陸好悅，劉聰聰，肇 毅

南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院乳腺外科，江蘇 南京 210029

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，導致全世界每年約50 萬女性死亡［1］。根據(jù)不同乳腺癌之間基因表達的差異，其至少可以分為4 種不同的分子亞型［2］。三陰性乳腺癌（triple negative breast can?cer，TNBC）是指雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）及人表皮生長因子受體2（human epidermal growthfactor receptor 2，HER?2）均為陰性的一類乳腺癌，占乳腺癌相關(guān)死亡人數(shù)的25%［3］。即使接受了規(guī)范的手術(shù)及放化療，TNBC 患者在術(shù)后2～3 年內(nèi)仍處于高復發(fā)轉(zhuǎn)移風險期［4］，其預(yù)后明顯差于其他乳腺癌亞型。由于TNBC 缺乏特異性的分子靶點，不能從針對ER、PR的內(nèi)分泌治療及針對HER?2 的分子靶向治療中獲益，因此，尋找新的治療藥物及治療方法來有效控制TNBC 患者術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)移是目前乳腺癌研究領(lǐng)域的熱點［5］。散沫花（Lawsonia inermis L.）又稱指甲花［6］，中藥典籍中最早記載于西晉嵇含所著《南方草木狀》，其具有抗腫瘤、抗感染、抗寄生蟲等藥理功效。散沫花中活性成分散沫花素（lawsone），又稱指甲花醌，有較強的抗腫瘤活性，對包括肺癌、肝癌、腸癌、黑色素瘤及白血病等［7-12］在內(nèi)的多種腫瘤均有抑制作用。本研究通過體外實驗檢測散沫花素對TNBC細胞的作用，探討散沫花素治療TNBC的潛力。

1 材料和方法

1.1 材料

散沫花素（2?羥基?1，4?萘醌，分子式：C10H6O3）粉劑（上海Topscience 生物科技有限公司）；人乳腺癌細胞MDA?MB?231（ATCC 公司，美國）；人乳腺癌細胞SUM1315由Stephen Ethier教授（美國密歇根大學）贈予。DMEM 培養(yǎng)基、PBS 緩沖液、胎牛血清、0.25%胰酶和青鏈霉素（Gibco 公司，美國）；CCK?8試劑盒（Dojindo 公司，日本）；Transwell 生物膜基質(zhì)凝膠包被的侵襲小室（Costar 公司，美國）；結(jié)晶紫、細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

Thermo 3111 CO2培養(yǎng)箱、MUTiskan GO 酶標儀（Thermo Fisher 公司，美國）；Axiovert 40 CFL 熒光倒置顯微鏡（Zeiss 公司，德國）；BD FACSCalibur 流式細胞儀（BD Bioscience 公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)MDA?MB?231 和SUM1315 細胞。功能實驗分組：①散沫花素處理組：MDA?MB?231 和SUM1315 細胞分別用含有200 μmol/L、150 μmol/L散沫花素的DMEM 培養(yǎng)基預(yù)處理24 h 后收集細胞培養(yǎng)；②對照組：含0.1%DMSO的DMEM培養(yǎng)基預(yù)處理24 h后收集細胞。

1.2.2 抑制增殖活性檢測（CCK?8法）

在96 孔板中接種對數(shù)生長期的MDA?MB?231和SUM1315細胞，每孔接種約2 000個，待細胞貼壁后加入不同濃度散沫花素DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），以含0.1% DMSO 的DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）為空白對照。在處理72 h后，吸除舊培養(yǎng)基，加入10 μL 的CCK?8 及90 μL 無血清培養(yǎng)基，放入CO2培養(yǎng)箱靜置2 h后，用酶標儀讀取450 nm吸光度。按照下列公式計算細胞活力：

A（加藥）：具有細胞、CCK?8 溶液和藥物溶液的孔的吸光度；A（空白）：具有培養(yǎng)基和CCK?8 溶液而沒有細胞的孔的吸光度；A（0加藥）：具有細胞、CCK?8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度。用Graphpad Prism 8軟件以提取物濃度的對數(shù)值log（X）為橫坐標，提取物的吸光度與空白對照吸光度的百分比值為縱坐標，做非線性回歸分析，獲得抑制細胞增殖的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.3 細胞遷移活性檢測（劃痕實驗）

收集預(yù)處理后的兩組細胞，以每孔5×105個細胞接種于6 孔板，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后用槍頭（200 μL）劃痕，用PBS 緩沖液洗去漂浮細胞，加入DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），分別于劃痕后的0、24 h后在顯微鏡下拍照，用Image J軟件分析處理前后劃痕面積變化，計算抑制遷移率。

1.2.4 細胞侵襲實驗

收集預(yù)處理后的兩組細胞，用不含胎牛血清的培養(yǎng)基制備成含4×104個/mL的細胞懸液加入Tran?swell 生物膜基質(zhì)凝膠包被的侵襲小室（置于24 孔板中），Transwell 小室的下層加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，用棉簽擦去孔內(nèi)細胞，75%乙醇固定0.5 h后用結(jié)晶紫染色1 h，洗去多余染液，在顯微鏡下隨機選取5個視野拍照，并計數(shù)細胞個數(shù)，取5 個視野的平均數(shù)表示腫瘤細胞的體外侵襲數(shù)。

1.2.5 平板克隆形成實驗

收集預(yù)處理后的兩組細胞，以500個/孔均勻接種至6 孔板上，培育14 d 后用70%乙醇固定3 min，1%結(jié)晶紫染色15 min，PBS洗滌2次并拍照。

1.2.6 EdU實驗檢測癌細胞DNA合成能力

暫不考慮總重，為了平衡跨中的活載，同前，當預(yù)應(yīng)力度分別取為1和0.5時得到的剪力滯系數(shù)沿著跨徑方向的變化曲線如圖10所示。

收集預(yù)處理后的兩組細胞，以2 000 個/孔均勻接種至96孔板中。按EdU 試劑盒配制染色液和進行實驗操作，結(jié)束后置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7 流式細胞儀檢測細胞周期變化

收集預(yù)處理后的兩組細胞，以每孔5×105個細胞接種至6 孔板，以不含EDTA 的胰蛋白酶使細胞脫壁，收集細胞，按細胞周期試劑盒中說明進行實驗操作，用流式細胞儀進行細胞周期檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS22.0 和Graphpad5.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。所有定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，兩組比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK 法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 散沫花素對乳腺癌細胞增殖的抑制

將散沫花素粉劑用DMSO 溶解至10 mmol/L 配置為母液，再用DMEM 培養(yǎng)基稀釋至不同濃度，測試其對MDA?MB?231和SUM1315乳腺癌細胞的增殖抑制活性（圖1）。進一步分析散沫花素在不同濃度時對MDA?MB?231和SUM1315 細胞增殖的抑制作用，計算得出其作用72 h的IC50分別為249.87 μmol/L和158.34 μmol/L。

圖1 不同濃度散沫花素培養(yǎng)72 h后乳腺癌細胞增殖活性Figure 1 Proliferative activity of breast cancer cells cul?tured with different concentrations of lawsone

2.2 散沫花素對乳腺癌細胞遷移的影響

與對照組相比，散沫花素處理后MDA?MB?231和SUM1315 細胞遷移的平均抑制率分別達67.85%和56.54%（P<0.000 1，圖2）。

圖2 劃痕實驗檢測乳腺癌細胞遷移活性（×40）Figure 2 Results of wound?healing assay（×40）

2.3 散沫花素對乳腺癌細胞侵襲的影響

與對照組相比，散沫花素處理組的細胞侵襲能力受到明顯抑制，散沫花素處理后MDA?MB?231 和SUM1315 細胞穿過膜孔的細胞數(shù)量分別為對照組的28.52%和18.06%（P<0.05，圖3）。

2.4 散沫花素對乳腺癌細胞增殖的影響

平板克隆實驗檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，散沫花素處理組的細胞克隆數(shù)明顯減少（P<0.001，圖4A、B）。EdU 實驗結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，散沫花素處理組細胞的DNA 合成能力受到顯著抑制［（87±13）vs.（42±9），P<0.001，圖4C；（103±24）vs.（33±12），P<0.001，圖4D］。

圖4 散沫花素對三陰性乳腺癌細胞增殖能力的影響Figure 4 Effect of lawsone on proliferation of triple negative breast cancer cells

2.5 散沫花素對乳腺癌細胞周期的影響

通過流式細胞儀檢測散沫花素對MDA?MB?231和SUM1315細胞周期的影響。由結(jié)果可知，散沫花素處理組與空白對照組相比，MDA?MB?231 的G0/G1 期細胞的數(shù)量平均由48.78%增加至55.7%，S 期細胞數(shù)由44.72%減少至42.57%，G2 期細胞數(shù)量由6.5%減少至1.73%；SUM1315 的G0/G1 期細胞的數(shù)量平均由48.78%增加至55.7%，S 期細胞數(shù)由44.72%減少至42.57%，G2 期細胞數(shù)量由6.5%減少至1.73%（圖5）。

圖5 流式細胞儀檢測細胞周期結(jié)果Figure 5 Results of cell cycle analysis

3 討論

目前，乳腺癌的全身治療手段主要包括化療、內(nèi)分泌治療和抗HER?2 靶向治療。由于內(nèi)分泌治療和抗HER?2 靶向治療對TNBC 無效，化療是目前TNBC 唯一有效的全身治療手段［2］。雖然TNBC 相對于非TNBC 對化療的初始反應(yīng)更加敏感，但較易形成耐藥［13］。因此，研究人員一直在不斷探索針對三陰性乳腺癌的有效治療方法。以靶向程序性死亡受體1（PD?1）或其配體（PD?L1）為代表的免疫治療在多種晚期惡性腫瘤中都顯示出了良好的治療效果［14］。然而，針對TNBC 的臨床試驗結(jié)果表明抗PD?L1/PD?L1 單藥治療TNBC 的客觀反應(yīng)率只有10%～20%［15］。另外，靶向PARP、mTOR、Src 等靶點的藥物也被用于TNBC治療的體內(nèi)外研究。其中單藥PARP抑制劑在攜帶BRCA1突變的TNBC患者治療上取得一定效果，但尚未獲得能提高TNBC 患者預(yù)后的臨床數(shù)據(jù)。靶向mTOR 的抑制劑在PTEN基因缺陷的TNBC 細胞中顯示出了更高的抑制作用［16］，然而現(xiàn)有的臨床實驗表明mTOR 抑制劑聯(lián)合化療并沒有改善TNBC患者的病理緩解率［17］。本課題組既往開展了Src 抑制劑PP2 用于TNBC 治療的臨床前研究，發(fā)現(xiàn)波形蛋白高表達的TNBC 細胞系對Src抑制劑更加敏感［18］，提示TNBC內(nèi)在的異質(zhì)性可能會影響藥物的預(yù)期治療效果?？傮w來說，目前多數(shù)單藥治療TNBC 的研究結(jié)果并不理想，對患者預(yù)后生存無明顯改善。

散沫花素是中草藥散沫花中主要的活性成分之一，有抗氧化、抗腫瘤、抗真菌和細菌等活性。散沫花素能通過多種機制來發(fā)揮抗腫瘤作用，在體外實驗中，散沫花素可通過抑制酪氨酸酶活性及降低相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）表達來減少黑素瘤細胞中黑色素的產(chǎn)生［12］，還可通過降低NF?κB活性來抑制結(jié)直腸癌細胞周期［8］，并能在動物實驗中明顯抑制皮膚癌的發(fā)生［19］。此外，Lee 等［11］研究發(fā)現(xiàn)散沫花素的衍生物能靶向作用于多藥耐藥的急性淋巴細胞白血病細胞中的Wnt/β?catenin 信號通路來抑制白血病細胞。此前，尚無研究涉及散沫花素在TNBC治療中的作用。

本研究首先通過CCK?8、EDU 和平板克隆實驗明確了散沫花素對TNBC 的非選擇性抑制作用，能同時抑制MDA?MB?231 和SUM1315 細胞的增殖活性，且兩者IC50處相同數(shù)量級，均＞150 μmol/L。在Baiju 等［20］的研究中，將散沫花素合成雜環(huán)稠合醌類化合物，處理人結(jié)腸癌、人前列腺癌、人早幼粒細胞白血病、人膠質(zhì)母細胞瘤和人肺癌細胞，證實其對多種腫瘤細胞具有抑制作用，且IC50值<2 μmol/L，遠小于散沫花素的IC50值，提示該化合物可能具有更強的細胞毒性，但這一結(jié)論尚未得到循證醫(yī)學證實。Oliveira等［21］的研究將散沫花素與以其為基礎(chǔ)的6種釕（Ⅱ）配合物處理前列腺癌細胞及乳腺癌細胞，發(fā)現(xiàn)6種釕（Ⅱ）配合物的IC50值均小于散沫花素的IC50值；該研究中散沫花素的IC50值均＞100 μmol/L，與本研究的結(jié)果相仿。

通過劃痕實驗和侵襲實驗進一步探討散沫花素是否具有抑制TNBC轉(zhuǎn)移的能力，結(jié)果表明，散沫花素能有效抑制TNBC 的遷移和侵襲。De Grandis等［22］的研究中用以散沫花素為基礎(chǔ)的化合物處理前列腺癌細胞，與對照組相比，暴露于化合物濃度為0.5 μmol/L 的細胞48 h 后，80%的細胞遷移受到抑制。Rom?o等［23］的研究中用與多胺結(jié)合的散沫花素處理多形性膠質(zhì)母細胞瘤細胞后，與對照組相比該化合物能顯著降低腫瘤侵襲力。由此可見，無論是散沫花素單體還是基于散沫花素的化合物都有明顯抑制腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用。

本研究細胞周期分析還發(fā)現(xiàn)散沫花素能有效阻斷TNBC 細胞由G1 期進入S 期。Wang 等［8］用散沫花素處理結(jié)腸癌DLD?1細胞，結(jié)果顯示處于G2/M期的細胞數(shù)量顯著增加，向下一個S 期過渡的時間有所延遲。提示散沫花素雖然對各類腫瘤細胞都具有抑制作用，但在不同腫瘤細胞間發(fā)揮作用的原理不同，可以進一步設(shè)計相關(guān)實驗研究散沫花素在TNBC細胞中的作用靶點。

綜上研究表明，散沫花素能有效抑制包括TN?BC細胞在內(nèi)的惡性腫瘤細胞的生長和侵襲轉(zhuǎn)移，其抑制TNBC 細胞的分子機制以及對活體TNBC 乳腺癌的作用有待進一步探索。