張瑞陽，許 靖，于鑫焱，劉曉秋

南京醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)系，江蘇省現(xiàn)代病原生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211166

大腸桿菌可以引起多種感染，包括腸道內(nèi)感染和腸道外感染，腸道內(nèi)感染主要會(huì)引起腹瀉，腸道外感染主要引起泌尿道感染、新生兒腦膜炎等［1］。隨著多耐藥及全耐藥大腸桿菌的不斷出現(xiàn)，其引起的感染嚴(yán)重威脅著人類的生命健康［2-3］。由于新抗生素的研發(fā)周期不斷變長，可用于治療多耐藥及全耐藥大腸桿菌引起感染的可選抗生素非常有限，給臨床治療帶來極大困難［4］，嚴(yán)峻的形勢促使人們尋找其他替代或者補(bǔ)充療法治療耐藥菌引起的感染［5］。噬菌體作為一種簡單易獲得的天然細(xì)菌捕食者，成為替代或者補(bǔ)充抗生素的良好選擇［6-7］。

噬菌體是地球上最豐富的物種之一，對(duì)維持自然界生態(tài)平衡起到了巨大的作用［8］。同時(shí)噬菌體作為細(xì)菌的病毒，能夠感染裂解特定種類的宿主菌，可用于特異性治療由敏感細(xì)菌引起的感染。已有大量研究表明對(duì)于由多耐藥菌引起的感染［9］，噬菌體療法可作為抗生素的有效輔助甚至替代治療手段之一［10］。例如，噬菌體干粉制劑對(duì)多耐藥銅綠假單胞菌菌株引起的肺部感染小鼠具有良好的治療效果［11］；在酒精性肝炎患者體內(nèi)，噬菌體可以專門針對(duì)殺滅溶細(xì)胞的糞腸球菌，是精確編輯腸道菌群的有效方法［12］。目前一些國家正在開展有關(guān)噬菌體治療安全性和有效性的臨床試驗(yàn)［13］，噬菌體宿主范圍狹窄，而且細(xì)菌會(huì)對(duì)噬菌體產(chǎn)生抗性［14］，通過把多種噬菌體混合在一起組成雞尾酒制劑能有效克服噬菌體治療的上述缺點(diǎn)［15］。因此，有必要分離更多新的噬菌體并闡明其基因組序列，以累積足夠數(shù)量的噬菌體儲(chǔ)備用于制備針對(duì)特定臨床耐藥菌的噬菌體雞尾酒制劑，為噬菌體治療臨床多耐藥菌及全耐藥菌引起的感染奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

硫酸鎂、硝酸銀、乙醇、乙酸（中國國藥集團(tuán)）；甘氨酸、氯化銫（Sigma公司，美國）；磷鎢酸（北京中鏡科儀）；硫代硫酸鈉、碳酸鈉（上海凌峰化學(xué)）；乙酸鈉（南京生興生物）；甲醛（廣東西隴科學(xué)）；瓊脂粉（上海翊圣）。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體的分離純化

從南京城區(qū)污水中收集廢水樣本，用0.45 μm孔徑的過濾器過濾污水樣品以去除細(xì)菌。把濾液添加到對(duì)數(shù)早期的大腸桿菌395J2培養(yǎng)液中，37 ℃下培養(yǎng)24 h以富集噬菌體。將培養(yǎng)物在4 ℃14 000g離心10 min 以去除大腸桿菌菌體。以大腸桿菌395J2為宿主菌，采用雙層瓊脂平板法檢測培養(yǎng)中的噬菌體。在37 ℃下孵育過夜，觀察噬菌斑并挑取噬菌斑，重復(fù)感染周期直到形成的噬菌斑大小均一。隨后，將純化后的噬菌斑在純水中稀釋并在4 ℃保存。

挑取噬菌斑接種于50 mL處于對(duì)數(shù)期的宿主菌395J2 的培養(yǎng)液中培養(yǎng)2 h，取菌液以4 ℃14 000g離心10 min以去除大腸桿菌菌體，采用超高速氯化銫密度梯度離心法分離純化菌液中噬菌體。

1.2.2 噬菌體形態(tài)觀察

將密度梯度離心法純化的噬菌體vB_EcoM_RZ溶液鋪于帶有碳膜的銅網(wǎng)上吸附2 min，并用2%（w/v）的磷鎢酸進(jìn)行負(fù)染2 min 并立即用濾紙吸干。在80 kV 的FEI Tecnai G2 Spirit Bio TWIN 透射電子顯微鏡下拍攝噬菌體的顯微照片。

1.2.3 噬菌體一步生長曲線

將大腸桿菌395J2 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)早期（1×108CFU/mL）。加入噬菌體vB_EcoM_RZ 感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為10（MOI=10），37 ℃共培養(yǎng)10 min。14 000g離心1 min 收集菌體。菌體用新鮮的LB 培養(yǎng)基洗滌2 次后，重懸于50 mL 的新鮮LB培養(yǎng)基中于37℃振蕩培養(yǎng)。每隔5 min取菌液，采用雙層瓊脂平板法檢測菌液上清中噬菌體的數(shù)量。生長曲線可以幫助確定該噬菌體的潛伏期和爆發(fā)期及爆發(fā)量。

1.2.4 噬菌體溫度穩(wěn)定性

通過恒溫水浴法測定噬菌體在不同溫度（4、25、37、45、50、55、60、65 ℃）下處理60 min后的存活率：將1 mL 噬菌體（107PFU/mL）置于上述溫度下，取60 min后樣品測定噬菌體滴度。

1.2.5 噬菌體宿主范圍及生物學(xué)特性

通過斑點(diǎn)法檢測該噬菌體對(duì)不同大腸桿菌菌株的感染裂解能力。將每種測試細(xì)菌的100 μL 過夜培養(yǎng)的菌液添加到3.5 mL 融化的LB 瓊脂（0.6%瓊脂）中。然后將混合物覆蓋在LB瓊脂平板上。將板在室溫下干燥30 min，然后將2 μL逐滴稀釋的系列噬菌體裂解液滴在板表面，然后在37 ℃下孵育過夜。檢查平板的菌體清除區(qū)以評(píng)估細(xì)菌裂解程度。

1.2.6 噬菌體的細(xì)菌挑戰(zhàn)試驗(yàn)

大腸桿菌395J2的過夜培養(yǎng)物分別接種于不同培養(yǎng)瓶中的50 mL新鮮LB肉湯中，在37 ℃200 r/min 培養(yǎng)至吸光度值D（600 nm）=0.3。然后在不同培養(yǎng)瓶中分別加入不同濃度vB_EcoM_RZ 噬菌體液（MOI=0.1，MOI=1，MOI=10）。通過測量不同時(shí)間點(diǎn)的D（600 nm）來監(jiān)測細(xì)菌生長情況。作為陰性對(duì)照，用SM緩沖液代替vB_EcoM_RZ噬菌體液。每隔15 min測定D（600 nm）。

1.2.7 噬菌體vB_EcoM_RZ的基因組提取及測序

將純化的噬菌體樣品用DNase I 和RNase A 在37 ℃下處理2 h，以消化污染的細(xì)菌DNA 和RNA。然后在55 ℃下用蛋白酶K處理15 min。用TIANamp Bacteria DNA Kit（北京天根生物）進(jìn)一步制備噬菌體基因組DNA。使用Illumina HiSeq 2500測序儀對(duì)VB_EcoM_RZ 基因組DNA 進(jìn)行測序，并使用ABySS v2.0.2 軟件和GapCloserv1.12 將測序結(jié)果拼接組裝成基因組。

1.2.8 噬菌體vB_EcoM_RZ的基因組分析

使用 artemis 和Glimmer3 軟件預(yù)測vB_EcoM_RZ 的基因組編碼的開放閱讀框（open reading frame，ORF）。使用NCBI上的BLAST工具對(duì)蛋白主序列功能注釋。使用ExPASy Compute pI/Mw工具計(jì)算推定蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)。采用EMBL?EBI 的EMBOSS Needle 工具進(jìn)行蛋白質(zhì)氨基酸序列的整體比對(duì)。采用EasyFig 比對(duì)vB_EcoM_RZ及其親緣關(guān)系近的噬菌體的氨基酸序列。采用MEGA7 對(duì)vB_EcoM_RZ 及其相似噬菌體基因組之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系進(jìn)行分析。

1.2.9 噬菌體vB_EcoM_RZ的結(jié)構(gòu)蛋白分析

采用12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS ? polyacrylamide gel electrophoresis，SDS ?PAGE）分離鑒定噬菌體顆粒中含有的蛋白質(zhì)并銀染凝膠。同時(shí)，噬菌體顆粒加熱變性后，通過液相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（high performance liquid chroma?tography?mass spectrometry，HPLC?MS）分離蛋白質(zhì)，以胰蛋白酶進(jìn)一步消化后通過Q Exactive 質(zhì)譜儀分析胰蛋白酶肽。使用MASCOT 引擎分析鑒定vB_EcoM_RZ病毒顆粒中含有的蛋白質(zhì)。

1.2.10 噬菌體vB_EcoM_RZ 的基因組核苷酸序列登錄號(hào)

vB_EcoM_RZ 的基因組序列已上傳到Gen?Bank，登錄號(hào)為MW598459。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體vB_EcoM_RZ形態(tài)結(jié)構(gòu)

噬菌體在大腸桿菌395J2宿主菌平板上37 ℃過夜培養(yǎng)可形成清晰的圓形噬菌斑（直徑約0.5 mm）（圖1A）。在透射電子顯微鏡下觀察純化的噬菌體顆粒，可見其具有典型的二十面體的頭部和帶有可收縮尾鞘的長尾，表明該噬菌體屬于肌尾噬菌體科。該噬菌體的二十面體頭部的平均直徑為100 nm，而尾大約長為120 nm（圖1B）。按照噬菌體命名法則［16］該噬菌體正式命名為vB_EcoM_RZ。

2.2 噬菌體vB_EcoM_RZ生物學(xué)特性

采用一步生長實(shí)驗(yàn)以評(píng)估vB_EcoM_RZ的種群動(dòng)力學(xué)（圖2A）。vB_EcoM_RZ的潛伏期約為10 min。感染后30 min所有噬菌體均已釋放（圖2A），該噬菌體的爆發(fā)量大約為平均每個(gè)菌體釋放1.14×109個(gè)噬菌體顆粒。

噬菌體vB_EcoM_RZ 放置于不同溫度（4、25、37、45、50、55、60、65 ℃）下60 min 后測定噬菌體的滴度變化（圖2B）。結(jié)果表明，噬菌體vB_EcoM_RZ的生物學(xué)活性在4～45 ℃的溫度范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，但是當(dāng)溫度升高至45 ℃以上時(shí)噬菌體的滴度迅速下降，表明該噬菌體在一定溫度（4～45 ℃）下可保持良好的熱穩(wěn)定性，因此易于保存。

通過標(biāo)準(zhǔn)斑點(diǎn)試驗(yàn)測定該vB_EcoM_RZ噬菌體感染并裂解不同大腸桿菌菌株的能力。結(jié)果顯示該噬菌體對(duì)38 種大腸桿菌中的13 株多重耐藥性（multiple drug resistance，MDR）大腸桿菌菌株都具有裂解效果，從而表明vB_EcoM_RZ 具有相對(duì)較廣的宿主譜，并提示該噬菌體可作為生物防治劑，有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。

在MOI=10 的條件下測試了vB_EcoM_RZ 對(duì)菌株395J2 的裂解效果。結(jié)果顯示vB_EcoM_RZ 可以在感染2 h 后有效裂解大腸桿菌395J2（圖2C）?？傊?，上述這些結(jié)果均提示了vB_EcoM_RZ 具有較廣宿主范圍和較強(qiáng)的溶菌能力，使得該噬菌體有作為生物制劑用于控制感染的巨大潛力。

圖2 噬菌體vB_EcoM_RZ生物學(xué)特性Figure 2 Biological characteristics of phage vB_EcoM_RZ

2.3 噬菌體vB_EcoM_RZ基因組的基本特征

vB_EcoM_RZ的完整基因組由長度為170 318 bp的環(huán)狀雙鏈DNA 組成，GC 含量為40.146%。平均基因長度為554 bp，大小范圍為26～1 318個(gè)核苷酸。在vB_EcoM_RZ 的完整基因組中預(yù)測到了292 個(gè)推定的ORF。在噬菌體基因組的正向鏈中有45 個(gè)ORF，在互補(bǔ)鏈中有247個(gè)ORF（圖3）。確定有125個(gè)ORF 編碼已知功能的蛋白質(zhì)（藍(lán)色基因），而167 個(gè)ORF 編碼的蛋白功能未知為假定蛋白（黑色基因，圖3）。另外，在vB_EcoM_RZ 基因組中未發(fā)現(xiàn)編碼阻遏蛋白、整合酶（溫帶噬菌體的標(biāo)記）等溶源性周期相關(guān)基因。由此認(rèn)為vB_EcoM_RZ噬菌體為毒性噬菌體?；蚪M分析還表明，噬菌體vB_EcoM_RZ不編碼與毒素或其他毒力因子相關(guān)的基因。vB_EcoM_RZ作為毒性噬菌體特性但同時(shí)沒有攜帶可能的毒性基因，使其成為治療應(yīng)用的潛在優(yōu)良候選者。

圖3 噬菌體vB_EcoM_RZ的基因排布Figure 3 Gene arrangement of phage VB_EcoM_RZ

2.4 噬菌體vB_EcoM_RZ的結(jié)構(gòu)蛋白

為了分析vB_EcoM_RZ 的結(jié)構(gòu)蛋白，將純化的噬菌體顆粒煮沸進(jìn)行變性后通過SDS?PAGE電泳分離。在SDS?PAGE 凝膠中觀察到至少9個(gè)不同的蛋白條帶，分子量范圍為5.8～143.0 kDa（圖4）。在質(zhì)譜中鑒定出43個(gè)蛋白質(zhì)，包括34種已知的蛋白，此外還鑒定了一些假設(shè)的蛋白，這些假定蛋白可能是一些未知的結(jié)構(gòu)蛋白，深入研究并揭示這些蛋白的功能，可能對(duì)進(jìn)一步了解該噬菌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)有幫助。

圖4 噬菌體vB_EcoM_RZ的基因排布Figure 4 Gene arrangement of phage vB_EcoM_RZ

2.5 噬菌體vB_EcoM_RZ比較基因組分析

為了確定噬菌體的確切分類學(xué)位置，根據(jù)BLAST 分析的結(jié)果，將vB_EcoM_RZ 的基因組序列與從世界不同地區(qū)分離的9個(gè)噬菌體進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并使用MEGA7 程序繪制系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。結(jié)果表明在這些噬菌體之間存在復(fù)雜的進(jìn)化關(guān)系。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，vB_EcoM_RZ 是一株新型噬菌體，與噬菌體T4、VR26、VR20、VR25、VR7、SP18、DK13、UPEC01 及CJ20 有親緣關(guān)系。比較基因組分析的結(jié)果擴(kuò)展了對(duì)vB_EcoM_RZ及其噬菌體親戚之間進(jìn)化和關(guān)系的理解。

圖5 噬菌體vB_EcoM_RZ的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 5 Phylogenetic tree of phage vB_EcoM_RZ

vB_EcoM_RZ 編碼的大多數(shù)蛋白質(zhì)和其他相關(guān)噬菌體編碼的相應(yīng)蛋白同源性較高，但是有少數(shù)蛋白和其他噬菌體的相應(yīng)蛋白明顯不同（空白區(qū)域）（圖6）。同時(shí)，噬菌體vB_EcoM_RZ 和T4 噬菌體存在一定的發(fā)育關(guān)系，基因組序列比較分析發(fā)現(xiàn)兩者有94.14%的相似性。分析vB_EcoM_RZ 與T4 噬菌體的溶菌酶、穿孔素和長尾纖維蛋白氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)分別有69.14%、53.24%和34.07%的相似性。而噬菌體尾蛋白被認(rèn)為參與宿主的識(shí)別功能，并賦予噬菌體宿主范圍特異性。

vB_EcoM_RZ 和9 個(gè)相近噬菌體的蛋白質(zhì)序列多重比對(duì)顯示，大多數(shù)區(qū)域在蛋白質(zhì)水平上高度同源，但它還可以觀察到一些空白區(qū)域（圖6）。vB_EcoM_RZ 作為一種有尾噬菌體，可在不同選擇壓力下發(fā)生基因重排，與宿主共同進(jìn)化并更具有多樣性。此外，有尾噬菌體是雙鏈DNA 病毒中數(shù)量種類最多的一組，容易發(fā)生基因丟失、獲取和交換，并且不共享通用基因，其進(jìn)化非常復(fù)雜?；虻闹嘏沤粨Q和丟失獲取都可能影響噬菌體基因組的組織，并影響vB_EcoM_RZ 結(jié)構(gòu)組裝和蛋白活性表達(dá)。

圖6 噬菌體vB_EcoM_RZ 與相近噬菌體的蛋白質(zhì)序列多重比對(duì)Figure 6 Multiple alignment of protein sequences between phage vB_EcoM_RZ and similar bacteriophages

3 討論

本研究分離并鑒定了一株新的噬菌體vB_EcoM_RZ。因?yàn)樵撌删w基因組存在裂解基因，如溶菌酶、穿孔素等，而沒有編碼整合酶、阻遏蛋白等溶源相關(guān)基因，因此認(rèn)為vB_EcoM_RZ 是毒性噬菌體。vB_EcoM_RZ的基因組序列分析發(fā)現(xiàn)其不編碼潛在毒力因子或抗生素抗性基因［17］。斑點(diǎn)試驗(yàn)證明其能對(duì)十幾株MDR 大腸桿菌臨床分離株有裂解活性［18］，同時(shí)該噬菌體具有較短的生命周期和巨大的爆發(fā)量，表明該噬菌體具有作為有效抗菌制劑的優(yōu)良特征，因此，vB_EcoM_RZ是對(duì)抗耐藥大腸桿菌的噬菌體雞尾酒制劑的優(yōu)良候選者［19］。

同時(shí)在vB_EcoM_RZ 病毒顆粒中鑒定到43 種蛋白，再次證實(shí)該噬菌體不攜帶毒性蛋白質(zhì)，其是能感染大腸桿菌的一種新的毒性噬菌體?；蚪M和蛋白質(zhì)組分析證實(shí)了vB_EcoM_RZ 的裂解性質(zhì)。比較基因組分析揭示了這些噬菌體基因組進(jìn)化變化的機(jī)制，并且與T4 噬菌體存在一定的親緣關(guān)系，這可能解釋vB_EcoM_RZ為什么有較廣的宿主范圍和良好的裂解能力［20］。本結(jié)果表明噬菌體vB_EcoM_RZ的基因排布和基因組結(jié)構(gòu)與其噬菌體親屬的基因排布和基因組結(jié)構(gòu)有所不同，并且宿主的裂解范圍與親屬噬菌體也有所不同，這可能與噬菌體與宿主菌動(dòng)態(tài)共進(jìn)化相關(guān)［21］?？傊?，我們的所有結(jié)果均提示，vB_EcoM_RZ噬菌體是一種新型并具有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值的噬菌體，與T4噬菌體存在復(fù)雜的進(jìn)化關(guān)系，需要進(jìn)行更深入的研究以更好地闡述這一問題。