奉佳連，文忠

(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，廣東 廣州 510282)

類器官是體外三維培養(yǎng)構(gòu)建出的多細(xì)胞團(tuán)塊，具有自我更新和自我組織能力, 并且維持了其來源組織的生理結(jié)構(gòu)和功能的特點[1-3]。近來眾學(xué)者將類器官技術(shù)應(yīng)用于惡性腫瘤的治療，已建立多種組織的類器官如頭頸部腫瘤[4-6]、內(nèi)耳[7]、甲狀腺[8]、視網(wǎng)膜[9]、腦[10]、新型冠狀病毒感染模型[11]等。類器官培養(yǎng)技術(shù)在腫瘤研究上具有獨特的優(yōu)勢:①維持腫瘤細(xì)胞的高度異質(zhì)性;②維持腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境基質(zhì)的接觸極性, 更好地模擬體內(nèi)的腫瘤微環(huán)境;③來源于臨床組織的類器官培養(yǎng)效率高、耗時少;④腫瘤類器官同時擁有腫瘤細(xì)胞系和小鼠PDX模型的優(yōu)點，可進(jìn)行遺傳操作且具備三維復(fù)雜系統(tǒng)特性。結(jié)合類器官技術(shù)，直接針對患者腫瘤組織進(jìn)行個體化研究和藥物篩選，建立臨床前模型，用于頭頸惡性腫瘤的精準(zhǔn)治療。現(xiàn)就頭頸惡性腫瘤個體化類器官在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時代背景下的研究現(xiàn)狀及其潛在的臨床應(yīng)用前景進(jìn)行綜述。

1 頭頸部惡性腫瘤與精準(zhǔn)醫(yī)療

頭頸惡性腫瘤被列為全球第六大常見的癌癥，占全身惡性腫瘤的21.2%，占男性惡性腫瘤的47%，占女性惡性腫瘤的2.5%，鱗狀細(xì)胞癌是最常見的組織學(xué)類型(97%)[12]。吸煙和飲酒是頭頸惡性腫瘤發(fā)展的主要危險因素[13]，而EB病毒和人乳頭瘤病毒分別與鼻咽癌和口咽癌有關(guān)[14-15]。頭頸部惡性腫瘤的治療方案選擇根據(jù)腫瘤所在的解剖位置、腫瘤分期、患者年齡、健康狀況及合并疾病而有所不同。開放和微創(chuàng)手術(shù)在內(nèi)的手術(shù)被認(rèn)為是大多數(shù)口咽癌和早期喉癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，而其他頭頸部癌癥則采用放射治療或同步放化療。據(jù)統(tǒng)計，即便采取積極治療，頭頸惡性腫瘤的復(fù)發(fā)率也達(dá)40%～50%。

2015年美國啟動了“全美計劃”，這是一項由政府資助的精準(zhǔn)醫(yī)療計劃，招募超過100萬人參與該計劃。精準(zhǔn)醫(yī)療的核心在于能夠指導(dǎo)醫(yī)療保健決策為患者提供最有效的治療，從而提高治療質(zhì)量，同時減少對不必要的診斷和療法探索[16]。腫瘤精準(zhǔn)治療的實現(xiàn)極大程度上依賴于藥物敏感性的檢測，但目前尚缺乏有效檢測腫瘤藥物敏感性的可靠方法，傳統(tǒng)的藥物篩選系統(tǒng)篩選出的藥物臨床應(yīng)用價值低[17]。頭頸惡性腫瘤個體化藥物敏感性篩查的復(fù)雜性及艱巨性，反映了對于抗癌藥物耐藥、化療藥物篩選系統(tǒng)、靶向藥物篩選系統(tǒng)認(rèn)識不足的客觀現(xiàn)實，亟需更全面、多角度的研究來進(jìn)行揭示。類器官培養(yǎng)技術(shù)，給頭頸惡性腫瘤的精準(zhǔn)醫(yī)療進(jìn)一步發(fā)展帶來希望。

2 頭頸腫瘤類器官模型

2.1 頭頸腫瘤類器官的研究簡史

為了更好地研究癌癥，研究人員已建立各種疾病模型，包括癌細(xì)胞系、動物模型以及新興的類器官模型，這些疾病模型各有其優(yōu)缺點(表1)。癌細(xì)胞系可快速建立，用于藥物開發(fā)和高通量篩選，由于其缺乏對腫瘤結(jié)構(gòu)和微環(huán)境的解釋，限制其作為臨床前模型的應(yīng)用潛力。腫瘤異種移植可以維持特定的腫瘤異質(zhì)性以及腫瘤細(xì)胞與其周圍基質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用，已經(jīng)被用于臨床前藥物評估、生物標(biāo)記物鑒定及放療敏感性[18]。異種移植也存在缺點，需要大的小鼠群體，耗費大量資金和人力，阻礙了它們在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中的實際應(yīng)用[19]。

表1 疾病模型優(yōu)劣勢對比分析表

頭頸腫瘤三維培養(yǎng)已有較長時間，早在1989年，Sacks 等[20]從單層細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)展到具有三維細(xì)胞組織的體外模型多細(xì)胞腫瘤球體。K?pf-Maier 等[21]在1991年利用類器官技術(shù)培養(yǎng)了患者組織來源的下咽表皮樣癌類器官以及口咽鱗狀細(xì)胞癌類器官。Saito 等[22]建立功能性甲狀腺類器官，能合成甲狀腺球蛋白、碘攝取以及甲狀腺激素的產(chǎn)生和釋放。Driehuis等[23]首次詳細(xì)描述了來自健康黏膜上皮細(xì)胞以及頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞類器官的培養(yǎng)條件，建立頭頸腫瘤類器官活組織生物庫?？焖儆行У亟⒒罱M織生物庫，有望在更廣泛的人群中有針對性地研究個體化藥物。已有研究證明腫瘤類器官概括了相應(yīng)來源的器官特異性基因表達(dá)特征、特定的組織空間結(jié)構(gòu)和原始組織的功能，能夠在體外保留患者組織本身對新型藥劑的敏感性，可用于發(fā)現(xiàn)和驗證新型藥物，以及模擬和研究靶向藥物的抗性[24-25]。類器官培養(yǎng)技術(shù)使得我們能夠建立新型頭頸惡性腫瘤模型來研究和篩選藥物以用于精準(zhǔn)治療。

2.2 頭頸腫瘤類器官培養(yǎng)

類器官由兩種主要類型的干細(xì)胞培養(yǎng)而成：①多能胚胎干細(xì)胞及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；②成體干細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞。目前有多種類器官培養(yǎng)方法,大部分需要干細(xì)胞、基質(zhì)膠和富含細(xì)胞因子的培養(yǎng)基。小鼠類器官維持培養(yǎng)需要加入N-乙酰-1-半胱氨酸、煙酰胺、表皮細(xì)胞生長因子(epidermal growth factor,EGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)10、R-spondin蛋白，人頭頸腫瘤類器官維持培養(yǎng)需要加入的細(xì)胞因子與小鼠類器官相似，但需額外加入B27細(xì)胞培養(yǎng)添加劑、轉(zhuǎn)化生長因子-βI型受體抑制劑、前列腺素E2、FGF2、骨形態(tài)遺傳蛋白。使用腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)頭頸腫瘤類器官，平均而言，可以在10～14 d內(nèi)建立，石蠟包埋腫瘤類器官的免疫組化結(jié)果顯示基底細(xì)胞標(biāo)記物腫瘤蛋白P63(tumor protein 63，TP63)和細(xì)胞增殖相關(guān)抗原(marker of proliferation，MKI67或Ki-67)，提示腫瘤類器官培養(yǎng)成功。在腫瘤類器官外層可見增殖性標(biāo)記MKI67+/TP63+基底細(xì)胞；在類器官內(nèi)層細(xì)胞中可見分化標(biāo)記角蛋白13(keratin 13，KRT13)；另外使用透射電子顯微鏡觀察到角質(zhì)形成細(xì)胞的特征，例如大量的張力絲和橋粒；以上提示腫瘤類器官能夠概括起源組織的特性[27]。以往研究人員將腫瘤組織分解成單個細(xì)胞后在含有基質(zhì)膠的培養(yǎng)基中制備類器官，容易出現(xiàn)失巢凋亡，為了提高類器官培養(yǎng)率，可加入Ras同源基因-Rho相關(guān)螺旋卷曲蛋白激酶抑制劑抑制失巢凋亡[28]。最近，Tanaka 團(tuán)隊[5]提出癌組織起源球方法，即將手術(shù)切除或活檢獲得的腫瘤組織簡單分解成腫瘤組織碎片而不是單個細(xì)胞，細(xì)胞簇在24 h內(nèi)迅速形成球形，進(jìn)而快速有效建立頭頸腫瘤類器官模型，能夠有效避免失巢凋亡的發(fā)生。王顯文等[29]使用鼻咽癌患者來源腫瘤組織，通過腫瘤形態(tài)學(xué)、組織病理學(xué)鑒定(KI67、CD133免疫組化)、EB病毒編碼RNA原位雜交技術(shù)等鑒定方法，成功培養(yǎng)鼻咽癌腫瘤類器官，并用于藥物篩選，然而，筆者在文中亦提到研究的局限性。腫瘤微環(huán)境復(fù)雜，包含血管、神經(jīng)、免疫細(xì)胞、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞等，在體外重建腫瘤微環(huán)境是類器官技術(shù)的難點，為了體外重建腫瘤免疫微環(huán)境，Neal 等[30]將腫瘤組織培養(yǎng)成腫瘤類器官后，使用氣液界面方法將類器官與具有天然免疫細(xì)胞(T、B、NK、巨噬細(xì)胞)的腫瘤上皮細(xì)胞在同基因免疫活性宿主中共培養(yǎng)；Nakamura等[31]提出類器官與腫瘤成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)方案；此外，血管類器官的成功培養(yǎng)，有望解決體外腫瘤類器官血管化難題[32-33]。

3 頭頸部腫瘤類器官的應(yīng)用

3.1篩選基因突變

Tanaka等[5]進(jìn)行全基因組測序和磷酸化定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，以鑒定和探索對頭頸惡性腫瘤患者有用的生物標(biāo)記物。Driehuis等[23]成功培養(yǎng)了31例頭頸惡性腫瘤類器官，對其他的16例進(jìn)行基因組測序，發(fā)現(xiàn)69%存在P53突變，43%存在磷脂酰肌醇- 4,5-雙磷酸3-激酶催化亞基α突變，25%存在KRAS原癌基因突變，在58個差異最大的表達(dá)基因中(P<0.01)，發(fā)現(xiàn)激肽釋放酶相關(guān)肽酶6、溶質(zhì)載體有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運蛋白家族成員1B3、同源盒C13基因、鈣結(jié)合蛋白1、ETS同源因子和丁酰膽堿酯酶發(fā)生了突變。研究人員對腫瘤類器官和腫瘤組織進(jìn)行對比測試，發(fā)現(xiàn)腫瘤類器官出現(xiàn)變異等位基因頻率富集，這可能是由于腫瘤類器官缺乏免疫、血管、神經(jīng)等腫瘤微環(huán)境所致。此外，還對比檢測了腫瘤類器官以及正常組織類器官，僅發(fā)現(xiàn)腫瘤類器官存在單核苷酸變異、染色體的缺失和插入。

3.2 測試抗癌藥物敏感性及耐藥性

腫瘤類器官模型已用于藥物篩選研究和生物標(biāo)志物分析[2, 34-35]。Shah等[6]將細(xì)胞代謝的光學(xué)成像技術(shù)與類器官技術(shù)結(jié)合，對類器官細(xì)胞異質(zhì)性和標(biāo)準(zhǔn)化治療的反應(yīng)，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡和體內(nèi)腫瘤體積以及在平行研究中驗證每個治療組的治療功效進(jìn)行了定量和定性分析。結(jié)果表明光學(xué)代謝成像在治療1 d后對類器官中的治療反應(yīng)敏感(P<0.05)，具有不同代謝表型的細(xì)胞亞群可提供靈敏的高通量測定，以簡化頭頸惡性腫瘤藥物開發(fā)的過程。Tanaka[5]團(tuán)隊分別測試相應(yīng)類器官對順鉑及多西他賽的藥物敏感性以及耐藥范圍，類器官藥物敏感性及耐藥性存在個體差異。Driehuis等[23]使用了突變和轉(zhuǎn)錄作用、染色體穩(wěn)定性、異種移植、新藥和常規(guī)化療/放療測試。此外，Driehuis 團(tuán)隊還使用頭頸鱗狀細(xì)胞癌類器官模型通過抗體-納米體光敏劑結(jié)合物來評估表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor,EGFR)靶向光動力療法的潛力，發(fā)現(xiàn)來自不同患者的腫瘤類器官的EGFR表達(dá)水平不同，EGFR表達(dá)水平與EGFR靶向光動力療法的療效相關(guān)，從周圍正常組織培養(yǎng)的類器官顯示出比其腫瘤對應(yīng)類器官更低的EGFR表達(dá)水平，提示納米體靶向光動力療法比抗體靶向光動力療法更有效[4]。體外建立頭頸惡性腫瘤類器官模型，保留了原代腫瘤的許多特性，這些類器官可以預(yù)測體內(nèi)的藥物敏感性，且有望成為頭頸惡性腫瘤精確治療的有用工具。

3.3 頭頸惡性腫瘤免疫治療

細(xì)胞程序性死亡受體/配體(programmed cell death protein 1/programmed cell death 1 ligand 1，PD-1/PD-L1)免疫療法是當(dāng)前備受矚目的新一類抗癌療法, 抗PD-1抗體和PD-L1抗體在頭部腫瘤尤其是在頭頸鱗狀細(xì)胞癌的治療上已經(jīng)取得了重要的進(jìn)展[36-37]。目前至少有5種抗PD-1和抗PD-L1抗體正處于臨床研究階段：pembrolizumab和nivolumab作用于PD-1靶點，德瓦魯單抗(durvalumab，又稱MEDI4736)、阿維單抗(avelumab)和阿特珠單抗(atezolizumab，又稱MPDL3280A)作用于PD-L1靶點，但頭頸惡性腫瘤的免疫療法相對滯后，類器官技術(shù)的應(yīng)用有助于免疫治療的發(fā)展。Neal等[30]利用腫瘤類器官成功地模擬了具有抗PD-1和/或抗PD-L1擴(kuò)增和激活腫瘤抗原特異性浸潤性淋巴細(xì)胞并引發(fā)腫瘤細(xì)胞毒性的免疫檢查點封鎖，該研究提示具有內(nèi)源性免疫基質(zhì)的腫瘤類器官能進(jìn)行免疫腫瘤學(xué)研究，并促進(jìn)個性化免疫療法檢測，有利于癌癥患者的個體化精準(zhǔn)治療。

3.4 再生醫(yī)學(xué)

頭頸部惡性腫瘤的放射治療會導(dǎo)致唾液腺的損傷，出現(xiàn)口腔干燥等癥狀。Bücheler 等[38]在微載體中培養(yǎng)唾液腺類器官，提出了重構(gòu)唾液腺功能的新概念。Ozdemir 等[39]利用從正常唾液腺組織分離的原代人涎腺肌上皮細(xì)胞(human salivary gland myoepithelial cells，hSMECs)和干/祖細(xì)胞來生成唾液腺微組織，在多代培養(yǎng)過程中，肌上皮細(xì)胞的表型與其他外分泌組織的表型一致。此外，hSMECs分泌基底膜蛋白，表達(dá)腎上腺素能和膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)受體，并在副交感神經(jīng)激動劑的作用下釋放細(xì)胞內(nèi)鈣。功能性腮腺類器官成功培養(yǎng)，有望重構(gòu)唾液腺功能，幫助癌癥患者解決口干問題。

4 展望

為了建立更好的藥物篩選模型，研究人員應(yīng)用并發(fā)展了頭頸部腫瘤類器官培養(yǎng)技術(shù)，利用類器官擁有的能夠長期傳代、維持遺傳異質(zhì)性、可凍存及復(fù)蘇等優(yōu)點,有望建立頭頸腫瘤類器官生物庫。頭頸腫瘤類器官生物庫一旦建立, 我們可以使用各種類型的頭頸部類器官腫瘤模型,對其進(jìn)行基因組測和表達(dá)譜分析，可以用于篩選突變基因，作為藥物篩選“替身”，測試抗癌藥物的敏感性以及耐藥性，開發(fā)免疫治療新藥等。放射治療所致唾液腺損傷有望使用腮腺類器官重構(gòu)唾液腺功能，幫助癌癥患者解決口干問題。類器官模型有許多優(yōu)點，但也存在缺點。類器官培養(yǎng)的難點在于如何在體外重建腫瘤微環(huán)境，現(xiàn)有研究人員將腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)，作為評價腫瘤微環(huán)境的有用工具[31]，也有使用干/祖細(xì)胞、支架和特定的調(diào)節(jié)因子來提供模擬器官發(fā)生的微環(huán)境的方法[40]。類器官模型可用于研究腫瘤細(xì)胞與包括基質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的微環(huán)境之間的互作關(guān)系。未來的腫瘤類器官研究也會更加注重培養(yǎng)體系的完善, 如加入巨噬細(xì)胞或者淋巴細(xì)胞、血管類器官、神經(jīng)元等，使得類器官的培養(yǎng)體系更加接近于活體的腫瘤微環(huán)境, 進(jìn)而為研究微環(huán)境與腫瘤之間的關(guān)系提供一個理想的模型，為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供更多支持。