性。等效應(yīng)圖和聯(lián)合指數(shù)CI 值計算結(jié)果表明兩藥組合之間的相互作用為協(xié)同作用（CI 值＜1 表示協(xié)同作用，圖2C）。此外，使用Combenefit軟件［15］生成的HSA協(xié)同矩陣顯示，大部分兩藥組合的協(xié)同分數(shù)都在0以上，表明帕博西尼和厄洛替尼存在協(xié)同作用（圖2D）。

同時，使用克隆形成實驗來評估兩藥聯(lián)合使用的長期效果。結(jié)果顯示，兩藥聯(lián)用后與單一藥物治療相比能夠顯著降低HT29 細胞的克隆形成能力（圖2E、F）。這些結(jié)果表明，在結(jié)直腸癌中帕博西尼和厄洛替尼具有聯(lián)合效應(yīng)，是一種有潛力的治療組合方式。

為了解釋兩藥聯(lián)用的協(xié)同效應(yīng)，通過免疫印跡實驗來揭示其作用機制。使用相對較低的濃度（帕博西尼20 nmol/L，厄洛替尼2 μmol/L）處理HT29 細胞24 h后提取蛋白，通過蛋白免疫印跡實驗檢測多條相關(guān)的關(guān)鍵信號通路是否發(fā)生改變。結(jié)果顯示，兩藥聯(lián)合后能夠強有力地抑制多條關(guān)鍵信號通路的活性。首先，相對于單藥處理的細胞，兩藥聯(lián)合組顯著抑制了總RB、p?RB 和FoxM1 水平；其次，有效抑制了EGFR 及其在PI3K 和RAS 信號通路中的下游分子p?ERK、p?AKT、p?GSK3β和p?4EBP1。兩藥聯(lián)用成功地減弱了RB、PI3K 和RAS 信號通路的強度，而這些信號通路的活性正是影響細胞增殖和生長的重要通路，從而揭示二藥聯(lián)用產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)的原因（圖2G）。

圖2 帕博西尼和厄洛替尼聯(lián)合治療對HT29細胞的聯(lián)合抑制作用Figure 2 Combined inhibitory effect of palbociclib and erlotinib on HT29 cells

2.3 厄洛替尼增強了帕博西尼誘導(dǎo)的細胞周期阻滯和胞內(nèi)ROS累積

在HT29細胞中觀察到帕博西尼和厄洛替尼顯著的協(xié)同效應(yīng)后，研究了兩藥聯(lián)合對細胞周期和胞內(nèi)ROS累積的影響。同樣，帕博西尼單獨處理后導(dǎo)致細胞周期發(fā)生G1期阻滯，盡管厄洛替尼單獨處理對于細胞周期的影響有限，但是厄洛替尼的加入進一步加劇了帕博西尼誘導(dǎo)的G1 期阻滯（圖3A、B）。隨后我們在HT29 細胞中檢測了聯(lián)合處理后胞內(nèi)ROS 水平的變化。HT29 細胞經(jīng)單藥或聯(lián)合用藥處理后，使用ROS 探針DCFH?DA 與細胞內(nèi)的ROS 進行氧化水解反應(yīng)形成帶有熒光的DCF，流式細胞儀定量細胞的熒光強度（圖3C、D），結(jié)果顯示，與單藥治療相比，聯(lián)合治療顯著增強了細胞內(nèi)ROS的積累。

圖3 厄洛替尼增強了帕博西尼誘導(dǎo)的細胞周期阻滯和胞內(nèi)ROS積累Figure 3 Erlotinib enhanced palbociclib?induced cell cycle arrest and intracellular ROS accumulation

2.4 在結(jié)直腸癌PDX 模型中驗證兩藥聯(lián)用的體內(nèi)療效

體外實驗已經(jīng)證明帕博西尼和厄洛替尼對結(jié)直腸癌細胞具有顯著的聯(lián)合抑制效應(yīng)，為了進一步評估這種治療組合對結(jié)直腸癌患者的適用性和潛力，接下來利用患者來源的腫瘤組織構(gòu)建PDX 模型，在小鼠體內(nèi)對這種治療方案進行評估，包括治療效果以及不良反應(yīng)。P328 PDX 源自1 例54 歲女性結(jié)直腸癌患者，她被診斷為Ⅳ期低分化黏液性結(jié)直腸腺癌。在P328 PDX 模型中，使用帕博西尼（25 mg/kg）聯(lián)合厄洛替尼（50 mg/kg）灌胃治療后，在實驗終止日即給藥后26 d，對照組的腫瘤體積是聯(lián)合治療組的2.9 倍（圖4A），帕博西尼單藥治療和厄洛替尼單藥治療組則分別是聯(lián)合治療組的1.6 倍和1.4 倍。與此同時，接受聯(lián)合治療的小鼠體重下降了9%～26%（圖4B），提示厄洛替尼在高劑量下存在一定的不良反應(yīng)。圖4C 顯示了藥物處理后PDX328 的腫瘤大小（因聯(lián)合治療組和厄洛替尼治療組分別有1 只小鼠死亡，最后每組各收集了4 個腫瘤），聯(lián)合治療組的腫瘤體積呈現(xiàn)出明顯小于對照組和單藥治療組腫瘤的趨勢。

圖4 在結(jié)直腸癌PDX模型中驗證帕博西尼和厄洛替尼聯(lián)用治療的體內(nèi)療效Figure 4 In vivo efficacy of palbociclib combined with erlotinib in CRC PDX model

3 討 論

本研究首先評估了帕博西尼治療CRC 的潛在價值，以了解帕博西尼的單藥作用和抑制CRC細胞增殖的機制。結(jié)果表明，帕博西尼確實能夠有效抑制CRC細胞的增殖，且帕博西尼能夠誘導(dǎo)細胞周期阻滯以及胞內(nèi)ROS累積的多種效應(yīng)，這些都有益于CRC 的治療。對于Ⅱ期和Ⅲ期的CRC 患者，5 年復(fù)發(fā)率較高（Ⅱ期9%～22%，Ⅲ期17%～44%）［16］，因此理想的靶向治療不僅要能控制腫瘤進展，還要能降低CRC的復(fù)發(fā)率。

聯(lián)合治療是癌癥治療中提高單藥治療效果，逆轉(zhuǎn)耐藥，降低用藥劑量，避免脫靶效應(yīng)帶來不良反應(yīng)的常用方法［17］。盡管帕博西尼具有良好的治療效果，但之前的臨床試驗表明，在治療期間出現(xiàn)了原發(fā)和獲得性耐藥［18］。鑒于CRC的高度異質(zhì)性，單藥帕博西尼不太可能完全控制疾病進展，盡管它在本研究的臨床前模型中顯示出優(yōu)秀的抗腫瘤作用。EGFR 抑制劑厄洛替尼被廣泛用于EGFR 突變腫瘤的臨床治療，其不良反應(yīng)相對可耐受。在本研究中，帕博西尼聯(lián)合厄洛替尼在結(jié)直腸癌細胞HT29中展現(xiàn)出了良好的協(xié)同抑制效應(yīng)，厄洛替尼的加入增強了帕博西尼誘導(dǎo)的細胞周期阻滯和胞內(nèi)ROS累積效應(yīng)。通過同時阻斷EGFR 和CDK4/6?RB 信號，兩藥聯(lián)用有效抑制了RB、PI3K和RAS信號通路的強度，這可能是兩藥協(xié)同作用的分子機制。

本研究的另一個優(yōu)勢是我們使用了臨床相關(guān)的PDX 模型進行藥物療效研究。傳統(tǒng)的細胞源性異種移植模型雖然經(jīng)常用于藥物療效研究，但這種方法并不能充分預(yù)測藥物的臨床反應(yīng)［19］。PDX 模型很好地保留了原發(fā)性結(jié)直腸癌的異質(zhì)性和分子特征，與細胞來源的異種移植模型相比能更好地預(yù)測藥效［20-21］。與之前的臨床研究［13］一致，單藥厄洛替尼在結(jié)直腸癌中表現(xiàn)出一定的抗腫瘤活性，但這種效果在腫瘤體積或生存期的統(tǒng)計學(xué)上未顯示出差異。然而，帕博西尼與厄洛替尼聯(lián)合治療在P328 PDX模型中也初步驗證了兩藥的體內(nèi)療效。

總的來說，本研究數(shù)據(jù)為帕博西尼靶向治療CRC提供了實驗和理論依據(jù)，并且與厄洛替尼聯(lián)合可以進一步增強其抗腫瘤活性。考慮到帕博西尼和厄洛替尼都是美國食品藥品監(jiān)督管理局批準的藥物，在臨床中進一步評估這種聯(lián)合用藥方案應(yīng)有較大可行性。本研究首次報道了帕博西尼和厄洛替尼聯(lián)合治療結(jié)直腸癌的效果，如能確定其潛在受益人群、不良反應(yīng)，并進一步闡明其協(xié)同作用的機制，未來有望為晚期結(jié)直腸癌治療提供一種新的治療方案。