閆晶晶，鄧安春，朱先柏，王敏

(中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉科,重慶 400037)

肺炎鏈球菌導致的急性中耳炎(acute otitis media，AOM)是臨床常見兒科感染疾病。AOM可導致患兒永久性的聽力喪失，嚴重危害青少年的健康成長。研究表明[1]在細菌感染后，宿主體內(nèi)的中性粒細胞被激活，增殖，并募集到炎性部位，為機體構筑抵抗入侵的首要屏障，同時中性粒細胞會增強多種細胞因子的表達，參與肺炎鏈球菌的清除。研究表明[2]磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinases，PI3K)信號是機體內(nèi)重要的轉導通路，在與免疫、炎性應激等疾病相關的生物病理改變中，對于細胞的增殖，活化以及募集等過程其中心調(diào)控作用。吳盈盈等[3]研究表明PI3K信號通路在調(diào)節(jié)肺炎鏈球菌HSP40誘導的小鼠巨噬細胞的免疫應答中發(fā)揮關鍵作用。李海龍等[4]研究表明抑制PI3K信號能明顯抑制哮喘小鼠的炎性應激，減少炎性細胞的浸潤，減少小鼠肺泡灌洗液中中性粒細胞計數(shù)。白細胞介素-27(interleukin 27，IL-27)能對多種免疫細胞發(fā)揮調(diào)控作用，在細胞抗感染、以及炎癥應激等機體免疫生理過程中起重要的作用[5]。Wang等[6]研究表明在由艱難梭菌誘導的結腸炎C57BL/6小鼠中，與野生型小鼠相比，敲除IL-27基因后，IL-27表達的缺失明顯加重其結腸炎病理改變。但未見IL-27在AOM中的相關研究報道。本研究通過建立AOM小鼠，基于PI3K信號通路，探討IL-27對AOM小鼠中耳組織的保護作用，從而為AOM的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

6～8周齡的BALB/c雄性小鼠，SPF級，體重在200～220 g，共計80只，從北京維通利華實驗動物有限公司采購，動物許可證號SCXK(京)2017-0652；所用動物依照本院實驗動物管理辦法，室溫下標準飼料、自由飲水、分籠(4籠)適應性飼養(yǎng)1周后用于試驗。本研究中所有動物實驗操作均經(jīng)本院實驗動物管理倫理委員會批準(批準號：2019-032)。標準肺炎鏈球菌菌株(D39)購自中國科學院微生物研究所。

1.2 主要試劑

IL-27(1 mL/支，廣東厚德水準生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：NA02020034)，PI3K特異性抑制劑2-(4-嗎啉基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮[2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-on，LY294002](1 mL/支，美國Invivo Gene公司，生產(chǎn)批號：AV-58H009)，PI3K、磷酸化磷脂酰肌醇-3激酶(phosphorylation of phosphatidylinositol 3-kinase， p-PI3K)、磷酸化絲蘇氨酸蛋白激酶(phosphorylation serine-threonine kinase，p-AKT)、腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor-alpha，TNF-α)、白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)、兔抗GAPDH 抗體(美國Santa公司)，western blot試劑盒(德國Rebstock公司)，免疫組化試劑盒(南京建成生物有限公司)，蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosinstaining，HE)試劑盒(上海碧云天生物技術公司)，蛋白質濃度測定試劑盒、化學發(fā)光試劑盒(美國 Forma公司)。

1.3 主要儀器

LIOOS600T生物顯微鏡(日本尼康公司)，Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)，-80℃深冷冰箱(德國維根斯公司)，Leica RM2135組織切片機(德國Leica公司)，高速低溫離心機(北京六一儀器廠)。

1.4 模型構建和分組處理

適應性喂養(yǎng)1周后，將小鼠隨機分為4組，每組20只，依次為正常組、模型組、IL-27組(實驗組)、PI3K特異性抑制劑LY294002干預組(對照組)。采用肺炎鏈球菌感染建立急性中耳炎小鼠模型，實驗組和對照組小鼠分別在感染肺炎鏈球菌前12 h耳后注射200 μL的IL-27(5 μg/mL)和LY294002(5 μg/mL)，正常組、模型組注射等劑量的生理鹽水。模型組、實驗組、對照組小鼠每只耳鼓膜前下方注射5 μL肺炎鏈球菌[7]，正常組注射等劑量的生理鹽水。注射完畢后，所有小鼠自由飲水，標準飼料喂養(yǎng)。

1.5 各組小鼠聽性腦干反應(auditory brainstem response，ABR)

在感染注射5 d后，將各組小鼠麻醉后，在隔音室使用小微動物ABR 儀器進行聽力檢測，從80 dB 聲壓級(sound pressure level，SPL)測試聲開始，依次遞減10 dB，在臨近閾值處以5 dB遞減，以可重復的，較為明確的Ⅲ波作為ABR閾值。

1.6 各組小鼠中耳灌洗液(middle ear lavage fluids，MELF)標本采集

在感染注射5 d后，收集各組小鼠的MELF：動物麻醉后，將5 μL預冷的PBS液經(jīng)穿破鼓膜注入中耳，收集灌洗液，至少灌洗20次[8]。每只耳需要收集100 μL MELF。取20 μL MELF經(jīng)PBS緩沖液稀釋后進行炎性細胞計數(shù)以及細菌計數(shù)。剩余MELF轉入深冷冰箱中待測。

1.7 ELISA法測定各組小鼠MELF中炎性因子TNF-α、IL-6的含量

取50%各組小鼠MELF標本，經(jīng)PBS液稀釋后，嚴格按照ELISA試劑盒要求進行操作，測定各組小鼠中耳灌洗液中炎性因子TNF-α、IL-6的表達。

1.8 HE染色觀察各組小鼠中耳組織病理學改變

在感染注射5 d后，上述檢測結束后，處死各組小鼠，同時收集各組小鼠的中耳組織，90%組織并迅速轉至深冷冰箱待測。10%組織標本，多聚甲醛固定24 h后，包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察各組小鼠中耳組織的病理變化。

1.9 Western blot檢測各組小鼠中耳組織中p-PI3K、p-AKT的表達水平

每組取3只小鼠，然后取中耳組織，提取目標蛋白，測定蛋白濃度后，稱取適量樣品，經(jīng)電泳、PVDF轉膜后，加入10%脫脂奶粉封閉3 h，以(1∶1 500)比例稀釋后，維持4℃過夜孵育，洗滌加入二抗(1∶1 000)，孵育3 h，增強化學發(fā)光ELC顯色30 min，經(jīng)曝光、顯影、定影后，以GAPDH為內(nèi)參來表示蛋白的表達水平。

1.10 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 各組小鼠ABR檢測結果

各組小鼠ABR檢測各組結果顯示，模型組、實驗組、對照組的ABR閾值明顯高于正常組(t依次為2.754、4.569、3.681，P均<0.05)，而實驗組、對照組ABR閾值明顯低于模型組(t依次為5.672、5.247，P均<0.05)，實驗組和對照組相比，差異不具有統(tǒng)計意義(t=0.324，P>0.05)，見表1，圖1。

表1 各組小鼠ABR閾值比較

圖1 各組小鼠ABR閾值比較

2.2 顯微鏡下觀察各組小鼠MELF中炎性細胞計數(shù)和細菌計數(shù)

顯微鏡下觀察各組小鼠MELF中炎性細胞計數(shù)結果如圖2a顯示，模型組、實驗組、對照組小鼠MELF中炎性細胞計數(shù)明顯高于正常組(t依次為29.855、25.324、23.597，P均<0.05)，而實驗組和對照組小鼠MELF中炎性細胞計數(shù)明顯低于模型組(t依次為14.071、13.254，P均<0.05)，實驗組和對照組相比，差異不具有統(tǒng)計學意義(t=0.125，P>0.05)。

顯微鏡下觀察各組小鼠MELF中細菌數(shù)量結果圖2b顯示，模型組、實驗組、對照組小鼠MELF中的細菌數(shù)量明顯高于正常組(t依次為20.138、16.217、15.987，P均<0.05)，實驗組、對照組MELF中的細菌數(shù)量明顯低于模型組(t依次為10.027、9.648，P均<0.05)，實驗組和對照組相比，差異不具有統(tǒng)計意義(t=0.011，P>0.05)，見表2、圖2。

圖2 顯微鏡下觀察各組小鼠MELF a：炎性細胞計數(shù)；b：細菌數(shù)量

表2 各組小鼠MELF中炎性細胞計數(shù)和細菌數(shù)量的比較 (×105個

2.3 ELISA法檢測各組小鼠MELF中TNF-α、IL-6的表達

ELISA法檢測各組小鼠MELF中TNF-α、IL-6的含量結果如圖3顯示，模型組、實驗組、對照組小鼠MELF中TNF-α含量明顯高于正常組(t依次為45.942、35.685、36.984，P均<0.05)，實驗組、對照組MELF中TNF-α含量明顯低于模型組(t依次為25.634、24.969，P均<0.05)，實驗組和對照組相比，差異不具有統(tǒng)計意義(t=0.125，P>0.05)；模型組、實驗組、對照組小鼠MELF中IL-6含量明顯高于正常組(t依次為58.367、42.618、43.254，P均<0.05)，實驗組、對照組MELF中IL-6含量明顯低于模型組(t依次為37.892、38.521，P均<0.05)，實驗組和對照組相比，差異不具有統(tǒng)計意義(t=0.163，P>0.05)，見表3。

表3 各組小鼠MELF中TNF-α、IL-6的含量的比較

圖3 ELISA法檢測各組小鼠MELF中TNF-α、IL-6的表達

2.4 HE染色觀察各組小鼠中耳組織病理學改變

各組小鼠中耳組織HE染色結果如圖4所示，正常組小鼠中耳組織結構完整，上皮未見有分泌物滲出，黏膜細胞排列正常，中耳骨質無異常；與正常組相比，模型組小鼠中耳上皮腫脹明顯，上皮黏膜明顯增厚，并且有分泌物滲出，中耳骨質損傷明顯，與模型組相比，實驗組和對照組小鼠中耳組織損傷明顯減輕，略見腫脹，黏膜增厚明顯減輕，滲出物明顯減少，中耳骨質損傷明顯減輕。

圖4 各組小鼠中耳組織 (HE ×200)

2.5 各組小鼠中耳組織中p-PI3K、p-AKT的表達

Western blot檢測各組小鼠中耳組織中p-PI3K、p-AKT的表達結果如圖5、6所示：模型組小鼠中耳組織中p-PI3K、p-AKT的相對表達比正常組明顯升高(t分別為6.315，5.169，P<0.05)，實驗組和對照組小鼠中耳組織中p-PI3K、p-AKT的相對表達比模型組明顯降低(F分別為3.257，3.543，P<0.05)；實驗組和對照組相比，差異不具有統(tǒng)計意義(t分別為0.124，0.211，P>0.05)。

圖5 免疫組化檢測各組小鼠中耳組織中p-PI3K、p-AKT的表達 (SP ×400)

3 討論

AOM是與兒童的健康成長密切相關的全球感染性疾病。定植在鼻咽部位但極易上行至機體中耳腔的肺炎鏈球菌是常見致病菌之一[9]。盡管AOM是機體的自限性疾病，但是如果不能有效地控制病菌入侵，極可能導致患者出現(xiàn)腦膜炎、永久性聽力喪失等嚴重后遺癥。臨床上尚缺乏快速而有效的根治手段。大量研究證實[10]中性粒細胞在細菌感染后成為宿主進行免疫應答清除病原體的主要效應細胞。因此闡明AOM中中性粒細胞的分子機制，為臨床上治療AOM具有重要意義。

IL-27作為一種重要的機體免疫調(diào)節(jié)因子，在機體的固有免疫、適應性免疫應激以及抗感染、抗病毒過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。Jacobs 等[11]臨床研究發(fā)現(xiàn)IL-27可作為由細菌感染導致新生兒免疫低下的分子標志物，血清中IL-27的含量能準確反映其受病原體感染的程度。Fan等[12]研究表明在由內(nèi)毒素致小鼠急性肝損傷模型中，IL-27處理后能明顯增強肝組織中性粒細胞的免疫能力，增強小鼠肝臟抗感染的能力。Robinson 等[13]研究表明在金黃色葡萄球菌導致的肺炎小鼠模型中，外源性添加IL-27能明顯抑制促炎分子IL-17的表達，增強抑炎分子IL-10的表達。Lin等[14]研究表明針對肺結核患者的支氣管肺泡灌洗液進行IL-27處理，能明顯減少其灌洗液中細菌的種類和數(shù)量。本研究通過建立BALB/c小鼠急性中耳炎模型，經(jīng)過IL-27干預后，與模型組相比，實驗組小鼠的ABR閾值，MELF中炎性細胞以及細菌計數(shù)，炎性因子TNF-α、IL-6的表達均明顯降低，HE染色結果表明實驗組小鼠中耳組織損傷明顯改善，小鼠聽力功能明顯恢復。

PI3K通路是機體內(nèi)重要的信號通路，AkT是PI3K下游的關鍵信號轉導蛋白，在應激條件下該信號被活化，PI3K、AKT發(fā)生磷酸化直接參與調(diào)控細胞增殖、分化以及免疫應答和炎性應激等相關生理過程。Kurosawa 等[15]研究表明PI3K信號的激活，PI3K、AKT發(fā)生磷酸化，直接促進化膿性鏈球菌對患者的上皮細胞粘附和侵襲，誘發(fā)患者出現(xiàn)咽喉炎或者中毒性休克綜合征等癥狀。Lv 等[16]研究表明抑制PI3K信號的磷酸化能明顯抑制金黃色葡萄球菌感染RAW264.7巨噬細胞的炎性應激。Lin 等[17]研究表明在臨床上治療類風濕關節(jié)炎(rheum atoid arthritis，RA)時，給以PI3K抑制劑LY294002干預后，能明顯抑制中性粒細胞的炎性浸潤，改善患者的RA癥狀。粟玉鳳等[18]研究證實PI3K抑制劑LY294002能明顯抑制肺炎鏈球菌感染引起的小鼠巨噬細胞中IL-6、TNF-α的表達，增強細胞的免疫能力。本研究采用PI3K抑制劑LY294002處理作為對照組，結果表明，對照組小鼠癥狀明顯改善，并且對照組與實驗組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明IL-27與LY294002對急性中耳炎小鼠起到的作用相類似；而Western blot結果顯示，與模型組相比，實驗組和對照組小鼠中耳組織中p-PI3K、p-AKT的表達明顯降低，由此推斷IL-27可能是通過抑制PI3K信號通路的磷酸化來實現(xiàn)對小鼠中耳組織的保護作用的。

圖6 Western blot檢測各組小鼠中耳組織中p-PI3K、p-AKT的表達

綜上所述，在肺炎鏈球菌感染的急性中耳炎中，IL-27能通過抑制PI3K信號的磷酸化來調(diào)節(jié)中性粒細胞對病菌的清除。但IL-27是否還通過其他通路影響AOM進程還需更深入的研究。