張 明 梁志云 張俊杰 張健民 余 香 昌水平 蔣三元

廣東省江門市新會(huì)區(qū)中醫(yī)院，廣東 江門 529100

通城虎，又名大力王藤、五虎通城、定心草等，為馬兜鈴科馬兜鈴屬植物通城虎AristolochiafordianaHemsl.的根或全株，其味苦、辛，性溫，有小毒，有解毒消腫、祛風(fēng)鎮(zhèn)痛、行氣止咳之功[1]，是兩廣及香港地區(qū)常用中草藥，在廣東新會(huì)地區(qū)民間被廣泛使用，常用于胃痛、風(fēng)濕骨痛、跌打損傷、毒蛇咬傷等。通城虎是我院傳統(tǒng)制劑消瘀跌打藥酒中的主要藥材之一，該制劑具有驅(qū)風(fēng)活血、散瘀止痛的功效，用于跌打腰痛、扭挫傷。通城虎含馬兜鈴酸類成分可在體內(nèi)經(jīng)一系列硝基還原酶代謝活化后與DNA共價(jià)結(jié)合形成加合物而誘發(fā)癌變,并通過誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡及間質(zhì)纖維化而導(dǎo)致“馬兜鈴酸腎病 ”(AAN)[3]。馬兜鈴酸主要含有馬兜鈴酸I和馬兜鈴酸II兩種化合物，其中前者是馬兜鈴酸主要的毒性成分，為了確定通城虎和其消瘀跌打藥酒制劑的毒性成分含量，有效控制其內(nèi)在質(zhì)量和臨床用藥的安全，本實(shí)驗(yàn)參考有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[4-6]，采用高效液相色譜法，對(duì)通城虎藥材和消瘀跌打藥酒制劑中的馬兜鈴酸I進(jìn)行含量測定，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 儀器和試藥

1.1 主要儀器 島津LC-20A高效液相色譜儀(日本)；Jeken PS-10超聲波清洗器(潔康超聲波清洗機(jī)有限公司)；HZK-FA210電子天平(福州華志科學(xué)儀器有限公司)；MILLIPORE超純水器(廣州東銳科技有限公司)。

1.2 試藥 馬兜鈴酸I對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110746-201611)；通城虎藥材共2批次(160201，1905001)；消瘀跌打藥酒(江門市新會(huì)區(qū)中醫(yī)院配制，批號(hào)：20190301、20190725、20191126)；甲醇為色譜純，冰醋酸為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-XP柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動(dòng)相：甲醇-0.05%冰醋酸溶液(53∶47)，檢測波長250 nm，流速為 1 mL·min-1，柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 流動(dòng)相的選擇 選用乙腈-0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)[7]，結(jié)果樣品色譜圖中出現(xiàn)連續(xù)峰、分離度差。根據(jù)文獻(xiàn)資料[8-9]，選用甲醇-0.05%冰醋酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，所得色譜圖中馬兜鈴酸I的分離度大于1.5，峰形良好，保留時(shí)間適合，作為本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相。

2.3 供試液的制備

2.3.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱取馬兜鈴酸I對(duì)照品約9.71 mg，置50 mL量瓶中，加適量甲醇溶液，振蕩溶解，加甲醇溶液定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液，濃度為194.2 μg·mL-1。

2.3.2 馬兜鈴酸I對(duì)照品溶液的制備 精密吸取2.2.1對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為馬兜鈴酸I對(duì)照品溶液，濃度為9.71 μg·mL-1。

2.3.3 通城虎供試品溶液的制備 精密稱取通城虎藥材粉末0.5150g，先加入10%氨水20 mL，浸泡40 min，超聲處理30 min，濾過，濾液用乙醚洗滌2次，每次20 mL，棄去乙醚洗滌液，取水層加入稀鹽酸調(diào)pH至3～4，再用乙醚萃取2次，每次20 mL，合并乙醚萃取液，水浴蒸干，殘?jiān)眉状?0 mL溶解，0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液作為供試品溶液。

2.3.4 消瘀跌打藥酒供試品溶液的制備 精密量取消瘀跌打藥酒60 mL，水浴蒸干，殘?jiān)燃尤?0%氨水20 mL溶解，濾過，自濾液用乙醚洗滌2次，每次20 mL起，按2.3.4通城虎供試品溶液的制備方法操作，作為消瘀跌打藥酒供試品溶液。

2.3.5 消瘀跌打酒陰性對(duì)照溶液的制備 取缺少通城虎藥材的消瘀跌打酒陰性樣品60 mL，按2.3.4消瘀跌打藥酒供試品溶液的制備項(xiàng)下操作，作為陰性對(duì)照品溶液。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 在2.1項(xiàng)下色譜條件下，分別精密吸取馬兜鈴酸I對(duì)照品溶液、消瘀跌打藥酒供試品溶液、消瘀跌打藥酒陰性對(duì)照溶液和通城虎供試品溶液各10 μL，分別注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定。結(jié)果表明，消瘀跌打藥酒供試品液與馬兜鈴酸I對(duì)照品液的峰型和保留時(shí)間一致，消瘀跌打藥酒陰性對(duì)照無干擾。如圖1所示。

圖1 HPLC色譜譜

2.5 線性關(guān)系 精密量取2.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液5份，每份1 mL，分別加甲醇稀釋至50、25、20、10、5 mL，搖勻，濃度分別為3.884、7.768、9.71、19.42和38.84 μg·mL-1。注入高效液相色譜儀，在2.1項(xiàng)下色譜條件下測定，以吸收峰面積Y為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液的進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，計(jì)算得回歸方程：Y=55825X-12839，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。結(jié)果表明，馬兜鈴酸I對(duì)照品在0.03～0.38 μg范圍內(nèi)的進(jìn)樣量與色譜峰面積值的線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn) 取馬兜鈴酸I對(duì)照品溶液，每次10 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次，測定馬兜鈴酸I對(duì)照品峰面積的RSD為0.92%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一通城虎和消瘀跌打藥酒供試品溶液，在0、2、4、6、8、10、24 h進(jìn)樣，其馬兜鈴酸I峰面積的RSD分別為1.24%、1.09%。試驗(yàn)表明供試品24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取消瘀跌打藥酒(批號(hào)：20190301)和通城虎(批號(hào)：160201)各5份，按上述供試品溶液的制備操作；計(jì)算馬兜鈴酸I的含量。消瘀跌打藥酒中馬兜鈴酸I的平均含量為0.7133 μg·mL-1，RSD為1.31%；通城虎中馬兜鈴酸I的平均含量為0.0623 mg·g-1，RSD為1.09%。

2.9 回收率試驗(yàn) 精密吸取已知含量的消瘀跌打藥酒樣品(20190301，馬兜鈴酸I含量為0.7133 μg·mL-1)30 mL，稱取已知含量的通城虎樣品(160201，馬兜鈴酸I含量為0.0623 mg·g-1)約0.25 g，各制備5份，分別精密加入一定量的馬兜鈴酸I對(duì)照品，按上述供試品溶液的制備與測定方法操作，計(jì)算馬兜鈴酸I的回收率。消瘀跌打藥酒中馬兜鈴酸I的回收率平均為99.08%，RSD為0.61%；通城虎中馬兜鈴酸I的回收率平均為98.65%，RSD為1.58%。

2.10 樣品含量測定 按2.2.4項(xiàng)制備消瘀跌打藥酒供試品溶液并測定，3批制劑樣品中馬兜鈴酸I的含量測定結(jié)果見表1；按2.2.3項(xiàng)制備通城虎供試品溶液并測定，通城虎中馬兜鈴酸I含量測定結(jié)果見表2。

表1 消瘀跌打藥酒中馬兜鈴酸I含量測定結(jié)果 (n=3)

表2 通城虎中馬兜鈴酸I含量測定結(jié)果 (n=2)

3 討論

首先參考文獻(xiàn)方法[10-11]，使用甲醇提取方法制備供試品溶液，結(jié)果得到的色譜圖基線高、色譜峰數(shù)量多，而且在馬兜鈴酸I出峰位置有干擾；再參考文獻(xiàn)資料方法[12-14]，結(jié)合實(shí)驗(yàn)品種情況作出調(diào)整，采用先在堿性水溶液中用乙醚洗滌、去除乙醚的可溶成分，將水層溶液加鹽酸酸化，再用乙醚萃取的提取方法制備供試品溶液，減少樣品中的非測定組分，結(jié)果在馬兜鈴酸I出峰位置無干擾，分離度好，色譜峰數(shù)量明顯減少，因此選擇上述方法制備通城虎及消瘀跌打藥酒供試液。

本試驗(yàn)方法進(jìn)行3批次消瘀跌打藥酒馬兜鈴酸I的含量測定，馬兜鈴酸I的含量在0.7133～0.7298 μg/mL之間，平均含量是0.7206 μg/mL。各批次馬兜鈴酸I的含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值為1.17%。2批次通城虎中馬兜鈴酸I平均含量為0.0617 mg·g-1。結(jié)果表明，建立的通城虎及消瘀跌打藥酒中馬兜鈴酸I高效液相色譜含量測定方法準(zhǔn)確、簡便、快速、重復(fù)性好，適應(yīng)藥材及制劑的質(zhì)量控制的要求。