邵慧靜，王天俊，張嘉嘉，楊娜娜，孫麗洲

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科，江蘇 南京 210029

子癇前期（preeclampsia）是一種妊娠期特有疾病，主要表現(xiàn)為妊娠20周后出現(xiàn)高血壓并伴隨有蛋白尿，嚴(yán)重危害母兒健康［1］，如不及時管理，母體可能會出現(xiàn)高血壓、腎損傷、肝損傷、中樞神經(jīng)損傷、卒中、心肌病、肺水腫等并發(fā)癥，胎兒則有發(fā)生宮內(nèi)生長受限、胎盤早剝、早產(chǎn)、新生兒呼吸窘迫征等并發(fā)癥的風(fēng)險。目前子癇前期的發(fā)病機制尚不清楚，普遍認(rèn)為胎盤占中心地位，唯一的解決辦法是盡早終止妊娠［2］。妊娠初期，滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲子宮內(nèi)膜和淺肌層，重塑螺旋動脈，使其由高阻低流型轉(zhuǎn)化為低阻高流型，從而提供胎兒生長發(fā)育的供血需求［3］。而在子癇前期患者的胎盤中，出現(xiàn)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲不足，部分螺旋動脈重塑失敗，未轉(zhuǎn)化的螺旋動脈出現(xiàn)動脈粥樣硬化等病理改變［4］。

隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜（LC?MS/MS）技術(shù)為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究提供了有力工具，在尋找與特定疾病相關(guān)的蛋白、多肽、小分子代謝物過程中發(fā)揮了重要作用［5］。多肽組學(xué)就是以質(zhì)譜技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的一門全面研究內(nèi)源性多肽結(jié)構(gòu)、功能及變化規(guī)律的學(xué)科，是目前的熱點研究領(lǐng)域。內(nèi)源性多肽是指相對分子質(zhì)量小于10 kDa的小分子物質(zhì)，大多來自蛋白的降解，也可由基因直接翻譯而來［6］。此前認(rèn)為多肽僅僅是降解產(chǎn)物而無生物學(xué)活性，但越來越多的研究表明這些內(nèi)源性多肽也能引起相應(yīng)新陳代謝活動的改變，因此多肽組學(xué)研究對于了解疾病發(fā)生機制、標(biāo)志物篩選及治療具有重要意義，已廣泛應(yīng)用于多種疾病如肥胖、糖尿病、腫瘤的研究［7-9］。在子癇前期的多肽組學(xué)研究中，目前已有子癇前期血清、尿液以及羊水多肽組學(xué)，為了解子癇前期的發(fā)病以及尋找特異性標(biāo)志物提供了重要的線索［10-12］。而胎盤作為子癇前期發(fā)病的起源器官，在多肽組學(xué)的水平上還未被研究。本文利用LC?MS/MS技術(shù)研究了子癇前期胎盤樣本中多肽組的特征性變化，并通過體外研究發(fā)現(xiàn)了來自差異多肽405SPLFMGKVVNPTQK418對滋養(yǎng)細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響，為子癇前期發(fā)病機制研究以及治療提供了支持。

1 材料和方法

1.1 材料

選擇2019 年5—9 月在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科住院分娩孕婦8 例，其中4 例正常足月妊娠，4例子癇前期病例。參照《婦產(chǎn)科學(xué)》第8版教材對子癇前期的診斷，即妊娠20 周后出現(xiàn)收縮壓≥140 mmHg 和/或舒張壓≥90 mmHg，伴尿蛋白陽性?；驘o蛋白尿但合并以下任何一項者：血小板減少；肝功能異常；腎功能損害；肺水腫；新發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常或視覺障礙。同時排除既往患高血壓、糖尿病、甲狀腺功能異常、妊娠期肝內(nèi)膽汁瘀積癥、肝臟以及腎臟疾病等合并癥的孕婦。研究對象均無吸煙史以及長期服藥史。所有患者均為剖宮產(chǎn)，分娩后留取胎盤組織并迅速轉(zhuǎn)運至液氮保存。本研究獲得南京醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書并同意自愿捐獻少許胎盤組織標(biāo)本。

離心超濾管（Millipore公司，美國）；純水、乙腈、甲酸、三氟乙酸（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）；碳酸氫銨（Sigma 公司，美國）；胎牛血清、ECM培養(yǎng)基（Sciencell公司，美國）；DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶?EDTA、PBS 緩沖液（Gibco 公司，美國）；CCK?8試劑盒、BCA 試劑盒（南京諾唯贊生物技術(shù)公司）；Matrigel基質(zhì)膠（Corning公司，美國）；抗MMP?2兔一抗（武漢Proteintech 公司）、抗TIMP1 兔一抗、抗GAPDH鼠一抗（Abcam公司，美國）。辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；多肽委托上?？齐纳锟萍加邢薰竞铣?，通過RPLC?MS 檢測其純度為95%以上；人絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞系（HTR8/SVneo）以及臍靜脈內(nèi)皮（HUVECs）細(xì)胞株購自美國ATCC細(xì)胞庫。

1.2 方法

1.2.1 樣本預(yù)處理

胎盤樣本采集后立即保存于液氮中。胎盤內(nèi)源性多肽的提取采用超濾離心法。具體操作流程如下：預(yù)冷研磨器具及其他需要接觸到樣品的工具，加入液氮進行研磨，將冷凍粉末轉(zhuǎn)移至EP 管中。在樣品粉末中加入2 mL 提取液（1%甲酸水溶液），冰上超聲10 min 裂解。超聲后，4 ℃，20 000g離心30 min，取上清。吸取200 μL 樣品溶液使用10 kDa超濾管10 000g下超濾至20 μL，添加100 μL 50 mmol/L 碳酸氫銨，繼續(xù)超濾至20 μL，收集濾過液體，舍棄超濾管中分子量大于10 kDa的蛋白等大分子。使用200 μL 0.1% TFA，80% 乙腈活化除鹽柱。使用400～600 μL 0.1%TFA，1%乙腈溶液平衡除鹽柱。將樣品加入除鹽柱內(nèi)，使樣品緩慢流過除鹽柱，多肽被除鹽柱捕集，鹽等其他非疏水性小分子流出舍棄。再添加200 μL 0.1%三氟乙酸，0.5%乙腈溶液清洗除鹽柱，洗去殘留鹽類，添加300 μL 0.1%三氟乙酸，80%乙腈溶液，使液體緩慢流過除鹽柱，將多肽洗脫下來，使用新EP管收集洗脫溶液，洗脫液冷凍干燥。

1.2.2 LC?MS/MS分析

色譜條件：采用NanoAcuity 超高壓納升級液相色譜系統(tǒng)進行分離。液相A 液為0.1%甲酸?水溶液，B液為0.1%甲酸?乙腈溶液。樣品以200 μL A相溶解，由自動進樣器吸取2 μL樣品后，以10 μL/min流速傳送到捕集柱上捕集2 min。捕集柱上的樣品在分析柱上進行色譜分離，流速為300 nL/min。相關(guān)液相梯度為0～105 min，B 液線性梯度從5% 到30%；105～110 min，B 液線性梯度從30% 到90%；110～112 min，B 液維持在90%；112～113 min，B 液線性梯度從90%到5%；B液保持5%7 min。樣本間用空白溶劑30 min流動相梯度清洗1次。

質(zhì)譜條件：Q Exative HF 質(zhì)譜儀離子源噴霧電壓為2.0 kV，加熱毛細(xì)管設(shè)定為300 ℃，采用數(shù)據(jù)依賴模式自動在MS 和MS/MS 間切換采集。全掃描MS 使用Orbitrap 進行一級掃描，掃描范圍為m/z 350～1 600，分辨率設(shè)定為60 000（m/z 200處）。離子最大引入時間為50 ms，自動增益控制（automatic gain control，AGC）設(shè)定為3×106，隨后使用高能碰撞解離（higher energy C?trap dissociation，HCD）對符合串級（MS/MS）碎裂條件的強度前10 名母離子進行碎裂并用orbitrap 進行掃描，掃描分辨率設(shè)定為15 000。掃描范圍根據(jù)母離子質(zhì)荷比自動控制，最低掃描范圍固定為m/z=100處，最高到2 000。進行MS/MS的最低離子強度值設(shè)定為50 000。MS/MS時離子最大引入時間為100 ms，AGC 控制設(shè)定為2.0×105，母離子選擇窗口設(shè)定為2 Da。對于2、3、4電荷數(shù)的離子進行MS/MS采集，動態(tài)排除設(shè)定為每個母離子在10 s 內(nèi)進行1 次MS/MS，之后排除30 s，30%的碰撞能量。

1.2.3 質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索分析

Q Exative HF 質(zhì)譜儀所采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)利用MaxQuant（Version 1.6.5.0）進行搜索，檢索數(shù)據(jù)庫為SwissProt數(shù)據(jù)庫（種屬：Homo sapiens，包含20 422條reviewed序列）。檢索參數(shù)設(shè)置為：甲硫氨酸殘基和天冬酰胺殘基為可變修飾；無酶切；一級質(zhì)譜精度（4.5 ppm）；二級質(zhì)譜精度（20 ppm）。多肽篩選門檻設(shè)定如下：假陽性率（false discovery rate，F(xiàn)DR）小于1%；蛋白最少匹配1條獨有肽段（unique peptides）；肽段最少包含7個氨基酸。多肽定量采用MaxQuant軟件（version 1.6.5.0）及iBAQ算法，F(xiàn)DR設(shè)置為0.01。

1.2.4 生物信息學(xué)和統(tǒng)計學(xué)分析

利用在線工具（http：//web.expasy.org/compute）分析多肽的分子量和等電點分布情況。并利用GO（http：//geneontology.org）和 KEGG（http：//www.ge?nome.jp/kegg）分別對差異肽段匹配的蛋白質(zhì)進行功能富集分析和通路富集分析。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)及多肽處理

HTR?8/SVneo 在含有10% FBS 的DMEM 中培養(yǎng)。HUVECs 在含有10% FBS 的ECM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。兩者均置于37 ℃、5%CO2的潮濕恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。多肽干粉用高壓蒸餾水溶解至終濃度為10 mmol/L 保存，使用前稀釋至相應(yīng)濃度。本實驗中，實驗組用50 μmol/L 濃度的多肽處理，對照組加入等量的高壓蒸餾水，隨后兩組同時置于37 ℃、5%CO2的潮濕恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h 以待后續(xù)實驗。

1.2.6 CCK?8法測定細(xì)胞增殖能力

多肽處理HTR?8/SVneo 細(xì)胞24 h 后，10%FBS DMEM重懸細(xì)胞并將細(xì)胞接種到96孔板，每組設(shè)置5 個重復(fù)反應(yīng)孔，每孔2 000 個細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)0、24、48、72、96 h后分別加入10 μL CCK?8試劑，孵育2 h后在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光度。實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.7 克隆形成實驗

多肽處理HTR?8/SVneo 細(xì)胞24 h 后，10%FBS DMEM 重懸細(xì)胞。隨后將細(xì)胞接種到6 孔板中，每組設(shè)置3 個重復(fù)孔，每孔600 個細(xì)胞，10%FBS DMEM 完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)10 d。10 d 后，PBS 洗滌細(xì)胞3次，甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色。隨后在倒置顯微鏡下隨機取3個視野進行克隆計數(shù)。實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.8 Transwell實驗

多肽處理HTR?8/SVneo 細(xì)胞24 h 后，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，隨后將細(xì)胞加入Transwell 小室，每組3個重復(fù)實驗孔，每孔3×104個細(xì)胞。下室加入10%FBS DMEM 培養(yǎng)基，放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h。終止培養(yǎng)后，棉簽擦去上室未穿膜細(xì)胞，甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色。倒置顯微鏡100 倍視野下隨機取5 個視野對穿膜細(xì)胞進行統(tǒng)計，并取平均值進行分析。實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.9 HUVECs細(xì)胞成管實驗

多肽處理HUVECs細(xì)胞24 h后，10%FBS ECM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將基質(zhì)膠提前置于4 ℃融化，96孔板中每孔鋪膠50 μL 后放至37 ℃培養(yǎng)箱孵育40 min以上。然后將細(xì)胞均勻鋪入含基質(zhì)膠的96孔板中，每組3 個實驗重復(fù)孔，每孔3×104個細(xì)胞。培養(yǎng)6～12 h 后置于倒置顯微鏡100 倍視野下觀察，計數(shù)管腔形成數(shù)量。實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.10 qPCR

TRIzol 提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 后，采用聚合酶鏈反應(yīng)進行目的基因的擴增。引物序列如下：MMP2：5′?GCTCAGATCCGTGGTGAGAT?3′（正向），5′?GGTGCTGGCTGAGTAGATCC?3′（反向）；TIMP1：5′?AATTCCGACCTCGTCATCAG?3′（正向），5′?GTT?GTGGGACCTGTGGAAGT?3′（反向）；GAPDH：5′?GACTCATGACCACAGTCCATGC?3′（正向），5′?AGAGGCAGGGATGATGTTCTG?3′（反向）。最終結(jié)果以2-ΔΔCt計算。

1.2.11 Western blot

RIPA裂解液裂解細(xì)胞并提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，隨后上樣進行SDS?PAGE 電泳。然后將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉溶液封閉液封閉1 h，4 ℃孵育一抗過夜（抗MMP2一抗、抗TIMP1一抗、抗GAPDH一抗?jié)舛染鶠?∶1 000），后室溫孵育二抗1 h（二抗?jié)舛葹?∶5 000），洗膜后ECL 發(fā)光法顯影。使用Image J 對條帶進行半定量灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0和Graphpad prism8.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胎盤樣本臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計

對納入研究的孕婦年齡、體重指數(shù)（body mass index，BMI）、孕周、收縮壓、舒張壓、蛋白尿、胎兒出生體重、Aparg評分等臨床信息進行統(tǒng)計（表1）。

表1 胎盤樣本的臨床信息Table 1 Clinical characteristics between preeclampsia and healthy pregnancies（）

表1 胎盤樣本的臨床信息Table 1 Clinical characteristics between preeclampsia and healthy pregnancies（）

2.2 胎盤樣本多肽組分的質(zhì)譜分析

通過LC?MS/MS 共鑒定了3 582個多肽片段，來源于499個蛋白。檢測到的肽段分子量主要分布在1 000～1 800 Da（圖1A）；肽段等電點主要分布在8.0～11.0（圖1B）；結(jié)合分子量的因素來看，肽段的分布并不均勻，主要集中在等電點為10.0左右的區(qū)域（圖1C）。

圖1 液相色譜?質(zhì)譜鑒定的胎盤多肽性質(zhì)分析Figure 1 Characteristics of placental peptide identified by liquid chromatography?tandem mass spectrometry（LC?MS/MS）

2.3 差異性多肽鑒定與篩選

利用統(tǒng)計學(xué)方法篩選差異多肽，差異多肽篩選標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05 且Fold?change 值<0.83 或者>1.2，共篩選出48條差異多肽。其中18條多肽在子癇前期中上調(diào)，30條多肽在子癇前期中下調(diào)（表2）。

表2 多肽差異性表達(dá)Table 2 Differentially expressed peptides secreted from normal and preeclamptic placentas

2.4 胎盤差異性多肽所匹配蛋白質(zhì)的生物學(xué)分析

2.4.1 GO功能分析

通過在線數(shù)據(jù)庫對差異多肽所對應(yīng)的前體蛋白質(zhì)進行功能注釋分析（圖2）。結(jié)果表明，這些前體蛋白的功能類別主要涉及分子的結(jié)合，包括蛋白結(jié)合、DNA 與RNA 結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合以及有機環(huán)狀化合物的結(jié)合，此外還涉及抗氧化以及分子載體的功能。這些蛋白多數(shù)位于細(xì)胞質(zhì)中，還有一部分位于細(xì)胞外以及細(xì)胞核中。所參與的生物學(xué)過程主要包括代謝、基因表達(dá)調(diào)節(jié)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運、生物合成以及免疫應(yīng)答等。

圖2 差異多肽所匹配的蛋白質(zhì)的GO分析Figure 2 GO analysis of the differential peptide matched proteins

2.4.2 KEGG信號通路分析

對差異多肽的前體蛋白進行KEGG信號通路分析，結(jié)果顯示這些蛋白質(zhì)主要富集在凝血（coagula?tion cascade）、補體（complement cascade）和血小板激活（platelet activation）通路中。其中涉及AIAT 蛋白（又稱SERPINA）、FIBA 蛋白（又稱FGA）以及Ac?tin蛋白。

2.5 差異多肽405SPLFMGKVVNPTQK418的體外功能實驗

選擇了下調(diào)多肽405SPLFMGKVVNPTQK418進行研究，該多肽是SERPINA1 蛋白的C 端多肽，含有14 個氨基酸。根據(jù)此前研究報道，SERPINA1 在子癇前期孕婦的血清、尿液以及胎盤中表達(dá)上調(diào)。因此猜測，SERPINA1 以及其多肽可能在子癇前期的發(fā)病過程中發(fā)揮一定作用。而絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞功能減退以及螺旋動脈重塑不足是子癇前期的主要發(fā)病因素，因此在滋養(yǎng)細(xì)胞以及臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中研究該多肽的作用。

2.5.1 差異多肽405SPLFMGKVVNPTQK418對滋養(yǎng)細(xì)胞增殖以及遷移能力的影響

與對照組相比，多肽處理后的HTR?8/SVneo 細(xì)胞增殖能力顯著增加（P<0.01，圖3A）?？寺⌒纬蓪嶒炞C實多肽處理后，HTR?8/SVneo 細(xì)胞生長活力較空載對照組增加（P<0.01，圖3B）。此外，Tran?swell 實驗證明了多肽處理后的HTR?8/SVneo 細(xì)胞較空載對照組的遷移能力增加（P<0.01，圖3C）。

圖3 多肽處理HTR?8/SVneo細(xì)胞后CCK?8、克隆形成及遷移實驗結(jié)果Figure 3 Effects of peptide on the proliferation and migration capacity of HTR?8/SVneo cells detected by CCK?8，colony formation assay and transwell assays

2.5.2 差異多肽405SPLFMGKVVNPTQK418能夠促進臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞管狀形成

與空載對照組相比，多肽處理后HUVECs的管狀形成能力顯著增加（P<0.01，圖4）。

圖4 多肽處理HUVECs 細(xì)胞后對其管狀形成能力影響（×100）Figure 4 Effects of peptide on the tube formation capaci?ty of HUVECs（×100）

2.5.3 差異多肽405SPLFMGKVVNPTQK418處理后HTR?8/SVneo細(xì)胞中MMP2和TIMP1的表達(dá)

qPCR 以及Western blot 結(jié)果顯示，差異多肽處理后的HTR?8/SVneo細(xì)胞中MMP2的基因及蛋白水平明顯上調(diào)，而TIMP1 的基因以及蛋白水平則明顯下調(diào)（P<0.01，圖5）。

圖5 多肽處理后HTR?8/SVneo細(xì)胞中MMP2蛋白以及TIMP1 mRNA以及蛋白的表達(dá)情況Figure 5 Expression of MMP2 and TIMP1 in HTR?8/SVneo cells after peptide treatment

3 討論

本研究首次以子癇前期胎盤為樣本進行多肽組學(xué)層面的研究，通過對子癇前期以及正常孕婦胎盤樣本的內(nèi)源性多肽組的分析，篩選出了48條差異性多肽。這些差異多肽反映了子癇前期狀態(tài)下胎盤內(nèi)蛋白的合成、加工和降解過程的變化，因此我們對這些差異多肽的前體蛋白進行GO功能分析以及KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)這些前體蛋白主要與補體、凝血以及血小板激活通路密切相關(guān)，為子癇前期發(fā)病機制的研究提供了方向以及依據(jù)。此外，多肽往往在臨床癥狀出現(xiàn)之前就已經(jīng)發(fā)生變化，因此可以將胎盤差異多肽與此前子癇前期尿液、血液以及羊水差異多肽聯(lián)合分析，尋找特異性生物標(biāo)志物以提高對子癇前期早期診斷率。

此外，多肽雖為蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)物且結(jié)構(gòu)簡單，但近年來研究發(fā)現(xiàn)多個具有抗菌抗癌作用的多肽［13］。此前還發(fā)現(xiàn)多肽對于基因表達(dá)、物質(zhì)代謝有調(diào)節(jié)作用，比如，早期研究認(rèn)為C肽（含有31個氨基酸）無生物學(xué)活性，且由于其不通過肝酶代謝，清除緩慢，將C 肽作為臨床判斷胰島β細(xì)胞功能的良好指標(biāo)。但近年來多項基礎(chǔ)以及臨床研究發(fā)現(xiàn)C肽具有重要的生物活性作用，如可以調(diào)節(jié)糖代謝，改善糖尿病微血管病變以及糖尿病神經(jīng)病變［14］。本研究在差異多肽中挑選了來自SERPINA1蛋白的C端多肽405SPLFMGKVVNPTQK418，該多肽位于SERPI?NA1 的C 端末端，由最后的14 個氨基酸組成，此前未有相關(guān)研究報道。而其前體蛋白SERPINA1被報道在子癇前期的尿液、血液以及胎盤中表達(dá)上調(diào)，表明該多肽有參與子癇前期發(fā)病的可能［15］。通過體外功能實驗發(fā)現(xiàn)該多肽確實能促進滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、遷移以及臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的血管形成，由此推測該多肽在子癇前期的發(fā)病中起保護性作用。

MMPs是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的金屬蛋白水解酶，TIMPs 為體內(nèi)細(xì)胞分泌的一類能夠選擇性抑制MMPs活性的家族蛋白。在正常妊娠過程中兩者相互作用、相互制約以維持胎盤的正常功能。子癇前期的發(fā)病過程中，MMPs 以及TIMPs 發(fā)生異常表達(dá)，相關(guān)的發(fā)病機制涉及滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移侵襲以及血管內(nèi)皮功能失調(diào)。Li 等［16］檢測子癇前期大鼠模型中MMPs 所對應(yīng)底物的變化，發(fā)現(xiàn)與正常妊娠大鼠相比，子癇前期模型大鼠的胎盤以及主動脈中的膠原含量增加，從而阻礙滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移和侵襲。此外，MMPs 可以將大分子內(nèi)皮素降解為ET1?32，后者具有舒張血管的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，與正常妊娠大鼠相比，子癇前期模型大鼠中的MMPs 以及ET1?32表達(dá)減少，從而使其介導(dǎo)的血管舒張作用減少，導(dǎo)致血管收縮和血壓增高［17］。本研究通過qPCR以及Western blot方法發(fā)現(xiàn)多肽405SPLFMGKV?VNPTQK418處理后的滋養(yǎng)細(xì)胞中MMP2 表達(dá)量上調(diào)，而TIMP1表達(dá)量下調(diào)，說明差異多肽405SPLFMG?KVVNPTQK418可能通過促進滋養(yǎng)細(xì)胞的生長和侵襲以及保護血管內(nèi)皮功能而起到緩解子癇前期發(fā)生發(fā)展的作用。

但子癇前期的發(fā)病是多種因素共同作用的結(jié)果，本研究也僅通過體外實驗初步探究了子癇前期胎盤多肽的變化以及差異多肽的潛在功能。多肽影響子癇前期發(fā)病的具體機制以及其他胎盤差異多肽的生物活性還需進一步研究。此外，本研究在選擇臨床樣本時主要考慮了子癇前期這一變量因素，而忽略了孕周對于多肽組學(xué)可能的潛在影響，存在對照組以及子癇前期組孕周不匹配的情況。因此在未來研究中，將會選取更加合適的對照組，如孕周為非足月臀位破水剖宮產(chǎn)（排除感染因素）以及非足月前置胎盤伴出血剖宮產(chǎn)進行研究。從而為子癇前期發(fā)病機制研究以及子癇前期的治療提供更多有效的線索。