韓 琦，黨文慶，郭翔宇，李雅婷，秦小偉，李鵬飛，呂麗華*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801）

Weigel[1]等在果蠅中首次發(fā)現(xiàn)了forkhead（fkh）基因，并證明了該基因編碼的蛋白是細(xì)胞核中的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。FoxO轉(zhuǎn)錄因子是叉頭框轉(zhuǎn)錄因子（Forkhead Transcription Factors）的一個(gè)亞家族。FoxO亞家族蛋白在細(xì)胞分化、細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激應(yīng)答和細(xì)胞自噬等方面有著重要作用[2]。在哺乳動(dòng)物中，F(xiàn)oxO亞家族包含F(xiàn)oxO1、FoxO3、FoxO4和FoxO6 4個(gè)成員，他們都具有高度同源性[3]。其中FoxO1、FoxO3和FoxO4廣泛表達(dá)于全身各個(gè)組織中，而FoxO6主要表達(dá)在腦的特定區(qū)域[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO1mRNA在卵巢中表達(dá)豐富[5]；Richards等[6]、Shi等[7]、Park等[8]都發(fā)現(xiàn)FoxO1高表達(dá)于大鼠卵巢的生長(zhǎng)卵泡的顆粒細(xì)胞中。此外，用FoxO1抗體對(duì)荷斯坦奶牛[9]、香豬[10]的卵巢卵泡細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)時(shí)，均發(fā)現(xiàn)FoxO1在不同的發(fā)育階段的卵泡顆粒細(xì)胞中表達(dá)不同。Tarnawa等[11]通過(guò)對(duì)多種哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫組化，不僅發(fā)現(xiàn)了FoxO1在多種哺乳動(dòng)物的卵巢顆粒細(xì)胞中均有表達(dá)，還發(fā)現(xiàn)在不同動(dòng)物卵泡不同的發(fā)育階段，顆粒細(xì)胞上的FoxO1表達(dá)不同。此外，有研究報(bào)道，F(xiàn)oxO1可以促進(jìn)小鼠[12]、豬[13]、牛[14]卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡，這說(shuō)明FoxO1對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞的增殖具有一定的調(diào)控作用。顆粒細(xì)胞是卵泡內(nèi)十分重要的細(xì)胞群，顆粒細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及激素分泌與卵泡的發(fā)育密切相關(guān)[15-16]。由此可見(jiàn)，F(xiàn)oxO1對(duì)卵泡的發(fā)育有一定的調(diào)控作用。近年來(lái)對(duì)FoxO1的研究大多集中于小鼠、豬、牛等哺乳動(dòng)物，尚未見(jiàn)過(guò)有關(guān)于綿羊的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要是通過(guò)免疫組織化學(xué)定位、qRT-RCR和Western Blotting技術(shù)檢測(cè)FoxO1在綿羊不同大小卵泡中的表達(dá)規(guī)律，為進(jìn)一步探明FoxO1在綿羊卵巢卵泡中的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本實(shí)驗(yàn)選用的健康性成熟綿羊（生理狀況一致）卵巢均來(lái)自山西省晉中市清徐縣綿羊屠宰場(chǎng)。

1.2 主要試劑 RNAiso Plus（TaKaRa，日本）、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，日本）、TB GreenTMPremix Ex TaqTM Ⅱ（TaKaRa，日本）、RIPA裂解液（碧云天，上海）、PMSF（博士德生物，武漢）、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（Solarbio，北京）、Lane Marker Loading Buffer（Reducing 5×）（康為世紀(jì)生物科技有限公司，北京）、M5 Prestained Protein Ladder（10～180 ku）with 45 ku（聚合美，北京）、封閉蛋白干粉（博士德生物，武漢）、Rabbit HRP Kit（DAB）（康為世紀(jì)生物科技有限公司，北京）、4%多聚甲醛（博士德生物，武漢）、蘇木素（博士德生物，武漢）、FoxO1 Rabbit mAb（Cell Signaling Technology，美國(guó)）、β-actin polyclonal antibody（BioWorld，美國(guó)）、IRDye800CW Goat anti-Rabbit（LI-COR，美國(guó)），其余均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 綿羊小中大卵泡以及卵泡顆粒細(xì)胞的分離 將采集的健康綿羊（生理狀況一致）卵巢放入4℃杜氏磷酸緩沖液（DPBS）中，快速帶回實(shí)驗(yàn)室并處理，將卵巢用滅菌的DPBS沖洗2遍后，用眼科剪將卵泡從卵巢上分離出來(lái)，并按照Nogueiraa等的卵泡分類方法將卵泡分為?。ㄖ睆健? mm）、中（3 mm＜直徑＜5 mm）、大（直徑≥5 mm）3類[17-19]，滅菌的DPBS沖洗2次后放入盛有DPBS的表面皿上，將卵泡剪開(kāi)并用刮刀輕刮卵泡內(nèi)壁，收集帶有顆粒細(xì)胞的DPBS，1 400 r/min離心7min，棄上清，-80℃保存。

1.3.2 免疫組織化學(xué) 將采集的大中小卵泡放入4%多聚甲醛中固定24 h，經(jīng)過(guò)脫水、透明、浸蠟和包埋后制成6 μm的切片，然后按照Rabbit HRP Kit（DAB）試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)切片進(jìn)行免疫組化，其中FoxO1抗體以1:100的比例進(jìn)行稀釋，一抗4℃孵育并過(guò)夜（12～16 h），同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，F(xiàn)oxO1抗體用PBS代替。DAB顯色成功后，自來(lái)水沖洗終止顯色，蘇木精復(fù)染60 s，自來(lái)水反藍(lán)，經(jīng)過(guò)脫水透明后用中性樹(shù)脂封片，最后使用Olympus生物顯微鏡進(jìn)行鏡檢觀察并拍照。

1.3.3 綿羊卵泡顆粒細(xì)胞總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 將大中小卵泡顆粒細(xì)胞從-80℃取出，按照Trizol法分別提取大中小卵泡顆粒細(xì)胞的總RNA。之后用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度。

按照Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser說(shuō)明合成cDNA鏈。第一步：向離心管中加入1 μL gDNA Eraser、2 μL 5×g DNA Eraser Buffer、1 μL總RNA、6 μL RNase Free dH2O，充分混勻后，置于PCR儀，反應(yīng)條件為42℃ 2 min；去除gDNA。然后再加入1 μL Prime Script RT Enzyme Mix Ⅰ，4 μL 5×Prime Script BufferⅡ，1 μL RT Prime Mix，4 μL RNase Free dH2O，混勻后，置于PCR儀，反應(yīng)條件為37℃ 15min；85℃ 5 s；-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 引物設(shè)計(jì)與合成FoxO1引物來(lái)自參考文獻(xiàn)[20]；以18S基因作為內(nèi)參基因，引物均由華大基因合成，引物序列見(jiàn)表1。

1.3.5 qRT-PCR 以之前合成的cDNA為模板，根據(jù)TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒的說(shuō)明，建立20 μL的反應(yīng)體系：擴(kuò)增基因的上、下游引物各0.8 μL(0.4 μmol/L)，TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(2X)10 μL，cDNA模板1 μL，RNase Free dH2O 7.4 μL。反應(yīng)條件：95℃ 30 s（預(yù)變性階段）；95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 15 s，共45個(gè)循環(huán)（PCR反應(yīng)階段）；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃15 s（熔解曲線階段）。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.3.6 綿羊卵泡顆粒細(xì)胞總蛋白的提取和Western Blotting

1.3.6.1 總蛋白的提取 將PMSF和RIPA裂解液以1:100的比例混勻，必須現(xiàn)配現(xiàn)用。將配好的溶液分別加入盛有大中小卵泡顆粒細(xì)胞的離心管中。冰上靜置30 min，4℃ 10 000×g離心5 min，取上清，測(cè)蛋白濃度并于-80℃保存。

1.3.6.2 Western Blotting 根據(jù)SDS-PAGE凝膠制備試劑盒說(shuō)明和所測(cè)蛋白的分子量大小，制備8%的分離膠和5%的濃縮膠。根據(jù)所測(cè)蛋白的濃度計(jì)算蛋白上樣量。蛋白和蛋白示蹤上樣緩沖液以4:1的比例混勻，之后在100℃的金屬浴中變性5 min。點(diǎn)樣后80 V 30 min濃縮膠電泳；120 V 100 min分離膠電泳。電泳完畢后，將所需的膠切下，剪取與膠大小一致的NC膜，按照“黑板+海綿+濾紙+膠+NC膜+濾紙+海綿+白板”順序放好，裝入轉(zhuǎn)膜槽，100 V 90 min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將NC膜放在盛有5%的封閉蛋白干粉溶液中封閉1 h。封閉結(jié)束后，進(jìn)行一抗孵育，4℃過(guò)夜，F(xiàn)oxO1兔單克隆抗體和TBST以1:900的比例稀釋，β-actin兔多克隆抗體和TBST以1:12 000的比例稀釋。一抗孵育結(jié)束后用TBST洗3次，每次10 min。熒光二抗室溫孵育1 h，注意避光，熒光二抗和TBST以1:18 000的比例稀釋，結(jié)束后用TBST洗3次，每次10 min，再用TBS洗10 min。使用Odyssey CLx對(duì)NC膜進(jìn)行曝光。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的mRNA表達(dá)量，各基因表達(dá)量均經(jīng)內(nèi)參18S校正。Western blotting檢測(cè)結(jié)果用Image J軟件分析。所有數(shù)據(jù)至少重復(fù)3次。采用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)分析，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用Graphpad Prism 7.0（Monrovia，美國(guó)）軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 FoxO1在綿羊大、中、小卵泡中的免疫組織化學(xué)定位分析 綿羊卵巢卵泡經(jīng)過(guò)FoxO1免疫組織化學(xué)定位，結(jié)果如圖1所示，F(xiàn)oxO1蛋白在綿羊卵巢卵泡中有表達(dá)，在實(shí)驗(yàn)組中，陽(yáng)性著色良好，呈黃色或者較深的棕黃色（圖1-A、1-B、1-C）。同時(shí)，陰性對(duì)照中無(wú)特異性著色（圖1-a、1-b、1-c）。與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照區(qū)集中在顆粒細(xì)胞層，說(shuō)明FoxO1蛋白在綿羊卵巢卵泡顆粒細(xì)胞中表達(dá)。另外，可以發(fā)現(xiàn)中卵泡的陽(yáng)性染色最強(qiáng)，小卵泡次之，大卵泡的陽(yáng)性染色最弱，幾乎沒(méi)有。

2.2 綿羊大、中、小卵泡顆粒細(xì)胞中FoxO1mRNA表達(dá)如圖2所示，中卵泡內(nèi)FoxO1mRNA的表達(dá)量高于小卵泡與大卵泡（P＜0.01），小卵泡FoxO1mRNA的表達(dá)量高于大卵泡（P＜0.01）。

2.3 綿羊大、中、小卵泡顆粒細(xì)胞中FoxO1蛋白表達(dá)用Western blotting檢測(cè)FoxO1的表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FoxO1在不同大小的卵泡中的表達(dá)量不同（圖3-A），中卵泡的條帶較粗較濃。經(jīng)過(guò)對(duì)其進(jìn)行灰度值分析（圖3-B）可發(fā)現(xiàn)，大卵泡的FoxO1蛋白表達(dá)量與中卵泡和小卵泡存在極顯著差異，而小卵泡和中卵泡的FoxO1蛋白表達(dá)量差異不顯著。

3 討 論

哺乳動(dòng)物卵巢內(nèi)卵泡發(fā)育過(guò)程受到多種內(nèi)分泌、旁分泌、自身調(diào)節(jié)因子以及環(huán)境的協(xié)同作用。綿羊卵泡的發(fā)育是以卵泡波的形式進(jìn)行，綿羊每個(gè)卵泡波是以1個(gè)或1組卵泡直徑從3 mm生長(zhǎng)到大于等于5 mm的過(guò)程[19]。一個(gè)卵泡波由募集期（生長(zhǎng)卵泡池中的一部分卵泡率先生長(zhǎng)）、選擇期（大多數(shù)卵泡閉鎖退化，只有少數(shù)繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程）和優(yōu)勢(shì)期（在被選擇的卵泡中有一個(gè)或幾個(gè)能夠快速發(fā)育到排卵而其他卵泡的發(fā)育受到抑制的過(guò)程）組成。據(jù)研究報(bào)道，將綿羊卵泡按直徑大小劃分為小卵泡（直徑≤3 mm）、中卵泡（3 mm＜直徑＜5 mm）、大卵泡（直徑≥5 mm）[17]，小卵泡可看作卵泡發(fā)育的募集期，中卵泡可看作卵泡發(fā)育的選擇期，大卵泡可看作卵泡發(fā)育的優(yōu)勢(shì)期[18]。FoxO1已經(jīng)在多種哺乳動(dòng)物的卵泡中被定位[11]，同時(shí)在小鼠[12]、大鼠[8]、豬[13]、牛[14]的卵泡顆粒細(xì)胞上檢測(cè)到FoxO1的表達(dá)。本研究在綿羊卵泡顆粒細(xì)胞上也檢測(cè)到FoxO1的表達(dá)。

FoxO1在顆粒細(xì)胞的增殖、卵泡的發(fā)育、閉鎖和黃體化中扮演重要角色[21]。據(jù)研究報(bào)道，F(xiàn)oxO1在小鼠、豬、牛的卵泡顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞上都有表達(dá)，在牛的卵母細(xì)胞上也檢測(cè)到了FoxO1的表達(dá)[11]。丁威[22]用抗FoxO1抗體對(duì)二花臉豬卵巢組織進(jìn)行免疫組化時(shí)，發(fā)現(xiàn)FoxO1在卵泡的顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞胞質(zhì)中都有表達(dá)。而本研究免疫組化結(jié)果顯示FoxO1只在卵泡顆粒細(xì)胞層表達(dá)，這說(shuō)明FoxO1的表達(dá)可能具有物種差異性。另外，本研究熒光定量和Western blotting的結(jié)果表明，F(xiàn)oxO1在中卵泡顆粒細(xì)胞中表達(dá)量最高，小卵泡顆粒細(xì)胞次之，大卵泡顆粒細(xì)胞表達(dá)最少，這提示FoxO1在顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡中可能起著重要作用。申明[12]和李然[23]在過(guò)表達(dá)FoxO1后都發(fā)現(xiàn)小鼠卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡水平顯著增加。Gebremedhn等[14]用FoxO1siRNA轉(zhuǎn)染牛顆粒細(xì)胞后FoxO1mRNA水平和FoxO1蛋白水平都顯著降低，同時(shí)會(huì)促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖，這表明FoxO1在牛顆粒細(xì)胞增殖中有重要作用。李烈川[13]用過(guò)氧化氫處理豬卵泡顆粒細(xì)胞0～6 h后，發(fā)現(xiàn)FoxO1磷酸化水平的變化和細(xì)胞自噬活性的變化相一致，說(shuō)明FoxO1可能參與了豬卵泡自噬的調(diào)節(jié)。申明[12]研究也表明FoxO1在氧化應(yīng)激引起的小鼠卵泡顆粒細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了關(guān)鍵的促凋亡效應(yīng)。這些都表明FoxO1對(duì)顆粒細(xì)胞的調(diào)控作用。近年來(lái)，研究表明FoxO1作為一種腫瘤抑制因子參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[24-25]。其中，Zhang等[25]研究發(fā)現(xiàn)戈舍瑞林可能通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路上調(diào)FoxO1蛋白的表達(dá)來(lái)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡。以上都表明了FoxO1在細(xì)胞中的促凋亡作用。本研究FoxO1在中卵泡顆粒細(xì)胞中高表達(dá)，而中卵泡又是決定卵泡走向閉鎖或是走向優(yōu)勢(shì)卵泡的關(guān)鍵階段，說(shuō)明FoxO1在這個(gè)階段發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。結(jié)合前人的研究分析，F(xiàn)oxO1可能促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡，而顆粒細(xì)胞的凋亡是導(dǎo)致卵泡發(fā)生閉鎖的重要原因[26]，因此，F(xiàn)oxO1在卵泡發(fā)育中有重要作用。

卵泡不僅存在卵泡直徑的分級(jí)還有類固醇激素生成量變化的不同，隨著卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育卵泡內(nèi)的雌激素不斷增多，卵泡直徑與其卵泡液中的雌激素水平呈顯著正相關(guān)[27]。陳阿琴[19]用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)湖羊卵泡中雌二醇濃度，發(fā)現(xiàn)綿羊的成熟卵泡（＞5 mm）卵泡液中的雌二醇濃度與生長(zhǎng)卵泡（3～5 mm）相比顯著增高。另外，本實(shí)驗(yàn)室前期工作已證明綿羊大卵泡內(nèi)雌激素含量顯著高于中卵泡[18]。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大卵泡的FoxO1表達(dá)量顯著低于中卵泡，這說(shuō)明卵泡由中卵泡發(fā)育到大卵泡的這個(gè)階段，F(xiàn)oxO1可能與雌激素的生成有關(guān)。而且已有研究表明，F(xiàn)oxO1會(huì)降低小鼠體內(nèi)CYP19A1mRNA的表達(dá)[28]，而CYP19A1是雌激素合成的關(guān)鍵酶[29]，所以FoxO1有可能通過(guò)CYP19A1調(diào)控雌激素的合成。但Richards等[6]研究表明，大鼠體內(nèi)注射雌激素后，大鼠卵泡顆粒細(xì)胞中FoxO1mRNA和蛋白的表達(dá)增加。這說(shuō)明雌激素會(huì)促進(jìn)FoxO1的表達(dá)，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相矛盾，可能是由于不同物種間存在差異性，或者有其他分子機(jī)制的影響。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以初步判斷FoxO1在綿羊卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要作用，但是FoxO1對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，綿羊卵泡顆粒細(xì)胞中有FoxO1的表達(dá)，且在卵泡的不同發(fā)育階段FoxO1的表達(dá)量不同，大卵泡中的表達(dá)量極顯著低于小卵泡和中卵泡，提示FoxO1可能參與綿羊卵泡發(fā)育的調(diào)控。