魏然 孫艷波

【摘 要】在測(cè)定醬油中苯甲酸過程中，目標(biāo)峰附近會(huì)出現(xiàn)雜質(zhì)峰，干擾積分進(jìn)而影響定量。本文采用超高液相色譜法，對(duì)用乙醚提取醬油中苯甲酸和用固相萃取法過濾雜質(zhì)兩種提取方式進(jìn)行對(duì)比。在0.01～1.0μg范圍內(nèi)，苯甲酸呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）為1;乙醚提取法苯甲酸的回收率為91.34～99.67%，該方法涉及試劑少、處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速準(zhǔn)確、易用于實(shí)際樣品的測(cè)定，同時(shí)加標(biāo)回收率更高;固相萃取法苯甲酸的回收率為85.64～93.40%，該方法不需使用毒性大的試劑，分離效果好，基質(zhì)干擾少，基線平穩(wěn)更有利于積分。同時(shí)，采用超高液相法，苯甲酸出峰在2.3min左右，相較于高效液相色譜法提速近3倍。在實(shí)際應(yīng)用上適合大批量檢驗(yàn)任務(wù)。

【關(guān)鍵詞】超高液相色譜法;醬油;乙醚;固相萃取

中圖分類號(hào)： O657.72;TQ460.72 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 2095-2457（2019）12-0011-003

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.12.005

【Abstract】During the determination of benzoic acid in soy sauce，impurity peaks appear near the target peak，which interfere with the integral and then affect the quantification.Ultra-high performance liquid chromatography（Ultra-high performance liquid chromatography） was used to compare the extraction methods of benzoic acid from soy sauce with ether and solid phase extraction（SPE）to filter impurities.In the range of 0.01-1.0 ug，the correlation coefficient（r） is 1.The recovery of benzoic acid by ether extraction method is 91.34-99.67%.This method involves less reagents， simple treatment，rapid and accurate detection，and is easy to be used for the determination of actual samples.The recovery rate of benzoic acid by solid phase extraction is 85.64-93.40%.This method does not need to be used with high toxicity.The reagent has good separation effect，less matrix interference，and stable baseline is more conducive to integration.At the same time，the peak of benzoic acid was about 2.3 minutes by ultra-high performance liquid chromatography，which was nearly three times faster than that by high performance liquid chromatography.In practical application，it is suitable for mass inspection task.

【Key words】Ultra Performance Liquid Chromatography;Soy sauce;Ether;Solid phase

醬油是我國(guó)傳統(tǒng)調(diào)味品，主要以大豆、小麥、食鹽等作為原料，經(jīng)過預(yù)處理、發(fā)酵、制油等工序釀制而成。由于其中含有豐富的氨基酸、核苷酸、可溶性蛋白質(zhì)、糖類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，細(xì)菌等微生物的侵襲會(huì)使醬油腐敗變質(zhì)。為了防止醬油中微生物的繁殖，大多使用食品防腐劑苯甲酸及其鹽類。苯甲酸及其鈉鹽進(jìn)入機(jī)體后，在肝臟內(nèi)與甘氨酸結(jié)合形成馬尿酸， 或與葡萄糖醛酸結(jié)合形成葡萄糖苷酸，經(jīng)尿排出體外。隨著現(xiàn)代食品工業(yè)的發(fā)展，食品添加劑的超量和超范圍使用現(xiàn)象十分嚴(yán)重，對(duì)食品添加劑的檢測(cè)也越來越受到人們的重視。

苯甲酸的檢測(cè)方法主要有紫外分光光度法、氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法，其中高效液相色譜法是檢測(cè)苯甲酸最常用的方法。由于醬油的發(fā)酵工藝產(chǎn)生多種有機(jī)物，采用GB5009.28-2016第一法高效液相法，按一般性試樣處理測(cè)定醬油中苯甲酸時(shí)會(huì)在目標(biāo)峰前產(chǎn)生雜質(zhì)峰，尤其是批次量大時(shí)，雜質(zhì)峰會(huì)隨著樣品進(jìn)針次數(shù)的增加，不斷增高，不僅影響積分定量，也會(huì)極大地降低柱效，因此，在測(cè)定前對(duì)醬油樣品進(jìn)行純化處理是十分必要的。

本文采用乙醚提取苯甲酸和固相萃取過濾雜質(zhì)兩種方法對(duì)醬油中苯甲酸進(jìn)行提取，從精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加標(biāo)回收等幾個(gè)方面展開分析并討論，以期對(duì)日常檢測(cè)起到借鑒作用。同時(shí)引入超高液相色譜法（UPLC），利用其前處理簡(jiǎn)單、儀器精度高，分析時(shí)間更短等優(yōu)勢(shì)，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用性。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Waters超高效液相色譜儀，2695紫外檢測(cè)器，Waters empower工作站（美國(guó)Waters公司），C18柱（4.6mm×250mm，10μL），Sartorius CPA225D電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司），OASIS？誖HLB固相萃取小柱（3cc，60mg），Agela固相萃取裝置。

1.2 對(duì)照物質(zhì)

苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，GBW（E）100006），由中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院提供。

1.3 超高效液相色譜條件

色譜柱：C18 250mm×4.6mm，5～10μm;流動(dòng)相：甲醇∶0.02mol/L乙酸銨溶液（5∶95）;流速：1.0mL/min;進(jìn)樣量：5μL;檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)：230nm。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

使用液的制備（100mg/L）：準(zhǔn)確移取1000mg/L儲(chǔ)備液1ml，至10ml容量瓶。用水定容。

標(biāo)曲的配制：分別移取0mL、0.1mL、0.5mL、1mL、2mL、5mL、10mL使用液，用水定容至10mL，配制成質(zhì)量濃度分別為0mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。取適量標(biāo)液過0.22μm濾膜，待液相色譜測(cè)定。

按1.3中的色譜條件進(jìn)樣分析，以標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 樣品的預(yù)處理

1.5.1 乙醚法提取樣品中苯甲酸

準(zhǔn)確稱取醬油樣品2g于小燒杯中，滴加乙酸數(shù)滴調(diào)節(jié)pH至4～5，轉(zhuǎn)移至20ml容量瓶中，用乙醚潤(rùn)洗小燒杯數(shù)次，潤(rùn)洗液合并至容量瓶，用乙醚定容，振搖2min混勻。吸取1ml于試管中，水浴40℃蒸干，加2.0ml流動(dòng)相溶解。取適量樣液過0.22μm濾膜，待液相色譜測(cè)定。

1.5.2 固相萃取法提取樣品中苯甲酸

準(zhǔn)確稱取1g樣品，加水40ml，用20%磷酸調(diào)節(jié)pH至1～2，用水定容至50.0ml。取固相萃取柱加5ml甲醇活化，再加5ml水平衡小柱，然后取5.0ml樣品清液，以1.0ml/min流速通過萃取住，用5ml5%甲醇-0.1%磷酸溶液清洗萃取柱，棄去清洗液。最后用3ml甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，用水定容至10ml。取適量樣液過0.22μm濾膜，待液相色譜測(cè)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 線性范圍的考察

精密吸取苯甲酸溶液（100mg/L）0.1μL、0.5μL、1μL、2μL、3μL、5μL、7μL、10μL。按上述色譜條件，注入高效液相色譜儀，以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，回歸方程為Y=1E+06X+15233。結(jié)果顯示，進(jìn)樣量在0.01～1.0μg范圍內(nèi)，回歸方程相關(guān)系數(shù)R=1，與峰面積呈良好的線性關(guān)系，見圖1。

2.2 精密度考察

精密吸取苯甲酸溶液10μL，注入超高效液相色譜儀，重復(fù)測(cè)定7次，結(jié)果RSD%為0.028%，表明精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份樣品，分別在0、1、2、4、8、12h測(cè)定，計(jì)算苯甲酸含量的RSD%為0.016%，穩(wěn)定性良好。

2.4 空白試驗(yàn)

取不含苯甲酸的樣品分別按照1.5.1，1.5.2項(xiàng)下方法制備試樣，測(cè)定。空白試樣中未出現(xiàn)與苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間相同的色譜峰，見圖。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一樣品共6份，分別按照1.5.1，1.5.2項(xiàng)下方法制備試樣，測(cè)定并計(jì)算RSD%。結(jié)果乙醚提取苯甲酸平均含量0.219mg/kg，RSD%=1.77%;固相萃取提取苯甲酸平均含量0.202mg/kg，RSD%=2.75%。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

按照1.5.1，1.5.2項(xiàng)下方法分別制備試樣2組，各三份，同時(shí)在稱取樣品后即在試樣中加入苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品，乙醚提取法加入100mg/L苯甲酸3.5ml，固相萃取法加入100mg/L苯甲酸2.5ml。測(cè)定結(jié)果，乙醚提取法苯甲酸的回收率為91.34～99.67%;固相萃取法苯甲酸的回收率為85.64～93.40%。

3 討論

參考圖5、圖6可知，乙醚提取與固相萃取兩種方法都可有效地提取目標(biāo)物，適用于在測(cè)定峰附近有雜質(zhì)峰樣品的測(cè)定。乙醚提取法將樣品經(jīng)酸化后，用乙醚定量提取，然后取—部分提取液蒸發(fā)乙醚后定量溶解，再進(jìn)行液相色譜測(cè)定。該方法涉及試劑少、處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速準(zhǔn)確、易用于實(shí)際樣品的測(cè)定，同時(shí)加標(biāo)回收率更高。采用固相萃取法測(cè)定實(shí)際樣品，不需使用毒性大的試劑，分離效果好，基質(zhì)干擾少，基線平穩(wěn)更有利于積分，回收率在85.64～93.40%，也完全能滿足分析要求。

另外，本文采用了超高液相色譜法，與高效液相色譜法相比，目標(biāo)峰出峰更快，參考GB 5009.28-2016附錄A中給出的色譜圖，苯甲酸出峰時(shí)間在8min左右，而采用超高液相法，苯甲酸出峰在2.3min左右，提速近3倍，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期，節(jié)約了流動(dòng)相的同時(shí)，提高了實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性，在實(shí)際應(yīng)用上適合大批量檢驗(yàn)任務(wù)。

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