熊 亮，胡 寅，王立夫，曹咬臍，錢(qián)莉麗，劉涇科

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬江蘇盛澤醫(yī)院整形燒傷科，江蘇 蘇州 215228；2南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形燒傷科，江蘇 南京210029

miRNA是一類(lèi)較短的單鏈RNA，參與許多靶基因的表達(dá)與調(diào)控，影響細(xì)胞生物學(xué)功能［1-2］。miRNA?199a作為高度保守microRNA，在正常皮膚和腫瘤細(xì)胞中表達(dá)豐富，影響細(xì)胞的增殖和遷移［3-4］。目前對(duì)miRNA?199a?5p的研究主要集中在癌細(xì)胞［5-6］，本研究構(gòu)建人皮膚成纖維細(xì)胞（human skin fibroblasts HSF）熱損傷模型［7］，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR 對(duì)miRNA?199a?5p 的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，分析熱損傷對(duì)HSF 增殖和遷移功能的影響；用miRNA?199a?5p 模擬物轉(zhuǎn)染熱損傷細(xì)胞，觀察其對(duì)熱損傷細(xì)胞的增殖和遷移能力［8］，旨在為由熱損傷引起的皮膚功能恢復(fù)提供研究依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

正常HSF 購(gòu)自無(wú)錫博慧斯生物醫(yī)藥科技有限公司。低糖細(xì)胞培養(yǎng)液（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）、胎牛血清（fetal bovine Serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；RNA 提取試劑（TRIzol）、LipofectamineTM 2000 轉(zhuǎn)染試劑、RT?PCR 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；microRNA mimics（5′ ?CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUCACAGGUAGU ?CUGAACACUGGGGUU?3′）、陰性對(duì)照mimics（5′?CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUCACAGGUAGUC?UGAACACUGGGUU?3′）購(gòu)自蘇州吉瑪生物科技有限公司；U6 RT 引物（5′?CGAGCACAGAATCGCTT?CACGAATTTGCGTGTCAT?3′）、miR?199a?5p RT 引物（5′?GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTC?GCACTGGATACGACGAACAG?3′）、U6 擴(kuò)增引物（正向引物：5′?CGAGCACAGAATCGCTTCA?3′；反向引物：5′?CTCGCTTCGGCAGCACATAT?3′）、miR?199a?5p 擴(kuò)增引物（正向引物：5′?GTGCAGGGTCCGAGG?TATT?3′；反向引物：5′?CTAACCCAGTGTTCAGAC?TAC?3′）由蘇州金唯智公司合成；四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物公司；Transwell小室（康寧公司，美國(guó)）；Matrigel（B&D 公司，美國(guó)）；轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000（Invitrogen公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇后的HSF常規(guī)培養(yǎng)，F(xiàn)BS濃度為10%，胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 HSF熱損傷處理及熱損傷模型的制作

細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%，胰蛋白酶消化，分成3個(gè)培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的培養(yǎng)皿均用封口膜封好，兩個(gè)熱損傷組在同一溫度（52 ℃）水浴中熱損傷不同時(shí)間（30 s和60 s），對(duì)照組細(xì)胞懸液培養(yǎng)皿在37 ℃水浴中水平面下浸泡30 s。細(xì)胞均保持在水平面以下。分別在0 h和24 h進(jìn)行拍照，并結(jié)合瑞?姬氏染色法觀察熱損傷對(duì)HSF形態(tài)的影響。HSF熱損傷模型的制作參照文獻(xiàn)［7］：將封口膜密封的培養(yǎng)皿放入52 ℃水浴箱中水平面下浸泡30 s。

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn)

將經(jīng)過(guò)熱損傷處理的HSF（52 ℃30 s）計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量至25 000個(gè)/mL，每孔200 μL，加入到96孔培養(yǎng)板中。一組培養(yǎng)24 h，另一組培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，每孔分別加入MTT 20 μL，2 h后加入DMSO溶解，570 nm處測(cè)吸光度值。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR

將經(jīng)過(guò)熱損傷處理的HSF（52 ℃30 s）分為兩組，一組培養(yǎng)24 h，另一組培養(yǎng)48 h。收集培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，用TRIzol 試劑提取細(xì)胞miRNA。配制逆轉(zhuǎn)錄及PCR 擴(kuò)增體系。逆轉(zhuǎn)錄條件為：50 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃失活2 min。PCR 條件為：94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)后72 ℃繼續(xù)延伸10 min。通過(guò)2-△△Ct法檢測(cè)miR?199a?5p的相對(duì)含量。

1.2.5 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

將經(jīng)過(guò)熱損傷處理的HSF（52 ℃30 s）調(diào)節(jié)細(xì)胞密度，以過(guò)夜鋪滿(mǎn)為準(zhǔn)，接種于6孔板。用100 μL 的槍頭在每孔中線輕輕劃過(guò)，PBS 清洗。用FBS 濃度為4%的DMEM 培養(yǎng)基補(bǔ)充培養(yǎng)液至3 mL/孔。培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)胞的遷移。

1.2.6 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

在Transwell 小室膜的上室面加入稀釋后基質(zhì)膠（基質(zhì)膠與無(wú)血清培養(yǎng)稀釋比例為1∶7），每孔100 μL，30 min 后吸掉基質(zhì)膠。將HSF 用DMEM 制成無(wú)血清懸液，在上室層各加入250 μL，細(xì)胞數(shù)為1.5×104個(gè)/孔。下室加入10%FBS的DMEM，常規(guī)培養(yǎng)24 h。擦凈上室面細(xì)胞，用4%的多聚甲醛固定下室面剩余細(xì)胞，Giemsa 染色，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞個(gè)數(shù)，以每個(gè)小室的平均細(xì)胞數(shù)為最終計(jì)數(shù)。

1.2.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

HSF穩(wěn)定傳代2～3代，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)70%時(shí)，消化接種至6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞正常生長(zhǎng)后制作熱損傷模型（52 ℃30 s）。模擬物組，用100 pmol miR?NA?199a?5p模擬物加5 μL 轉(zhuǎn)染試劑混合轉(zhuǎn)染細(xì)胞；對(duì)照組，用100 pmol的陰性對(duì)照模擬物加5 μL轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000 混合轉(zhuǎn)染細(xì)胞。添加DMEM 培養(yǎng)液至1 mL/孔。4 h 后更換培養(yǎng)液，用10%FBS 的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)或方差分析進(jìn)行組間比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熱損傷對(duì)正常HSF形態(tài)的影響

正常HSF 呈梭形或三角形，個(gè)體飽滿(mǎn)，細(xì)胞膜光滑透亮。熱損傷后HSF 變圓鈍，體積增大，表面有較多突起，胞漿中有大量的異常疏松透亮區(qū)，核漿比例變?。▓D1）。

圖1 熱損傷對(duì)HSF形態(tài)的影響（Giemsa染色，×200）Figure 1 Effects of thermal injury on HSF morphology（Giemsa staining，×200）

2.2 熱損傷對(duì)HSF增殖的影響

熱損傷24 h 和48 h 后，HSF 增殖明顯受到了抑制。相對(duì)于正常細(xì)胞增殖，熱損傷24 h后細(xì)胞平均抑制率為（17.10±3.21）%（P＜0.002，n=3）、熱損傷48 h 后細(xì)胞平均抑制率為（25.93±1.74）%（P＜0.001，n=3，圖2）。

圖2 熱損傷對(duì)HSF增殖的影響Figure 2 Effects of thermal injury on proliferation of HSF

2.3 熱損傷對(duì)HSF miR?199a?5p表達(dá)的影響

熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果見(jiàn)表1。熱損傷后HSF miRNA?199a?5p的表達(dá)明顯得到了抑制（圖3），24 h HSF miRNA?199a?5p 表達(dá)率為（2.67±0.35）%，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），48 h表達(dá)率為（18.42±0.44）%，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

圖3 熱損傷對(duì)HSF miRNA?199a?5p表達(dá)的影響Figure 3 Effects of thermal injury on miRNA?199a?5p expression in HSF

表1 24 h、48 h熱損傷HSF miRNA?199a?5p qRT?PCR結(jié)果Table 1 miRNA?199a?5p qRT?PCR results of thermal injury HSF at 24 h and 48 h（n=4，）

表1 24 h、48 h熱損傷HSF miRNA?199a?5p qRT?PCR結(jié)果Table 1 miRNA?199a?5p qRT?PCR results of thermal injury HSF at 24 h and 48 h（n=4，）

2.4 熱損傷對(duì)HSF遷移的影響

熱損傷后，HSF 細(xì)胞遷移速率明顯降低。顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)（n=4），對(duì)照組計(jì)數(shù)結(jié)果為（24.75±2.06）個(gè)，熱損傷組計(jì)數(shù)結(jié)果為（8.75±2.06）個(gè)，熱損傷對(duì)細(xì)胞遷移的抑制率為（35.35±7.07）%，與對(duì)照組比較遷移功能下降（P＜0.001，圖4）。

圖4 熱損傷對(duì)HSF遷移的影響Figure 4 Effects of thermal injury on HSF migration

2.5 熱損傷對(duì)HSF侵襲的影響

熱損傷后，HSF 侵襲速率明顯降低。顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)（n=4），對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量為（21.00±5.56）個(gè)，熱損傷組細(xì)胞數(shù)量為（12.00±2.58）個(gè)，熱損傷對(duì)細(xì)胞侵襲的抑制率為（57.14±9.52）%，與對(duì)照組比較侵襲功能亦下降（P＜0.007，圖5）。

圖5 熱損傷對(duì)HSF侵襲的影響Figure 5 Effect of thermal injury on HSF invasion

2.6 miRNA?199a?5p 模擬物對(duì)熱損傷后HSF 增殖的影響

加入陰性模擬物組的細(xì)胞增殖率為（104.52±5.46）%，加入miR?199a?5p 模擬物組的細(xì)胞增殖率為（136.55±6.14）%，后者的熱損傷細(xì)胞增殖明顯升高（P＜0.003，n=3，圖6）。

圖6 miRNA?199a?5p模擬物對(duì)熱損傷后HSF增殖的影響Figure 6 Effects of miRNA?199a?5p mimics on prolifera?tion of HSF after thermal injury

2.7 miRNA?199a?5p 模擬物對(duì)熱損傷后HSF 侵襲的影響

顯微鏡下對(duì)侵襲的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)（n=4），加入陰性對(duì)照模擬物組細(xì)胞數(shù)量為（9.00±2.16）個(gè)，細(xì)胞侵襲率為（112.50±18.75）%；加入miR?199a?5p 模擬物組細(xì)胞數(shù)量為（15.75±1.71）個(gè)，細(xì)胞侵襲率為（196.88±15.63）%，后者的熱損傷細(xì)胞侵襲率明顯升高（P＜0.003，圖7）。

圖7 miRNA?199a?5p模擬物對(duì)熱損傷后HSF侵襲的影響Figure 7 Effects of miRNA?199a?5p mimics on invasion of HSF after thermal injury

3 討論

在深度燒傷及熱壓傷中，真皮細(xì)胞的代謝、功能、形態(tài)等都發(fā)生了病理性改變。能夠可逆修復(fù)創(chuàng)面、恢復(fù)功能的間生態(tài)真皮是影響手術(shù)修復(fù)及預(yù)后的重要因素［9］。臨床治療過(guò)程中，醫(yī)生時(shí)常處于盡可能去除壞死組織和保留間生態(tài)組織兩難的境地，通過(guò)研究影響變性真皮轉(zhuǎn)歸的重要因素及其機(jī)制，可以為臨床治療提供更多的理論依據(jù)。真皮中含有多種細(xì)胞，HSF是其中的重要細(xì)胞之一，它由胚胎時(shí)期的間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來(lái)。深度燒傷及熱壓傷后HSF增殖并遷移至創(chuàng)面，大量分泌膠原纖維及各種生長(zhǎng)因子，還可以和新生毛細(xì)血管、各種炎癥細(xì)胞形成肉芽組織促進(jìn)創(chuàng)面的愈合，在創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

作為高度保守的micorRNA，miRNA?199a?5p 廣泛存在于皮膚、炎癥反應(yīng)、血管內(nèi)皮細(xì)胞、癌細(xì)胞中，參與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等活動(dòng)與功能［4，6，10-12］。研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miRNA?199a?5p 后，U2OS細(xì)胞的增殖能力顯著降低（P<0.05），同時(shí)cy?clin D1、p Rb表達(dá)水平顯著下降，而P27、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1 的表達(dá)水平顯著增加（P<0.05）［5］。miR?199a?5p 通過(guò)調(diào)節(jié)EGF、SP1 下調(diào)ERK5 的表達(dá)并抑制其磷酸化，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)乳腺癌MDA?MB?231 細(xì)胞侵襲的抑制作用［13］。

大鼠真皮熱壓傷實(shí)驗(yàn)顯示，在不同時(shí)間點(diǎn)獲取組織樣本，檢測(cè)樣本中miRNA?199a?5p 的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示miRNA?199a?5p 相對(duì)表達(dá)量為先抑制后上調(diào)的趨勢(shì)［14］。推測(cè)在大鼠皮膚組織受損初期，真皮層受到影響，變性真皮細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)無(wú)法恢復(fù)正常功能，因此細(xì)胞內(nèi)miRNA?199a?5p 的表達(dá)量相對(duì)減少，表現(xiàn)為表達(dá)抑制。此結(jié)論可能也適用于人的皮膚組織。因此，本研究利用HSF，通過(guò)構(gòu)建熱損傷模型觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，檢測(cè)細(xì)胞中miRNA?199a?5p表達(dá)量的變化，以及人為干擾miRNA?199a?5p表達(dá)量來(lái)觀察熱損傷對(duì)HSF的影響。

本研究觀察到，熱損傷模型中HSF形態(tài)發(fā)生了改變，miRNA?199a?5p表達(dá)量顯著下調(diào)，并顯著抑制HSF 的增殖、遷移和侵襲能力。通過(guò)轉(zhuǎn)染模擬物的方式提高熱損傷人成纖維細(xì)胞中miRNA?199a?5p的量，可以顯著提高熱損傷細(xì)胞的增殖和侵襲能力，提示HSF熱損傷后的細(xì)胞功能與miRNA?199a?5p的表達(dá)量密切相關(guān)。這與之前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)應(yīng)。而如何在皮膚熱損傷后提高人皮膚成纖維細(xì)胞中miRNA?199a?5p 的表達(dá)量，加快熱損傷皮膚的恢復(fù)與治療，成為下一步研究的方向。