樊素珍，趙書君，秦巧紅，郜翔，王寶金，李紅雨

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院 婦科，河南 鄭州 450000)

卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率次于子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌而列居第三位，但其死亡率卻高居?jì)D科惡性腫瘤首位[1-2]。卵巢癌發(fā)病隱匿且病情進(jìn)展迅速，大多數(shù)患者確診時(shí)已是晚期，此時(shí)臨床治療困難，預(yù)后差，患者長期生存率低，對婦女生命健康造成極大威脅[3]。竹節(jié)香附為多被銀蓮花的干燥根莖，具有明顯的抗腫瘤、抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛等作用，其中竹節(jié)香附素A(RA) 的抗腫瘤活性成分可抑制胃癌細(xì)胞株BGC-823 的增殖、遷移侵襲[4]，并可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡、抑制肝癌細(xì)胞血管生成，增強(qiáng)其化療敏感性[5]，因而RA可能對卵巢癌SKOV3 細(xì)胞增殖及侵襲具有抑制作用。JAK/STAT3 通路在多種癌癥中處于異常的高激活狀態(tài)，且與臨床的不良預(yù)后有關(guān)，因此抑制該通路激活，可直接抑制腫瘤細(xì)胞生長，增強(qiáng)抗腫瘤免疫功能，進(jìn)而提高臨床療效[6]。另外，JAK/STAT3 通路還與化療藥物耐藥性相關(guān)，抑制其激活，可降低乳腺癌細(xì)胞的耐藥性[7]。在對胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，RA 抑制胃癌細(xì)胞BGC-823 中STAT3 信號的激活[4]，但RA 對卵巢癌SKOV3 細(xì)胞中JAK/STAT3 通路的影響目前尚不清楚，本文通過體外培養(yǎng)卵巢癌SKOV3 細(xì)胞，研究RA 是否通過JAK/STAT3通路抑制卵巢癌SKOV3 細(xì)胞增殖和侵襲。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

卵巢癌細(xì)胞SKOV3，上海賓穗生物科技有限公司，貨號：BS-C00767533；竹節(jié)香附素A(RA)，中國藥品生物制品檢定所，批號：141113；順鉑( 純度：98.5%)，上海恒斐生物科技有限公司，批號：D8810；RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青鏈霉素混合液、PBS 緩沖液、胰蛋白酶-EDTA 消化液，美國Solarbio公司，貨號分別為：31800、11011-8611、P1400、P1022、T1300；AnnexinV/PI 凋亡檢測試劑盒，美國BD 公司，貨號：556547；兔源GAPDH 一抗、兔源Bax一抗、鼠源Bcl-2 一抗、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗，美國Cell Singaling Technology 公司，貨號分別為：PA5-85082、PA5-11378、13-8800、A-11029、A-11034； 兔源E-cadherin、Vimentin、JAK、p-JAK、STAT3、p-STAT3一抗，美國Abcam 公司，貨號分別為：ab76319、ab193555、ab133666、ab138005、ab68153、ab76315；結(jié)晶紫染色液、蛋白裂解液、CK-8 試劑盒、BCA 試劑盒，上海碧云天公司，貨號分別為：C0121、P0013K、C0037、P0011 等。

1.2 主要儀器

Elx800酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad 公司；Olympus CKX41顯微鏡購自德國Leica 公司；IBright CL 1500凝膠成像系統(tǒng)購自美國Thermo Fisher Scientific公司；CytoFLEX流式細(xì)儀購自美國貝克曼庫爾特公司；Centrifuge 5424R 低溫高速離心機(jī)購自德國Eppendorf 股份公司；Mini-PROTEAN Tetra 蛋白電泳儀、Trans-Blot Turbo 轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad 公司等。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

向RPMI-1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清、100 U/mL 青鏈霉素溶液，上下顛倒混勻得完全培養(yǎng)基，將購買的卵巢癌細(xì)胞SKOV3 解凍復(fù)蘇，以完全培養(yǎng)基培養(yǎng)重懸后，接種在25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5% CO2、95%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞在瓶底長至80%左右時(shí)，胰酶消化后，以1∶3 的比例傳代培養(yǎng)。

1.3.2 CK-8 實(shí)驗(yàn)

將RA 以RPMI-1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶解后配制為濃度90 μmol/L 的儲備液備用。使用1.3.1 中的傳代細(xì)胞接種于96 孔板中，密度約為0.6×105個/mL，培養(yǎng)24 h 后參照文獻(xiàn)[8]，以0、2、4、8、16 μmol/L 濃度的RA 處理，每個濃度設(shè)置5 個孔作為重復(fù)，繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h 后每孔加入CK-8 試劑，采用全自動酶標(biāo)儀檢測450 nm 波長下各孔吸光度值，計(jì)算每個濃度的RA對SKOV3 細(xì)胞的增殖抑制率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。公式：細(xì)胞增殖抑制率(%)=(NC 組吸光度- 實(shí)驗(yàn)組吸光度)/NC組吸光度×100%。

1.3.3 細(xì)胞活力檢測

取1.3.1 中的傳代細(xì)胞接種在96 孔板中，密度約為0.6×105個/mL，培養(yǎng)24 h 后隨機(jī)分為三組：不做任何處理(NC 組)、RA 組、順鉑組(PDD 組)，分別以16 μmol/LRA、5 μmol/LPDD[9]處 理48 h，按 照1.3.2中的方法測定各組吸光度，計(jì)算各組細(xì)胞的細(xì)胞活力，公式：細(xì)胞活力(%)= 藥物處理組吸光度/NC 組吸光度×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3.4 細(xì)胞凋亡檢測

取1.3.1 中的傳代細(xì)胞接種在12 孔板中，參照1.3.3中的方法分組處理48 h 后收集各組細(xì)胞，以PBS 重懸后計(jì)數(shù)，取約含有1×106個細(xì)胞的細(xì)胞懸液至做好組別標(biāo)記的無菌EP 管中，轉(zhuǎn)速1 000 r/min，離心半徑13.5 cm，離心5 min，以PBS 溶液漂洗細(xì)胞沉淀2 次，加 入500 μL Binding Buffer、10 μL AnnexinV-FITC 及5 μL PI 后，輕輕吹打細(xì)胞使之充分混勻，室溫，避光反應(yīng)15 min，轉(zhuǎn)速1 000r/min，離心半徑13.5 cm，離心5 min，細(xì)胞沉淀以PBS 溶液漂洗2 次后以PBS 重懸，輕輕吹打成為均勻的單細(xì)胞懸液，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，以Muticycle AV 軟件分析所得數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3.5 細(xì)胞遷移侵襲檢測

取1.3.1 中傳代細(xì)胞接種在12 孔板中，參照1.3.3中的方法分組處理12 h 后收集各組細(xì)胞，以細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的遷移力，各組細(xì)胞以完全培養(yǎng)基分別重懸后計(jì)數(shù)，以5×105個/mL 的密度接種于6 孔板中，使用無菌直尺做標(biāo)尺，以200 μL 槍頭在6 孔板中心劃一條直線，以PBS 漂洗干凈劃痕中的細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在顯微鏡隨機(jī)選取5 個視野觀察并拍照，計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)目，取平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

取1.3.1 中的傳代細(xì)胞接種在12 孔板中，參照1.3.3中的方法分組處理12 h 后收集各組細(xì)胞，以Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的侵襲力，各組細(xì)胞經(jīng)無血清的RPMI-1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別重懸后計(jì)數(shù)，調(diào)整密度為5×105個/mL，Transwell 上室以基質(zhì)膠包被后加入200 μL 上述細(xì)胞懸液，下室中加入完全培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2、95%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出小室，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，以PBS 漂洗后加入4% 多聚甲醛固定下室細(xì)胞，以結(jié)晶紫染液染色，在顯微鏡隨機(jī)選取5 個視野觀察并拍照，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)目，取平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3.6 免疫印跡實(shí)驗(yàn)

取1.3.1 中的傳代細(xì)胞接種在12 孔板中，參照1.3.3 中的方法分組處理48 h 后收集各組細(xì)胞，加蛋白裂解液( 含有蛋白酶抑制劑) 在冰浴中裂解2 h，轉(zhuǎn)速3 000 r/min，溫度為4℃，離心20 min，取上清提取總蛋白，以BCA 試劑盒測定蛋白濃度，具體按照說明書操作，調(diào)整各組細(xì)胞樣品液使蛋白濃度相同，各組細(xì)胞分別取20 μL 做SDS-凝膠電泳，轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維膜上，用5% 脫脂牛奶室溫封閉2 h，以相應(yīng)一抗、二抗孵育，以增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光法顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察蛋白條帶并拍照，采用Image Lab 軟件分析數(shù)據(jù)得出蛋白相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)以SPSS 24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)以n(%) 表示；計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較行單因素方差分析，兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RA 對SKOV3 細(xì)胞增殖的影響

RA 對SKOV3 細(xì)胞增殖有抑制作用，并隨著藥物濃度升高、藥物作用時(shí)間增長而增強(qiáng)，在藥物濃度為16 μmol/L，作用48、72 h 后，抑制作用不再增強(qiáng)，趨于穩(wěn)定。48 h 與72 h 相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)果顯示，16 μmol/L 的RA 處理SKOV3 細(xì)胞48 h 后，增殖抑制率達(dá)(56.87±6.38)%。見圖1。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇16 μmol/L 的RA 處理SKOV3 細(xì)胞48 h 來進(jìn)行增殖、凋亡實(shí)驗(yàn)；RA 對SKOV3 細(xì)胞增殖的抑制作用可能干擾對其遷移侵襲能力的檢測，為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果盡量準(zhǔn)確，選擇RA 處理SKOV3 細(xì)胞12 h 進(jìn)行遷移侵襲能力的檢測。

圖1 RA 對SKOV3 細(xì)胞增殖抑制率的影響

2.2 RA 對SKOV3 細(xì)胞活力的影響

以16 μmol/L 的RA、5 μmol/L 的PDD 處 理SKOV3細(xì)胞48 h，RA 組與PDD 組細(xì)胞活力顯著低于NC組(P＜0.05)，RA 組和PDD 組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見圖2。

圖2 RA 對SKOV3 細(xì)胞活力的影響

2.3 RA 對SKOV3 細(xì)胞凋亡的影響

RA 組及PDD 組SKOV3 細(xì)胞凋亡率顯著高于NC組(P＜0.05)，RA 組和PDD 組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見圖3、圖4。

圖3 RA 對SKOV3 細(xì)胞凋亡的影響

圖4 RA 對SKOV3 細(xì)胞凋亡的影響

2.4 RA 對SKOV3 細(xì)胞遷移的影響

RA 組及PDD 組遷移的SKOV3 細(xì)胞數(shù)目顯著低于NC 組(P＜0.05)，RA 組和PDD 組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見圖5、圖6。

圖5 RA 對SKOV3 細(xì)胞遷移的影響

圖6 RA 對SKOV3 細(xì)胞遷移的影響

2.5 RA 對SKOV3 細(xì)胞侵襲的影響

與NC 組相比，RA 組和PDD 組侵出transwell 小室的SKOV3 細(xì)胞數(shù)目明顯降低(P＜0.05)，RA 組和PDD組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見圖7、圖8。

圖7 RA 對SKOV3 細(xì)胞侵襲的影響

圖8 RA 對SKOV3 細(xì)胞侵襲的影響

2.6 RA 對SKOV3 細(xì)胞凋亡及EMT 相關(guān)蛋白的影響

RA 組 和PDD 組SKOV3 細(xì)胞Vimentin、Bcl-2 表達(dá)顯著低于NC 組(P＜0.05)，E-cadherin、Bax 表達(dá)顯著高于NC 組(P＜0.05)，RA 組和PDD 組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見圖9。

圖9 RA 對SKOV3 細(xì)胞凋亡及EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.7 RA 對SKOV3 細(xì)胞JAK/STAT3 通路相關(guān)蛋白的影響

RA組和PDD組SKOV3 細(xì)胞p-JAK/JAK、p-STAT3/STAT3 表達(dá)顯著低于NC 組(P＜0.05)，RA 組和PDD 組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見圖10。

圖10 RA 對SKOV3 細(xì)胞JAK/STAT3 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

卵巢癌作為婦科常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率逐漸上升，且患者也越來越趨于年輕化[10]，腫瘤細(xì)胞減滅手術(shù)后以紫杉醇聯(lián)合鉑類為主聯(lián)合化療是臨床中治療卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，但因大多數(shù)患者已到腫瘤中晚期，易產(chǎn)生化療耐藥性，并復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，治愈率及患者生存率均很低，因此尋找新的安全有效的藥物具有重要的臨床意義[11]。研究表明，中藥可通過多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)發(fā)揮抗腫瘤作用，且毒副作用低、不易產(chǎn)生耐藥性，是近年來研究的熱點(diǎn)[12]，多被銀蓮花的干燥根莖竹節(jié)香附具有明顯的抗腫瘤效應(yīng)，RA 是其主要的有效活性成分，可通過下調(diào)長鏈非編碼RNA HOTAIR 表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞增殖[13]，還可抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116 增殖、遷移及侵襲，促進(jìn)其凋亡[14]，但其對卵巢癌細(xì)胞SKOV3 增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響目前尚不清楚。本文通過以RA處理體外培養(yǎng)的卵巢癌SKOV3 細(xì)胞對此進(jìn)行研究，PDD可與細(xì)胞DNA 鏈交叉連接，殺傷細(xì)胞，具有明顯的抗腫瘤作用，是臨床上常用的廣譜抗癌藥[15]，因而本文使用PDD 作為陽性藥物，抑凋亡蛋白Bcl-2 與促凋亡蛋白Bax 是細(xì)胞凋亡過程中起到重要調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵蛋白[16]，結(jié)果顯示，RA 組與PDD 組SKOV3 細(xì)胞活力、Bcl-2 表達(dá)顯著低于NC 組，凋亡率、Bax 表達(dá)顯著高于NC 組，RA 組和PDD 組相比，各指標(biāo)無明顯變化，表明RA 可抑制SKOV3 細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡；上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程(EMT) 是腫瘤細(xì)胞向機(jī)體別處遷移侵襲的關(guān)鍵步驟，在此過程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Vimentin 表達(dá)上調(diào)[17]，SKOV3 細(xì)胞經(jīng)RA 及PDD 處理后，其侵襲遷移能力、Vimentin 表達(dá)明顯降低，E-cadherin 表達(dá)明顯增加，RA組和PDD 組相比，各指標(biāo)無明顯變化，表明RA 可降低SKOV3 細(xì)胞遷移侵襲力。

JAK/STAT3 信號通路對腫瘤增殖、凋亡、腫瘤免疫具有重要的調(diào)節(jié)作用，卵巢癌組織中JAK/STAT3 信號處于激活狀態(tài)，并促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌組織中免疫抑制分子PD-L1 的表達(dá)，促使卵巢癌細(xì)胞免疫逃逸[18]，而陳悅?cè)篬19]等發(fā)現(xiàn)，RA 可通過抑制JAK/STAT3 信號通路而抑制人子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B 細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，因而可推測抑制JAK/STAT3 信號激活可能是RA 抑制卵巢癌SKOV3 細(xì)胞增殖和侵襲的作用機(jī)制，本文研究結(jié)果顯示，SKOV3 細(xì)胞經(jīng)RA 及PDD 處理后，細(xì)胞p-JAK/JAK、p-STAT3/STAT3 明顯降低，RA 組和PDD 組相比，無明顯變化，表明RA 可抑制卵巢癌SKOV3 細(xì)胞JAK/STAT3信號磷酸化激活，揭示RA 抑制卵巢癌SKOV3 細(xì)胞增殖和侵襲的作用機(jī)制可能是下調(diào)JAK/STAT3 信號。

綜上所述，RA 可抑制卵巢癌SKOV3 細(xì)胞增殖、體外侵襲轉(zhuǎn)移，促進(jìn)其凋亡，為臨床治療卵巢癌提供了新的參考，抑制JAK/STAT3 信號磷酸化激活可能是其作用機(jī)制，但本文并未使用JAK/STAT3 通路抑制劑及激活劑對其進(jìn)行NC 驗(yàn)證，還存在不足，起確切的分子機(jī)制需要進(jìn)一步的深入研究。