方 萌，池晴佳，趙 晗，郭 敬，劉宇煒*

1江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，湖北 武漢 430056；2武漢理工大學(xué)理學(xué)院力學(xué)系，湖北 武漢 430070

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發(fā)性肝癌的主要病理類型，在世界范圍內(nèi)，原發(fā)性肝癌是癌癥相關(guān)死亡的第四大原因，其預(yù)后通常較差［1］。在現(xiàn)有的診療體系下，目前大多數(shù)HCC 患者被診斷時已為晚期階段。新的診斷和預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物的開發(fā)和運(yùn)用，對于提高HCC患者的生存率具有重要意義。

SOX 轉(zhuǎn)錄因子家族是人體非常重要的一類轉(zhuǎn)錄因子，具有高度保守的高遷移率（high mobility group protein，HMG）序列［2-4］，在胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用，近年研究顯示它還與腫瘤的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)［3，5-6］。據(jù)報道，SOX轉(zhuǎn)錄因子家族已在各種腫瘤組織中作為腫瘤抑制因子或啟動子發(fā)揮作用［7］。在臨床HCC 患者中，SOX 基因家族成員異常表達(dá)，其簽名基因與腫瘤等級和腫瘤階段密切相關(guān)。新建立的SOX簽名可以在訓(xùn)練、測試和獨(dú)立驗證隊列中強(qiáng)有力地預(yù)測患者的總體生存［8］。SOX1 降低與HCC 的不良預(yù)后和腫瘤進(jìn)展相關(guān)［9］。Guo 等［10］發(fā)現(xiàn)HCC 組織中SOX9 蛋白的過度表達(dá)對腫瘤的進(jìn)展和不良預(yù)后具有預(yù)測價值。SOX12 作為SOX 基因家族的一員，其功能同樣復(fù)雜，影響各種類型惡性腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展［11-12］。有報道SOX12 在HCC 中過表達(dá)，并通過上調(diào)Twist1 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［13］。但尚不清楚HCC 中SOX12 表達(dá)的臨床病理和預(yù)后意義。

HCC的轉(zhuǎn)移與免疫微環(huán)境的改變密切相關(guān)，深入研究SOX12 與免疫浸潤的關(guān)系可能幫助改善HCC 預(yù)后的預(yù)測。然而，目前的研究對SOX12 在HCC 患者的預(yù)后價值及其與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性尚不清楚。加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（weighted gene co?expression network，WGCNA）和最小絕對收縮和選擇算法（least absolute shrinkage and selection oper?ator，LASSO）在快速、準(zhǔn)確識別這些基因標(biāo)志物，構(gòu)建風(fēng)險預(yù)后模型中有著顯著的效果［14-15］。本課題組前期研究了肝癌及其他疾病的預(yù)后標(biāo)志物與免疫調(diào)節(jié)分子機(jī)制［16］。本研究擬借助WGCNA與LASSO算法建立HCC風(fēng)險預(yù)后模型，并探究SOX12表達(dá)與HCC的免疫浸潤和基因突變間的相關(guān)性，為判斷其預(yù)后價值提供借鑒。

1 資料和方法

1.1 資料

腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫（https：//tcga?data.nci.nih.gov/tcga/）下載患者基因表達(dá)譜的3 級數(shù)據(jù)及臨床信息，研究基因表達(dá)與生存之間的關(guān)系?；虮磉_(dá)（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）查找肝細(xì)胞癌芯片，獲取數(shù)據(jù)集（GSE76427和GSE14520）用于確認(rèn)和驗證TCGA 數(shù)據(jù)集結(jié)果。GEPIA 2（http：//gepia2.cancer?pku.cn/）和ENCORI（http：//starbase.sysu.edu.cn）在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行單基因的篩選。

1.2 方法

1.2.1 評估免疫細(xì)胞浸潤水平

使用ESTIMATE 算法確定所有樣本的免疫評分，基 于CIBERSORT（http：//cibersort.stanford.edu/）的反卷積算法計算訓(xùn)練集和驗證集中22 種免疫細(xì)胞在每個患者中的浸潤比例。使用Wilcoxon 檢驗評估上述數(shù)據(jù)集中高低SOX12表達(dá)的免疫細(xì)胞浸潤差異，P<0.05為具有顯著的浸潤差異。對上述細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)分析，評估其浸潤水平對患者預(yù)后的影響。

1.2.2 獲取免疫相關(guān)基因

利用TCGA數(shù)據(jù)庫中HCC的相關(guān)數(shù)據(jù)獲得全基因組。從ImmPort 數(shù)據(jù)庫（https：//immport.niaid.nih.gov）中檢索免疫相關(guān)基因（immune?related gene，IRG）數(shù)據(jù)。通過韋恩圖分析全基因組和IRG 之間的重疊免疫相關(guān)基因，再用單因素Cox 回歸篩選出P<0.05的基因進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1.2.3 WGCNA的構(gòu)建

通過測量一定功率和網(wǎng)絡(luò)連接強(qiáng)度的無標(biāo)度拓?fù)鋽M合指數(shù)，保證相應(yīng)的軟閾值功率和無標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)。對1～30 的閾值功率進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，確定WGCNA 的規(guī)模獨(dú)立性和平均連通性，并采用層次聚類功能將表達(dá)譜相似的基因聚類成模塊。為了進(jìn)一步確定共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中的功能模塊，進(jìn)行了拓?fù)渲丿B測度（TOM）：

TOMij表示基因i 和j 的共享相鄰基因的重疊。基于TOM 的不相似度法，進(jìn)一步平均連鎖層次聚類，具有相似表達(dá)的被歸類到相同的基因模塊中。

1.2.4 基于LASSO算法的風(fēng)險預(yù)后模型

單變量Cox回歸分析用于探索基因?qū)傮w生存的影響。如果基因P<0.05，則整合到LASSO 算法中，生成嚴(yán)格等于0 的回歸系數(shù)，為了數(shù)據(jù)降維，去除一些權(quán)值較低的變量，防止協(xié)變量共線性導(dǎo)致的過擬合。計算每個樣品的風(fēng)險評分（RS）：

其中N 為基因的個數(shù)，Expi為基因表達(dá)譜，Ci為LASSO分析確定的回歸系數(shù)。以Kaplan?Meier曲線評估風(fēng)險評分與總生存率之間的關(guān)系。計算受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線的曲線下面積（area under curve，AUC）。

1.2.5 突變景觀分析

在R軟件中使用maftools軟件包，分析高低風(fēng)險組和SOX12高低表達(dá)對基因突變頻率的影響。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

利用R 軟件（https：//www.r?project.org/）進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。使用“survival”軟件包進(jìn)行生存分析，評估免疫評分與總生存期之間的關(guān)系。取中值作為分界點。使用“pROC”軟件包生成與時間相關(guān)ROC（the time?dependent ROC，tROC）曲線。使用“forest?plot”包進(jìn)行單變量和多變量Cox 回歸分析。使用“glmnet”軟件包進(jìn)行LASSO分析。在整個研究過程中，兩組獨(dú)立樣本間采用t檢驗，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SOX12表達(dá)在HCC中的臨床價值

利用TCGA?HCC 免疫相關(guān)基因和突變基因的交集產(chǎn)生了297 個基因。GEPIA 2（http：//gepia.can?cer?pku.cn/）和ENCORI（http：//starbase.sysu.edu.cn/index.php）數(shù)據(jù)庫分析了這些基因的生存和差異表達(dá)，篩選出生存和差異同時滿足P<0.05 的8 個基因。其中CCR7、VAV1、OX40、PSMD4 已經(jīng)在文獻(xiàn)中進(jìn)行了大量報道［17-21］，OXTR、PMCH 僅用于動物實驗研究［22-23］，而有關(guān)PNOC的信息量較少。因此，最終確定了滿足條件的單基因SOX12（圖1）。

圖1 單基因SOX12的確定Figure 1 Determination of single gene SOX12

通過TCGA數(shù)據(jù)庫基因數(shù)據(jù)（表1）分析，與相鄰正常組織相比，HCC組織中SOX12的表達(dá)顯著上調(diào)（圖2A）。根據(jù)Kaplan?Meier 分析，高SOX12表達(dá)的HCC 患者其總生存期較差（P=0.024，圖2B）。由tROC 可知，SOX12的表達(dá)對患者預(yù)后具有較強(qiáng)的預(yù)測能力，其1年、3年和5年的AUC分別為0.679、0.636和0.617（圖2C）。根據(jù)疾病分期和腫瘤分級情況顯示，SOX12 的表達(dá)在不同分期中具有明顯差異（圖2D、E、F）。為了確保結(jié)果的可靠性，使用GEO數(shù)據(jù)庫（表2）中的GSE76427（n=116）進(jìn)行了驗證（圖3）。

圖3 GEO?LIHC隊列中SOX12臨床價值分析Figure 3 Analysis of the clinical value of SOX12 in GEO?LIHC cohort

表2 GEO數(shù)據(jù)庫臨床信息表Table 2 The clinical data in the GEO database（n）

圖2 TCGA?LIHC隊列中SOX12的臨床價值分析Figure 2 Analysis of the clinical value of SOX12 in the TCGA?LIHC cohort

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫臨床信息表Table 1 The clinical data in the TCGA database（n）

通過對TCGA和GEO數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素和多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示，SOX12表達(dá)是一個獨(dú)立的預(yù)后生物標(biāo)志物（圖4A），這一顯著性差異在GEO數(shù)據(jù)中也得已驗證（圖4B）。以上結(jié)果表明，SOX12表達(dá)水平可能影響HCC的發(fā)展，可作為HCC預(yù)后不良的獨(dú)立生物標(biāo)志物。

2.2 SOX12高低表達(dá)的腫瘤免疫微環(huán)境

利用CIBERSORT算法觀察22種腫瘤免疫細(xì)胞在HCC組織中的聚類情況（圖5A、6A），在SOX12高表達(dá)和低表達(dá)組中上述腫瘤免疫細(xì)胞比例和亞群分布有顯著性差異（圖5B～C、6B～C）。此外，在TCGA數(shù)據(jù)中，靜息記憶性CD4+T 細(xì)胞、濾泡輔助性T 細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞M0、巨噬細(xì)胞M1、激活的肥大細(xì)胞在SOX12 高低表達(dá)中具有顯著性差異（圖5D）。在GEO 數(shù)據(jù)中，初始B 細(xì)胞、靜息記憶性CD4+T 細(xì)胞、濾泡輔助性T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞M2 在SOX12 高低表達(dá)中具有明顯差異（圖6D）。通過對TCGA 和GEO 數(shù)據(jù)集的免疫細(xì)胞交集，獲取交集的兩個免疫細(xì)胞：靜息記憶性CD4+T 細(xì)胞和濾泡輔助性T細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)分析。

圖5 TCGA?LIHC隊列分析HCC中的免疫浸潤情況Figure 5 Immune infiltration of HCC in the TCGA?LIHC cohort

圖6 GEO?LIHC隊列分析HCC中的免疫浸潤情況Figure 6 Immune infiltration of HCC in the GEO?LIHC cohort

2.3 WGCNA確定與免疫標(biāo)記物有關(guān)的模塊

通過TCGA和IRG交集獲取的1 333個基因，進(jìn)行單因素分析篩選出P<0.05的基因共1 090個（圖7A）。利用WGCNA 分析SOX12 表達(dá)與免疫標(biāo)志物的相關(guān)基因，選取靜息記憶性CD4+T 細(xì)胞的標(biāo)志物CCR5、CD69、FOXP3 及濾泡輔助性T 細(xì)胞的標(biāo)志物CXCR5、IL21、CD44作為臨床性狀分析，經(jīng)過聚類篩選，共鑒定出7個不同的免疫相關(guān)基因表達(dá)模塊（圖7C）。在黃色、藍(lán)色、青綠色、棕色、綠色、紅色、灰色模塊中分別包含66、283、404、106、41、20 和170 個免疫相關(guān)基因。將HCC 患者的模塊特征基因與免疫標(biāo)志物進(jìn)行相關(guān)性分析（圖7F），發(fā)現(xiàn)SOX12表達(dá)與青綠色模塊顯著相關(guān)，選取青綠色模塊內(nèi)基因用于預(yù)后模型分析。

圖7 WGCNA分析Figure 7 WGCNA analysis

2.4 預(yù)后模型分析

青綠色模塊的404個基因確定為與SOX12生存相關(guān)的IRG。經(jīng)過LASSO 回歸分析選定出18 個顯著影響患者生存預(yù)后的IRG（ACKR1、CALCR、CCR3、CD8A、HMOX1、IL15RA、IL12A、IL18RAP、KLRK1、NOD2、PGF、PLXNC1、RNASE2、S100A9、SLC11A1、SSTR2、SPP1、TNFRSF11B）（圖8A、B）。根據(jù)風(fēng)險評分系數(shù)，將HCC 患者分為高低風(fēng)險組（圖8C）。由Kaplan?Meier 分析顯示出高風(fēng)險組比低風(fēng)險組的總生存率較差（圖8D）。tROC曲線分析表明，風(fēng)險預(yù)后模型具有顯著的預(yù)后預(yù)測效果，其1年、3 年和5 年的AUC 分別為0.823、0.811 和0.824（圖8E）。

圖8 LASSO分析Figure 8 LASSO analysis

2.5 高低表達(dá)和風(fēng)險組之間不同的突變頻率

利用TCGA數(shù)據(jù)確定SOX12基因表達(dá)和IRG的高低風(fēng)險是否與基因的突變頻率相關(guān)。結(jié)果顯示，高SOX12 表達(dá)組中TP53 基因突變比例（40%）明顯高于低SOX12 表達(dá)組（25%）（圖9A、B）。這一結(jié)果和IRG 高低風(fēng)險組結(jié)果類似（圖9C、D）。上述數(shù)據(jù)表明高低SOX12 表達(dá)和基因簽名的高低風(fēng)險分組影響基因突變的頻率，說明SOX12可能是HCC的標(biāo)志基因。

圖9 HCC中基因突變的瀑布圖Figure 9 Waterfall chart of genetic mutations in HCC

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子SOX 基因家族是一類新發(fā)現(xiàn)的編碼轉(zhuǎn)錄因子的超基因家族，先前研究發(fā)現(xiàn)SOX12在胚胎發(fā)育和細(xì)胞特征維持中起著至關(guān)重要的作用［24］。越來越多的證據(jù)表明，SOX12 基因的突變、缺失或過表達(dá)與多種類型惡性腫瘤的形成和發(fā)展密切相關(guān)［25-26］。研究人員發(fā)現(xiàn)SOX12表達(dá)有助于維持HCC的腫瘤細(xì)胞特性［27］，并通過激活HCC 中上皮?間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程而引起腫瘤的轉(zhuǎn)移［28］。但SOX12 作為HCC中一個重要的生物標(biāo)志物，其與HCC患者的生存預(yù)后關(guān)系尚不清楚。相比先前的研究，本文通過差異表達(dá)分析、ROC 曲線分析和生存分析，首次揭示了SOX12 在HCC 中的診斷和預(yù)后價值。與相鄰的非腫瘤組織相比，HCC組織中的SOX12表達(dá)顯著上調(diào)，并且其高表達(dá)與患者的不良生存密切相關(guān)，可能成為影響HCC預(yù)后的關(guān)鍵標(biāo)志物。

通過TCGA 數(shù)據(jù)庫基因數(shù)據(jù)分析，與相鄰的正常組織相比，HCC 組織中SOX12 的表達(dá)顯著上調(diào)。根據(jù)Kaplan?Meier 分析，高SOX12 表達(dá)的HCC 患者其總生存期較差（P=0.024）。由tROC 可知，SOX12的表達(dá)對患者的預(yù)后具有較強(qiáng)的預(yù)測能力，其1、3、5 年的AUC 分別為0.679、0.636 和0.617。根據(jù)疾病分期和腫瘤分級情況顯示，SOX12 的表達(dá)在不同分期中具有顯著差異。為了確保結(jié)果的可靠性，使用GEO 數(shù)據(jù)GSE76427 進(jìn)行了驗證。對TCGA 和GEO 數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素和多因素Cox 回歸分析顯示，SOX12 表達(dá)與患者生存預(yù)后顯著相關(guān)。這一結(jié)果表明，SOX12 表達(dá)可能影響HCC 的發(fā)展，可作為HCC 預(yù)后不良的獨(dú)立生物標(biāo)志物。之前研究結(jié)果也證實SOX12 與多種癌癥的不良預(yù)后顯著相關(guān)［29］，其在腫瘤相關(guān)的免疫浸潤中起重要作用［30］，并且與TNM 分期顯著相關(guān)［13］，本文結(jié)果與這些研究報道相一致?；赪GCNA與LASSO 回歸分析選定出18 個顯著影響患者生存預(yù)后的IRG，并獲得了相應(yīng)的風(fēng)險評分。

盡管臨床上使用TNM 分期和分子特征對不同的腫瘤亞型、階段和臨床預(yù)后進(jìn)行分類，但新出現(xiàn)的證據(jù)表明免疫環(huán)境可能對于腫瘤類型分類和分期以及預(yù)測患者生存率非常有用，甚至更為優(yōu)越［5］。先前已有報道，T細(xì)胞存在于HCC的免疫細(xì)胞浸潤中，T細(xì)胞的免疫浸潤程度與HCC患者的存活率密切有關(guān)［31-32］，本研究觀察到與文獻(xiàn)報道相同的現(xiàn)象。此外本研究還發(fā)現(xiàn)SOX12 高低表達(dá)與CD4+T 細(xì)胞和濾泡輔助性T 細(xì)胞的免疫浸潤水平具有顯著差異，提示SOX12 在免疫微環(huán)境中的作用是通過這兩類免疫細(xì)胞浸潤體現(xiàn)的。隨后，我們研究了SOX12基因高低表達(dá)組和高低風(fēng)險組的基因突變頻率，發(fā)現(xiàn)TP53、CTNNB1 等基因突變在高SOX12基因表達(dá)組中更常見。據(jù)報道稱TP53突變體是在癌細(xì)胞表達(dá)中最常見的蛋白質(zhì)突變體［33］。值得一提的是，CTNNB1在散發(fā)性腫瘤不顯示突變，而在可遺傳的患者所占比例較高［34］，提示某些基因突變與SOX12表達(dá)和腫瘤進(jìn)展相關(guān)。這與本研究結(jié)果一致，后期將進(jìn)一步通過實驗驗證以逐步完善SOX12 表達(dá)對HCC 影響的證據(jù)。

根據(jù)風(fēng)險評分系數(shù)將HCC 患者分為高低風(fēng)險組，Kaplan?Meier 分析顯示出高風(fēng)險組比低風(fēng)險組的總生存率較差。tROC 曲線分析表明基于SOX12表達(dá)的風(fēng)險預(yù)后模型1、3、5 年的AUC 分別為0.823、0.811、0.824，比之前報道的肝癌預(yù)后模型表現(xiàn)更好［35-36］。雖然前期研究人員分別構(gòu)建了4 基因、6 基因肝癌預(yù)后模型［37-38］，但這兩項研究沒有定量評估預(yù)后模型的生存預(yù)測能力。而本預(yù)后模型具有很好的預(yù)測能力，有望幫助加強(qiáng)肝癌的預(yù)后預(yù)測能力。

總之，利用WGCNA 與LASSO 回歸得到的基于SOX12 表達(dá)的風(fēng)險預(yù)后模型具有很好的預(yù)后預(yù)測能力。此外，SOX12高低表達(dá)組中靜息記憶性CD4+T 細(xì)胞和濾泡輔助性T細(xì)胞的免疫浸潤水平表現(xiàn)出顯著差異，SOX12的高表達(dá)不僅會影響HCC患病基因的突變頻率，而且與HCC 的不良預(yù)后顯著相關(guān)。本研究提示SOX12 可能成為新型的HCC 預(yù)后生物標(biāo)志物，為HCC后續(xù)免疫治療和靶向治療的進(jìn)一步開展提供參考。