姚 雪，劉 爍，俞宛君，陶澤華，蔣雅斕，陳少聃，冉銀宏，夏 圣

江蘇大學醫(yī)學院免疫學教研室，江蘇 鎮(zhèn)江 212013

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種好發(fā)于育齡期婦女的內分泌紊亂疾病［1］。近年來的研究結果提示，PCOS 的發(fā)生發(fā)展與慢性炎癥也密切相關［2］。干擾素（interferon，IFN）?γ是一種炎性細胞因子，在卵泡發(fā)育過程中主要分布在顆粒細胞（granular cells，GC）和卵母細胞中。顆粒細胞的增殖、分化在卵泡生長發(fā)育過程中起著十分重要的作用，而顆粒細胞的大量凋亡會影響卵泡細胞的正常發(fā)育、成熟，進而導致疾病產生［3］。本課題組前期體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，IFN?γ作用48 h后可明顯抑制人卵巢顆粒細胞KGN 的增殖并促進細胞凋亡，但具體機制尚未探明［4］。二甲雙胍（Metformin，Met）是一種胰島素增敏劑，臨床上主要用于治療2型糖尿?。?］。近年來的一些研究發(fā)現(xiàn)，除降低血糖外，Met還可通過降低促炎因子表達水平、激活腺苷酸活化蛋白激酶途徑、抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白合成通路、抑制氧化應激等機制發(fā)揮抗炎作用［6］。但目前對于Met能否改善炎癥因子導致的卵巢顆粒細胞的細胞功能損傷尚不清楚。本研究旨在探討Met對IFN?γ誘導的KGN細胞功能損傷的潛在保護作用及其可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗細胞株人卵巢顆粒細胞KGN細胞（上海江林生物科技有限公司）；IFN?γ（上海達科為生物技術有限公司）；Met（Sigma?Aldrich 公司，美國）；CCK?8檢測試劑盒（上海碧云天生物公司）；細胞周期試劑盒（上海前塵生物科技有限公司）；細胞凋亡檢測試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術有限公司）；TRIzol RNA 提取試劑、逆轉錄試劑和Real Time PCR 試劑（TaKaRa公司，日本）；DMEM（上海源培生物公司）；胎牛血清（Nobimpex 公司，德國）；青霉素、鏈霉素和胰酶（Sig?ma?Aldrich 公司，美國）。細胞培養(yǎng)箱（Thermo 公司，美國）；生物安全柜（青島海爾生物醫(yī)療公司）；倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；超高速低溫離心機（Beckman Coulter 公司，美國）；酶標儀（Rayto 公司，美國）；流式細胞儀CytoFLEX（Beckman Coulter公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

人卵巢顆粒細胞KGN 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM中，并加入終濃度為100 U/mL的青霉素和鏈霉素，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每48 h換1次新鮮培養(yǎng)液。

1.2.2 CCK?8法檢測KGN細胞活力

實驗分組：對照組、IFN?γ處理組、Met 低/中/高濃度梯度組、IFN?γ與Met 低/中/高濃度梯度共處理組。取處于對數生長期KGN 細胞，用胰酶常規(guī)消化，將KGN細胞按3×103個/孔，接種至96孔板，每組設置5個復孔，置于37 ℃培養(yǎng)箱過夜預培養(yǎng)。第2天對照組常規(guī)換液，各處理組則根據分組要求，分別加入含IFN?γ（250 ng/mL）和Met（1、10、100 μmol/L）的細胞培養(yǎng)液。將細胞置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱，分別培養(yǎng)24、48 和72 h 后，每孔加入10 μL CCK?8 反應試劑，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱孵育1 h后，酶標儀于450 nm檢測各孔吸光度。本實驗中Met 的濃度梯度參考以往的文獻［7-8］設置。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡

取對數生長期KGN 細胞，胰酶常規(guī)消化后以6×104個/孔培養(yǎng)于6 孔板內，每組設置3 個復孔，預培養(yǎng)1～2 d；各處理組中分別加入相應濃度的細胞培養(yǎng)液，處理KGN 細胞48 h 后，用不含EDTA 的胰酶消化收集細胞，并用預冷的PBS 洗滌2 遍。用標記細胞凋亡的結合緩沖液調節(jié)KGN 細胞濃度為5×105個/mL。在100 μL細胞懸液中加入1 μL Annexin V?APC和2 μL 7?AAD；混勻，室溫避光孵育15 min。用結合緩沖液洗去未結合抗體，再用200 μL預冷的PBS重懸細胞，流式細胞儀分析細胞凋亡。

1.2.4 細胞周期檢測

各處理組中分別加入相應濃度的細胞培養(yǎng)液處理KGN細胞72 h后，收集細胞并用預冷的PBS洗滌2 遍；加入2 mL 70%預冷乙醇固定細胞，輕輕混勻，4 ℃過夜；離心去除固定液，用預冷的PBS 洗滌細胞2～3 次，離心，棄上清；按照細胞周期試劑盒說明書，分別加入100 μL 試劑A（胰蛋白酶等），輕輕混勻，室溫放置10 min；加入100 μL 試劑B（RNA酶、胰酶抑制劑等）輕輕混勻，室溫放置10 min；加入150 μL 試劑C（碘化丙啶等）輕輕混勻，室溫放置15 min。上機前用300 目尼龍篩網過濾細胞液，用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.5 q?PCR檢測細胞周期負性調節(jié)蛋白CDKN1A mRNA的表達

TRIzol法提取各處理組的KGN 細胞總RNA，按照日本TaKaRa公司的逆轉錄試劑說明書將RNA逆轉錄為cDNA，置-20 ℃保存。以β?actin 為內參基因，qRT?PCR 反應體系（20 μL）：2×TB Green Master Mix 10 μL，cDNA 2 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，無菌蒸餾水7.2 μL。反應程序：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共進行30 個循環(huán)。RNA 引物由上海生工生物工程有限公司合成。β?actin：正義5′?TCTGGCACCA?CACCTTCTA?3′，反義5′?AGGCATACAGGGACAG?CAC?3′；CDKN1A：正義5′?CTCATCCCGTGTTC?TCCTTT?3′，反義5′?GTACCAC?CCAGCGGACAAGT?3′。通過公式2-ΔΔCT計算基因的相對表達量。所有實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

實驗結果數據使用Graphpad Prism 5 軟件進行統(tǒng)計分析，實驗結果來自至少3次重復實驗，計量資料用均數±標準差（）表示，多組比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK法，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Met可提高IFN?γ誘導損傷的KGN細胞活力

CCK?8結果（圖1）顯示，與對照組相比，各處理組細胞在培養(yǎng)24 h 及72 h 后，除IFN?γ處理組細胞活力受到抑制（P<0.05）外，其他組未見明顯變化。而培養(yǎng)48 h后，IFN?γ處理組細胞活力受到明顯抑制（P<0.01，圖1）；低、中、高濃度的Met 單獨處理對KGN 活力均無明顯影響，但Met與IFN?γ共同作用可減緩IFN?γ對KGN 細胞活力的抑制。其中，以中濃度Met 處理組（10 μmol/L）的緩解效應最為明顯（P<0.01，圖1），故后續(xù)試驗均采用此藥物濃度和處理時間。

圖1 CCK?8檢測不同處理對KGN細胞活力的影響Figure 1 The effects of different treatments on KGN cells viability detected by CCK?8

2.2 Met可改善IFN?γ對KGN細胞生長狀態(tài)的影響

顯微鏡下觀察各處理細胞的生長狀態(tài)（圖2），可見IFN?γ作用48 h后可使細胞增殖的速度和密度明顯降低，且部分細胞皺縮、變圓。Met單獨處理對KGN細胞的增殖效應無明顯影響；但Met與IFN?γ共同作用則在一定程度上改善了被IFN?γ抑制的細胞增殖。

圖2 不同處理對KGN細胞生長狀態(tài)的影響（×40）Figure 2 The effects of different treatments on the growth of KGN cells（×40）

2.3 Met可減輕IFN?γ對KGN細胞凋亡的損傷

各處理組對KGN細胞處理48 h后，流式分析結果顯示，對照組與Met 處理組的細胞凋亡比例統(tǒng)計分析無顯著差異（P>0.05）。而IFN?γ處理后，細胞凋亡比例與對照組相比差異明顯（P<0.01）。同時，Met+IFN?γ處理組細胞凋亡比例與單獨IFN?γ處理組相比明顯降低（P<0.05，圖3）。以上結果表明，Met可減輕IFN?γ對KGN 細胞凋亡的損傷。

圖3 流式檢測不同處理對KGN細胞凋亡的影響Figure 3 The effects of different treatments on KGN cells apoptosis detected by flow cytometry

2.4 Met可緩解IFN?γ對KGN的細胞周期阻滯

流式分析時，先對KGN 細胞設門，去除細胞碎片；再對細胞周期分析的單細胞群體設門，去除黏連細胞，繼而分析單細胞中處于各細胞周期的細胞比例。結果顯示（圖4），與對照組G0?G1期（54.432±2.526）、S 期（31.732±1.965）、G2?M 期（13.637±1.816）相比，Met處理組的各周期細胞比例均無明顯變化；而與對照組相比，IFN?γ處理組G0?G1 期細胞比例（76.673±2.432）明顯增加（P<0.01），S 期比例（12.137±1.586）下降（P<0.05），G2?M 期比例（11.276±1.398）也稍有下降但無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；而與IFN?γ處理組相比，Met+IFN?γ處理組G0?G1 期細胞比例（71.152±1.861）下降，且S 期比例（19.572±1.615）升高，二者結果間的差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。以上結果提示Met可緩解IFN?γ對KGN細胞由G0?G1期進入的S期阻滯效應。

圖4 不同處理對KGN細胞周期分布的影響Figure 4 Effects of different treatments on the cell cycle distribution of KGN

2.5 Met對細胞周期的調控與CDKN1A下調有關

利用q?PCR法檢測各處理組CDKN1A mRNA的表達，結果顯示，IFN?γ處理可使KGN細胞的CDKN1A的mRNA 表達上調約5 倍，說明IFN?γ誘導的KGN G0?G1 期阻滯可能與CDKN1A 異常上調有關。當用Met 處理后，Met 可在一定程度上降低IFN?γ對CDKN1A 的誘導表達（P<0.05，圖5）。此結果提示，Met 可能是通過下調IFN?γ誘導的CDKN1A 異常表達，從而減輕了IFN?γ引起的KGN 細胞G0?G1 周期阻滯。

圖5 細胞周期復性調節(jié)蛋白CDKN1A mRNA的表達Figure 5 The mRNA expression of cell cycle refolding reg?ulatory protein CDKN1A

3 討論

PCOS 是一種與異常卵泡增生相關的內分泌紊亂疾病，GC的增殖受抑被認為是異常卵泡成熟的關鍵因素［9］。既往研究表明，IFN?γ是卵泡閉鎖的重要生理性調節(jié)因子，在卵泡發(fā)育早期未分化顆粒細胞Fas受體表達以及隨后的凋亡反應中發(fā)揮了關鍵作用［3］。此外，基于其細胞抑制、抗增殖和促凋亡效應，IFN?γ被認為可應用于多種類型癌癥的輔助免疫治療［10-11］。前期研究結果發(fā)現(xiàn)，PCOS患者外周血中IFN?γ的含量較健康人明顯增多，且IFN?γ體外作用于人卵巢顆粒細胞KGN 可明顯抑制其增殖并促進凋亡；表明炎癥因子IFN?γ可能是PCOS中導致KGN細胞功能損傷的重要因素之一［4］。

Met是一種常規(guī)降糖藥，可作為胰島素增敏劑，降低高胰島素血癥并抑制女性卵巢中過多雄激素的產生［12］。此外，在PCOS 大鼠模型中，Met 已被證明可抑制卵泡膜細胞增殖、減少小卵泡和囊腫的數量，進而提高排卵率［13］。最近有研究發(fā)現(xiàn)Met 可通過有機陽離子轉運蛋白OCTs 誘導大鼠卵巢細胞AMPK 磷酸化并減少血管內皮生長因子VEGF 的產生［8］。本實驗的研究結果顯示Met單獨作用對KGN細胞增殖、凋亡等功能無明顯影響，原因可能是本實驗使用的Met 的濃度較低，也可能是實驗細胞株與其他研究來源不同。但本研究發(fā)現(xiàn)Met 與IFN?γ共同作用可提高損傷的KGN的細胞活力，緩解IFN?γ引起的細胞凋亡及G0?G1 周期阻滯，提示Met 可減輕IFN?γ誘導的KGN 細胞功能損傷。但Met 能否改善人卵巢顆粒細胞KGN的其他生物學行為，如細胞代謝，激素分泌及凋亡相關信號轉導通路等還需進一步探究。

細胞功能紊亂常與細胞周期失調相關。文獻報道，Met可通過不同作用方式調節(jié)細胞周期來抑制腫瘤細胞的增殖［14-15］。其中，Met可通過下調細胞周期調節(jié)蛋白cyclin D1的表達和端粒酶活性阻斷G0/G1細胞周期，抑制人結腸癌SW480細胞生長［16］。因此猜測，Met 可能是通過調控細胞周期相關基因的表達，進而影響細胞功能。P21 基因是近年來發(fā)現(xiàn)的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑家族中的重要成員，可通過抑制細胞周期蛋白依賴性激酶復合物（cyclin?dependent kinases，CDKs）活性，協(xié)調細胞周期、DNA 復制與修復之間的關系。其中，CDKN1A是細胞周期負性調節(jié)因子p21 的編碼基因，p21 的過度表達常提示細胞周期阻滯［17］。CDKN1A除了在細胞周期調控中發(fā)揮作用外，還參與了細胞分化、凋亡、自噬和衰老等過程［18］。本研究結果顯示，IFN?γ處理將KGN的CDKN1A表達上調了約5 倍。Met與IFN?γ的聯(lián)合處理可降低CDKN1A 的異常表達且差異具有統(tǒng)計學意義，提示CDKN1A 下調可能與Met一定程度上緩解了IFN?γ引起的KGN 細胞G0?G1周期阻滯相關，但其緩解周期阻滯的具體機制仍需進一步探索。

綜上所述，本研究證實Met 可通過抑制細胞周期負性調節(jié)蛋白CDKN1A 表達的異常上調，緩解IFN?γ引起的KGN 細胞周期阻滯及細胞凋亡，從而發(fā)揮保護作用，可為指導PCOS 患者的臨床用藥提供新的視角。