紀(jì)越，張志茂，王志海

(1.三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 宜昌市中心人民醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科, 湖北 宜昌 443003；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科, 重慶 400016)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis, AR)是一種由環(huán)境與基因共同作用所致的變態(tài)反應(yīng)性疾病，雖不危及生命但可誘發(fā)諸多并發(fā)癥而影響患者生活質(zhì)量[1]。我國(guó)是AR高發(fā)國(guó)家，2011年一項(xiàng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，城市成人AR標(biāo)準(zhǔn)化患病率為17.6%[2]。由于AR的發(fā)病機(jī)制的特殊性，避免變應(yīng)原接觸成為了治療的首選方案，但該方案應(yīng)用較為困難，而以抗炎為靶向的藥物治療方案常常使患者難以耐受同樣難以較好推廣應(yīng)用。近年來，隨著對(duì)AR的深入研究，變應(yīng)原特異性免疫治療(active immunotherapy,AIT)的優(yōu)點(diǎn)亦逐漸體現(xiàn)，但機(jī)體免疫系統(tǒng)是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)現(xiàn)階段仍有諸多問題尚未明確，故對(duì)AR的免疫調(diào)控機(jī)制開展深入研究，可能有助于對(duì)其的預(yù)防、診斷和治療[3]。sPD-L1是程序性死亡分子1配體(programmed cell death- ligand-1, PD-L1)的可溶性形式，既往諸多報(bào)道顯示，癌癥患者腫瘤細(xì)胞中sPD-L1呈過表達(dá)，其表達(dá)上調(diào)似乎有利于抑制T細(xì)胞的增殖，使癌癥逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，從而促進(jìn)病情的惡化[4]，但過敏性疾病患者機(jī)體sPD-L1的表達(dá)與T淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性仍鮮有報(bào)道。基于此，筆者擬對(duì)AR患者sPD-L1表達(dá)與T淋巴細(xì)胞亞群的關(guān)系展開研究，以期為臨床診治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

對(duì)我院2018年6月—2020年2月宜昌市中心人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科收治的AR患者120例。并納入同期體檢健康者50例作為對(duì)照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2010版變應(yīng)性鼻炎及其對(duì)哮喘的影響(allergic rhinitis and its impact on asthma，ARIA)相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；②年齡在20～60歲；③患者自愿簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴嚴(yán)重內(nèi)分泌疾病者；②伴嚴(yán)重傳染性疾病者；③合并自身免疫性疾病、慢性炎癥者。本次研究所納入病例經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。兩組患者一般資料均衡可比，具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 兩組受試者一般資料比較 (例，

1.2 方法

1.2.1 試劑及儀器 酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒購置于南京森貝伽生物科技有限公司；酶標(biāo)儀購置于上海閃譜高品質(zhì)產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀購置于吉源生物科技有限公司；EDTA-K2抗凝管購置于廈門海菲生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 血清指標(biāo)檢測(cè) ①于清晨采集患者空腹外周靜脈血2 mL，經(jīng)3 000 r/min離心后分離上清液，放置進(jìn)-80°冰箱待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定兩組患者血清sPD-L1水平;②采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組CD3+、CD8+、CD4+和CD4+/CD8+水平，方法為：EDTA-K2抗凝管采集患者空腹外周血1.8 mL，染色后孵育20 min，隨后采用FACSL ysing solution進(jìn)行溶血處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血清表達(dá)水平比較

研究組sPD-L1水平顯著高于對(duì)照組[(104.41±35.96)pg/mL vs (45.57±14.03)pg/mL]；研究組CD3+水平顯著低于對(duì)照組[(63.12±3.48)% vs (71.02±7.62)%]；研究組CD4+水平顯著低于對(duì)照組[(35.98±3.07)% vs (41.54±5.65)%]；研究組CD8+水平顯著低于對(duì)照組[(22.93±3.24)% vs (28.95±2.15)%]；研究組CD4+/CD8+水平顯著高于對(duì)照組(1.49±0.30 vs 1.37±0.29)。見圖1～5。

圖1 兩組sPD-L1水平比較 圖2 兩組CD3+水平比較 圖3 兩組CD4+水平比較 圖4 兩組CD8+水平比較 圖5 兩組CD4+/ CD8+水平比較 圖6 血清sPD-L1水平與CD3+的相關(guān)性 圖7 血清sPD-L1水平與CD4+的相關(guān)性 圖8 血清sPD-L1水平與CD8+的相關(guān)性 圖9 血清sPD-L1水平與CD4+/ CD8+的相關(guān)性

2.2 血清sPD-L1與T淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性

血清sPD-L1水平與CD3+、CD4+、CD8+呈顯著負(fù)相關(guān)(r1=-0.754，r2=-0.817，r3=-0.691，P<0.05)，而與CD4+/CD8+呈正相關(guān)(r=0.810，P<0.05)，見圖6～9。

3 討論

AR是起源于鼻黏膜的一種Th2偏離性炎癥反應(yīng)，為典型的I型變態(tài)反應(yīng)，其病發(fā)與Th1/Th2的比例失調(diào)密切相關(guān)[6]。Okamoto等[7]證實(shí)，AR患者存在明顯的免疫缺陷。故早期對(duì)機(jī)體免疫功能水平進(jìn)行評(píng)估，及時(shí)實(shí)施有效的血清標(biāo)志物監(jiān)測(cè)，有利于AR的預(yù)測(cè)和診斷。血清sPD-L1為PD-L1的可溶性形式，PD-L1為PD-1的同源配體，前者可通過與后者結(jié)合而抑制T細(xì)胞活性[8]。Ding等[9]證實(shí)，新抗原的減少可能為腫瘤細(xì)胞的逃逸提供環(huán)境，而患者PD-L1表達(dá)似乎為新抗原減少的主要誘因。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，研究組sPD-L1水平顯著低于對(duì)照組，證實(shí)異常表達(dá)的sPD-L1可能參與AR的病理生理。但在AR發(fā)生、發(fā)展過程中sPD-L1的異常表達(dá)是否與T淋巴細(xì)胞亞群紊亂存在某種關(guān)系仍需進(jìn)一步探討。

鼻黏膜部位的不成熟樹突細(xì)胞與變應(yīng)原結(jié)合使Th0細(xì)胞向Th2分化，Th2可激活B細(xì)胞活性使變應(yīng)原特異性IgE分泌增強(qiáng)，其表達(dá)上調(diào)后可與嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞表明受體結(jié)合，當(dāng)個(gè)體再次與變應(yīng)原接觸時(shí)，可迅速導(dǎo)致IgE發(fā)生橋聯(lián)，使下游Th2細(xì)胞因子及血小板激活因子大量釋放，而迅速引發(fā)流涕、噴嚏和鼻塞等癥狀[10]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，研究組CD3+、CD4+、CD8+和水平顯著低于對(duì)照組，而CD4+/CD8+顯著高于對(duì)照組，證實(shí)AR患者存在明顯的T細(xì)胞免疫紊亂，這與Wang等[11]研究結(jié)果基本一致。CD3+是機(jī)體重要的淋巴細(xì)胞，與機(jī)體免疫密切相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[12]發(fā)現(xiàn)，CD3+的高表達(dá)有利于激活CD4+的增殖，使CD4+的分泌IL- 4的能力增強(qiáng)，而對(duì)IL-2和IFN-γ的抑制能力增強(qiáng)。CD4+是具有輔助性T細(xì)胞亞群，其可通過活化B細(xì)胞分泌抗體，正常機(jī)體中Th1/Th2處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)機(jī)體遭受異常抗原刺激時(shí)，二者平衡被打破，可迅速引起異常免疫應(yīng)答[13]。Th2主要介導(dǎo)體液免疫，可通過活化B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，迅速誘發(fā)速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，其機(jī)制可能為活化的Th2可分泌諸如IL-5和IL- 4等細(xì)胞因子，使病灶局部炎癥水平升高。Luo等[14]證實(shí)，AR患者CD4+細(xì)胞水平呈低表達(dá)，而IL-5和IL- 4因子表達(dá)上調(diào)。而Th1主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫，并在遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)中扮演重要角色。CD8+來源于骨髓造血干細(xì)胞，在胸腺中發(fā)育成熟，當(dāng)其表達(dá)上調(diào)時(shí)可有效抑制B、T淋巴細(xì)胞活性。機(jī)體CD8+T細(xì)胞的活化需要三種信號(hào)，炎性因子、共刺激信號(hào)和T細(xì)胞受體/抗原肽-I型主要組織相容性復(fù)合體(信號(hào)1)，其中信號(hào)1即影響CD8+增殖，亦決定了其具有抗原特異性[15]。Kohanbash等[16]證實(shí)，當(dāng)CD8+水平降低時(shí)對(duì)B細(xì)胞的抑制作用減弱，使IgE水平升高。為進(jìn)一步證實(shí)我們的推論，我們觀察了sPD-L1的表達(dá)與CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+的關(guān)系，結(jié)果顯示，CD3+與sPD-L1(r=-0.754，P<0.05)、CD4+與sPD-L1(r=-0.817，P<0.05)、CD8+與sPD-L1(r=-0.691，P<0.05)，這預(yù)示著sPD-L1的低表達(dá)與T淋巴細(xì)胞的紊亂存在關(guān)系。但我們發(fā)現(xiàn)CD4+/CD8+與sPD-L1(r=0.810，P<0.05)呈正相關(guān)，筆者認(rèn)為可能為sPD-L1與CD4+的相關(guān)性更強(qiáng)，而與CD8+的關(guān)系相對(duì)較弱，故在sPD-L1表達(dá)升高后前者受調(diào)控更佳靈敏，使得二者比值升高。而sPD-L1誘發(fā)T淋巴細(xì)胞亞群紊亂的機(jī)制可能如下：Mair等[17]通過不同濃度的sPD-L1與T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)高濃度組T淋巴細(xì)胞的增殖能力明顯降低，而低濃度組則無顯著變化。這似乎解釋了sPD-L1與T淋巴細(xì)胞呈正相關(guān)的原因。Wasén等[18]認(rèn)為，sPD-L1可通過與B細(xì)胞表面的PD-1受體結(jié)合，從而促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而影響T淋巴細(xì)胞的水平。而畢玉娜等[19]的結(jié)果似乎解釋了sPD-L1的表達(dá)與T淋巴細(xì)胞紊亂的機(jī)制，其結(jié)果顯示，sPD-L1的表達(dá)上調(diào)有利于將S期T淋巴細(xì)胞百分比下調(diào)，而使G0/G1期細(xì)胞增多。此外PD-1/PD-L1途徑介導(dǎo)的負(fù)性信號(hào)亦可有效抑制T、B淋巴細(xì)胞功能，而以可溶性形式存在的協(xié)同刺激分子，可能與這以信號(hào)通路存在密切關(guān)系。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，sPD-L1在機(jī)體的含量與年齡呈正比，這似乎證實(shí)隨免疫系統(tǒng)在外界刺激的不斷作用下該因子的表達(dá)水平亦隨之改變，提示了sPD-L1的水平與機(jī)體免疫功能密切相關(guān)。蛋白質(zhì)可逆性磷酸化似乎可以解釋這一結(jié)論，蛋白激酶可通過兩方面影響信號(hào)傳導(dǎo)，其一通過蛋白質(zhì)的逐級(jí)磷酸化，將信號(hào)增強(qiáng)而誘發(fā)細(xì)胞反應(yīng)，其二通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性而影響去磷酸化和磷酸化進(jìn)程，是信號(hào)的終止、失活和啟動(dòng)放大受到影響[20]。PD-1的一個(gè)重要接頭分子為SHP-1，后者是蛋白酪氨酸磷酸酶的一種，主要表達(dá)于造血細(xì)胞，其可通過與細(xì)胞的免疫抑制性受體項(xiàng)結(jié)合而對(duì)T淋巴細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控[21]。

綜上所述，sPD-L1在AR患者中呈過表達(dá)，其表達(dá)上調(diào)與T淋巴細(xì)胞亞群的紊亂密切相關(guān)。但本次實(shí)驗(yàn)尚存不足，如納入樣本量過低，僅為單中心實(shí)驗(yàn)，仍需進(jìn)一步設(shè)置大樣本多中心實(shí)驗(yàn)進(jìn)行論證。