唐青英，趙 捷，李海英，申飛飛，吳尤佳

南通大學附屬醫(yī)院兒內科，江蘇 南通 226001

先天性甲狀腺功能減退癥（congenital hypothy?roidism，CH）是新生兒常見的內分泌疾病，其發(fā)病率為1∶4 000～1∶2 000［1］。如果短期內未及時治療，往往導致大腦發(fā)育缺陷，形成永久性的智力障礙［2］。甲狀腺激素（thyroid hormones，TH）調控眾多基因，分別與神經始祖細胞遷移、神經元分化、髓鞘形成、突觸傳遞、細胞黏附和細胞凋亡等生物學過程相關［3］。近年來研究表明，環(huán)境中有害成分可通過母嬰傳播途徑干擾胎兒的TH 水平，導致胎兒發(fā)育遲緩和智能發(fā)育障礙［4］。

Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅳ（Ca2+/calmodu?lin?dependent protein kinase Ⅳ，CAMK4）是一種多功能的絲氨酸?蘇氨酸蛋白激酶，對細胞內Ca2+的變化敏感，在細胞內鈣（Ca2+）增加時被激活。CAMK4 上游啟動子的5′端-750 到-700 的區(qū)域為TH 反應元件，與甲狀腺激素受體（thyroid hormone receptor，TR）作用，并受TH 調節(jié)。在大鼠腦發(fā)育過程中，CAMK4 受三碘甲狀腺原氨酸（triiodothyronine，T3）以時間和濃度依賴性的方式調控，在神經元特異性基因調控中發(fā)揮重要作用［5］。TR 為核受體超家族的成員，其分子中含有A～F 6 個區(qū)，組成3 個功能域。TR有若干異形體，其中TRα1、TRβ1和TRβ2可結合T3，為功能性受體。這3種功能性受體與T3的結合能夠解除CAMK4 啟動子TH 反應元件的抑制狀態(tài)，從而介導CAMK4基因的表達。

在神經元中，CAMK4 是Ca2+誘導基因表達的有效中介。研究表明Ca2+及其信號控制樹突的發(fā)育［6］，細胞內Ca2+濃度升高可導致樹突形態(tài)的改變，而樹突是神經元接收其他神經元信息輸出和整合輸入信號的主要地方，在學習和記憶形成過程中，突觸連接的動態(tài)建立是其中的關鍵因素，因此樹突形態(tài)的建立對神經回路的發(fā)育至關重要［7］。且海馬作為重要的學習和記憶腦功能區(qū)，含有確定的主要細胞類群以及輸入和輸出神經環(huán)路，是CH 最先累及的重要器官結構之一［8］，而CH影響海馬發(fā)育的分子機制尚不明確。故本課題研究CAMK4 在CH 大鼠中表達的變化及對神經元樹突發(fā)育的影響，以初步探討CH大鼠海馬神經發(fā)育異常的可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料

成年孕鼠（體重220～250 g）由南通大學實驗動物中心提供，動物實驗符合3R原則并通過南通大學動物倫理委員會批準（審批號：S20190316?201）。2?巰基?1?甲基咪唑（2?mercapto?1?methylimidazole，MMI）（Sigma公司，德國），mirVana miRNA 分離試劑盒（Ambion公司，美國），RNA純化珠（Illumina公司，美國），TruSeq RNA 文庫制備試劑盒v2（Illumina 公司，美國），TRIzol（Gibco公司，美國），逆轉錄試劑盒（Roche 公司，瑞士），抗CAMK4 抗體（Proteintech 公司，美國）；抗早期生長反應蛋白3（early growth re?sponse protein 3，EGE3）抗體（Santa Cruz 公司，美國）；抗GAPDH抗體（CST公司，美國），Neurobasal培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），HBSS平衡鹽溶液（Gibco公司，美國），B27（Stemcell 公司，加拿大），胎牛血清（Gibco 公司，美國），DMEM 高葡萄糖培養(yǎng)基（Sigma公司，德國），siRNA 轉染試劑盒（廣州銳博生物公司），抗MAP2 抗體（Abcam 公司，英國）；驢抗鼠Al?exa488（Proteintech 公司，美國），T3（Sigma 公司，德國）。

1.2 方法

1.2.1 CH大鼠模型的建立

為了誘導SD大鼠的先天性甲狀腺功能減退，從孕鼠妊娠第9天起（E9，陰道栓出現的日期為E0）到仔鼠出生后第21 天（P21），在孕鼠的飲用水中持續(xù)給予0.02%的MMI。對照組的孕鼠給予清潔飲用水。采用化學發(fā)光免疫分析法測定妊娠第17 天的孕鼠及出生后第1、7 和21 天（P1、P7 和P21）仔鼠血清TH水平。

1.2.2 大鼠海馬轉錄組測序及生物信息學分析

根據生產商的操作指南，用mirVana miRNA 分離試劑盒從P1、P7 和P21 仔鼠中提取海馬總RNA。然后通過RNA純化珠篩選，并進行文庫構建和轉錄組測序分析。利用TruSeq RNA 文庫制備試劑盒v2構建文庫，并由Illumina HiSeq 2000測序50個周期，通過Illumina質量過濾器保存用于序列分析。與對照組相比，差異表達的mRNA 被指定為大于或小于2 倍變化的標準。參照NCBI數據庫或AGRIS數據庫（https：//agris?knowledgebase.org/）以E 值閾值為10-5，用Blastx 注釋基因的功能。對所有熱圖，基因都是通過Jensen?Shannon 分化聚類的。利用IPA 軟件在差異表達基因的基礎上構建一個重構的基因網絡，以研究它們的調控通路和細胞功能。

1.2.3 定量實時聚合酶鏈反應（q?PCR）

用TRIzol 制備海馬或神經元的總RNA，逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，在20 μL反應體系中，包含2 μg總RNA，0.2 U/μL 逆轉錄酶，0.5 mmol/L dNTP 混合物，1 μmol/L Oligo?dT 引物。在q?PCR 檢測前，將cDNA以1∶4稀釋。上海Generay公司設計和合成了序列特異性引物：CAMK4，正向引物5′?TGGAG?CAGTTGTTCT?3′和反向引物5′?CCTCGAATCTCAG?GTGC?3′；EGE3，正向引物5′?CTCAGATGGCTA?CAGAGAATGTG?3′和反向引物5′?ACCAGTTG?GAAGGAGAGTCG?3′。反應的初始變性周期為94 ℃5 min，然后依次為94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共45 個循環(huán)。在每個退火步驟中記錄熒光。每次PCR 運行結束后，系統(tǒng)自動分析數據，得到擴增圖。將這些基因的表達量歸一化為內源性的GAPDH的cDNA。

1.2.4 蛋白質免疫印跡（Western blot）

用含有1%SDS、100 mmol/L Tris?HCl、1 mmol/L PMSF的裂解液從神經元培養(yǎng)物或海馬中提取蛋白質。用BCA法測定每個標本的蛋白濃度，以保持相同的總蛋白量。蛋白提取液在95 ℃熱變性5 min，在10% SDS?PAGE 上電泳分離，轉移到PVDF 膜上。膜與1∶1 000 TBST 稀釋初級抗體于4 ℃過夜，其次與對應的1∶1 000稀釋二抗室溫孵育2 h。膜清洗后，使用ECL化學發(fā)光液掃膜顯色。

1.2.5 原代海馬神經元的培養(yǎng)和siRNA轉染

取E17的SD胎鼠制備原代海馬神經元，海馬在HBSS 平衡鹽溶液中解離，移至基礎高糖培養(yǎng)基，在37 ℃下，0.125%胰蛋白酶消化20 min，然后加入2倍體積的含胎牛血清的高糖培養(yǎng)基停止消化，細胞于1 000 r/min離心4 min。去除上清液后，將細胞重懸于含血清培養(yǎng)基中，對于原代培養(yǎng)、解離的細胞被接種在包被聚D?賴氨酸的小圓玻片及6 孔板內，細胞密度為1×104個/cm2，37 ℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h 后換含B27 的neurobasal 培養(yǎng)基。通過生產商的操作指南對原代海馬神經元進行siRNA 轉染，在15 μL的20 μmol/L siRNA 儲存液中加入120 μL（1×）ribo?FECTTMCP 緩沖液，然后加入12 μL riboFECTTMCP試劑。在室溫下輕輕混合并孵育15 min后，將轉染復合物加入培養(yǎng)于neurobasal培養(yǎng)基（終體積2 mL）的神經元中，siRNA 的最終濃度為150 nmol/L，并在37 ℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后測定相應的siRNA 轉染效率。

1.2.6 細胞免疫熒光

PBS 將培養(yǎng)原代海馬神經元的小圓玻片清洗3 次，后于室溫下4%多聚甲醛中固定30 min，后在PBS 中洗滌3 次，5 min/次，于含0.1%TritonX?100、5%新生山羊血清和5%馬血清的PBS 中37 ℃水浴鍋封閉1 h，將一抗在PBS 中稀釋后加在玻片上，在4 ℃下孵育16 h后，用PBS洗滌，加入二抗，在4 ℃下孵育16 h，PBS洗滌封片后拍攝。

1.3 統(tǒng)計學方法

統(tǒng)計分析使用GraphPad Prism 8 軟件。采用Levene 檢驗對數據進行正態(tài)性檢驗和方差分析。不同組間比較采用獨立樣本t檢驗、單因素方差分析及Bonferroni 檢驗。所有數據以均數±標準差（）表示。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 先天性甲狀腺功能減退引起的大鼠海馬組織基因表達的變化

為揭示CH 在大鼠海馬發(fā)育過程中的作用，分別在P1、P7 和P21 對CH 組及對照組仔鼠海馬組織進行轉錄組分析。在3個時間點進一步整合并鑒定與CH 神經活性、配體受體相互作用等重要生物學過程相關的9 個功能基因。與對照組相比，這些基因在海馬組織中表現出動態(tài)變化，如熱圖和樹狀圖所示（圖1A）。為了闡明CH損傷對海馬神經元生長的影響機制，通過IPA 構建了一個基因網絡，確定CAMK4是響應甲狀腺激素減少的突出調節(jié)因子（圖1）。數據表明，CAMK4 可能是介導CH 子代海馬異常生長的潛在因子。

2.2 CAMK4的表達情況

通過Western blot進行CAMK4蛋白質水平驗證（圖2）。可以發(fā)現CAMK4 的蛋白表達趨勢與測序結果一致，對照組大鼠中CAMK4 表達呈時間依賴性升高，P7時即可達到峰值，P7與P21的CAMK4表達無明顯差異；而CH大鼠的CAMK4表達普遍低于對照組水平?；谏鲜龅鞍姿津炞C的結果可以發(fā)現，CAMK4 的表達水平在CH 大鼠中均明顯低于相應時間點對照組大鼠，提示CAMK4與TH 水平具有相關性，可能受TH調節(jié)。

圖2 Western blot分析CH大鼠海馬Camk4的表達Figure 2 Expression of Camk4 in the hippocampus of CH rats by Western blot

2.3 原代海馬神經元siRNA敲降CAMK4的表達對神經元樹突的影響

在原代海馬神經元中通過轉染siRNA的方式敲降CAMK4 的表達，進一步研究CAMK4對神經元樹突的影響。首先，通過轉染敲降了約50%的CAMK4基因表達水平（圖3A），繼續(xù)培養(yǎng)原代海馬神經元5 d后拍攝細胞熒光圖觀察神經元樹突的形態(tài)變化（圖3C）?？梢杂^察到敲降CAMK4基因表達后的神經元樹突平均長度明顯減小，顯著低于正常海馬神經元。

圖3 CAMK4缺乏對海馬神經元樹突的影響Figure 3 The effect of CAMK4 deficiency on hippocampal neuronal dendrites

2.4 T3對原代海馬神經元培養(yǎng)的直接影響

在原代培養(yǎng)的CH海馬神經元中加入T3能誘導CAMK4 的再表達并對海馬神經元的樹突產生影響。分別從基因、蛋白質水平驗證，在CH原代海馬神經元中加入5 nmol/L T3 后，CAMK4 的RNA 及蛋白表達均呈時間依賴性上升（圖4A、B）。同時觀察加入T3后24 h及48 h神經元樹突的變化，結果顯示加入T3后神經元樹突平均長度均增加，且48 h最明顯（圖4C、D）。

圖4 T3刺激增加Camk4的表達及海馬神經元的樹突長度Figure 4 T3 increased the expression of Camk4 and the length of dendrites in hippocampal neurons

2.5 EGR3的表達情況

在大鼠海馬組織測序結果中，通過IPA 基因網絡圖發(fā)現CAMK4?EGR3存在相關性。因此，在原代海馬神經元CAMK4 的siRNA 轉染實驗中，在CAMK4 水平敲降約50%的條件下，PCR 檢測EGR3的相應表達情況，可以發(fā)現隨著CAMK4 的表達下降，EGR3 的基因水平也顯著降低（圖5A），驗證了CAMK4可以調控EGR3的表達。在體內水平，通過Western blot 檢測EGR3 的蛋白表達情況，如前CAMK4 的表達趨勢，EGR3 呈時間依賴性增加，CH大鼠在P7及P21均明顯低于正常大鼠（圖5B）。

圖5 CH大鼠海馬EGR3的表達Figure 5 Expression of EGR3 in the hippocampus of CH rats

3 討論

3.1 甲狀腺功能減退對生長發(fā)育的影響

在課題組的前期研究中已成功驗證了CH大鼠模型的構建［9］。TH 對神經系統(tǒng)的發(fā)育及功能調節(jié)十分重要，特別在胎兒期和嬰兒期，甲狀腺激素不足會嚴重影響腦的發(fā)育、分化和成熟，且不可逆轉，對胎兒產生不利的妊娠結局［10］。臨床上CH患兒的主要特征包括智能落后、生長發(fā)育遲緩和生理功能低下［11］。在實驗中觀察到CH 大鼠的體格發(fā)育較正常大鼠明顯落后，體重增長緩慢，外觀上CH 大鼠毛發(fā)光澤差、耳廓貼顱，且運動遲緩，與臨床表現相一致。

3.2 甲狀腺功能減退時CAMK4的調節(jié)

在構建的CH 大鼠模型中，甲減組的T3 水平顯著低于正常組，T3與TR的功能性受體（TRα1、TRβ1和TRβ2）結合減少，而這3種功能性受體與T3的結合能夠解除CAMK4 啟動子TH 反應元件的抑制狀態(tài)，因此在CH 大鼠中，低T3 水平可導致CAMK4 基因的表達下調。同時，在CH 大鼠原代海馬神經元培養(yǎng)基中加入T3 刺激，CAMK4 的表達隨時間明顯上升，進一步證明了甲狀腺激素可調控CAMK4 的表達。在T3 刺激后，CH 大鼠原代海馬神經元的樹突平均長度亦相應增加，促進了神經元的樹突生長，而利用siRNA敲降CAMK4表達后海馬神經元的樹突平均長度顯著降低。綜上，在CH 條件下甲狀腺激素通過CAMK4 途徑調控神經元樹突生長發(fā)育的相關生理活動。

3.3 EGR3與CAMK4表達的相關性

即時早期因子（immediate early genes，IEGs）是一類對各種環(huán)境刺激反應迅速和短暫激活的基因，許多IEGs編碼轉錄因子調控下游靶基因，這些靶基因可能介導了它們在神經生物學過程中的作用，包括突觸可塑性和記憶形成［12］。早期生長反應蛋白（early growth response protein，EGR）是IEGs 編碼的轉錄因子家族［13］。EGR 可以將環(huán)境影響轉化為大腦的長期變化，從而影響神經元的可塑性。作為轉錄因子，EGR3 可以激活大量下游靶點，通過改變突觸來響應環(huán)境刺激，以及參與軸突和樹突的發(fā)育［14］。因此，在學習、記憶和神經可塑性過程中EGR3 可能扮演了重要的角色。本實驗初步探討了CAMK4可能調控EGR3的表達，并影響海馬神經元的樹突生長發(fā)育，為探討CH大鼠海馬發(fā)育異常提供可能機制。但尚未在大鼠體內水平觀察給予CH大鼠T3替代治療后CAMK4?EGR3信號軸表達的變化，在后續(xù)的實驗中將繼續(xù)深入研究。

先天性甲狀腺功能減退會導致大鼠海馬組織中CAMK4及EGR3的蛋白表達水平均顯著下降，神經元樹突的長度減??；給予T3 刺激后，海馬神經元的CAMK4 的表達升高，樹突長度隨之增加；其中EGR3 與CAMK4 表達水平明顯相關，并受CAMK4調節(jié)。以上結果初步表明了CAMK4?EGR3 信號軸在CH大鼠海馬神經發(fā)育異常中發(fā)揮重要作用。