陳 雯 劉 勛 李欣茹 程 韜 陳 鳳

貴州省食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 貴陽 550001

玄麥甘桔顆粒是由玄參、麥冬、甘草、桔梗四味藥材的水煎液濃縮為稠膏，加入適量的輔料(蔗糖或糊精)制成的顆粒[1]811。處方中四味藥材用量均等，玄參清熱解毒,麥冬潤(rùn)肺養(yǎng)陰,甘草補(bǔ)脾調(diào)和諸藥，桔梗能宣肺祛痰，四藥合用，有清熱解毒、滋陰降火、祛痰利咽的功效。但在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制上，《中國(guó)藥典》2015年版通過薄層色譜和高效液相色譜法對(duì)其中玄參、甘草進(jìn)行定性和定量控制，對(duì)麥冬和桔梗未進(jìn)行質(zhì)量控制。文獻(xiàn)報(bào)道中，也多對(duì)甘草酸、甘草苷、哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸進(jìn)行研究，而未建立其中桔梗藥味的質(zhì)量控制方法。

桔梗有宣肺、利咽、祛痰、排膿的功效[1]277，趙秀玲[2]指出桔梗在食用和藥用上都有較高的價(jià)值，其中主要活性成分為皂苷類，具備抗高溫、抗水腫、抗毒、抗炎等作用。而桔梗皂苷D是桔梗皂苷中的主要皂苷[4]，本實(shí)驗(yàn)通過建立桔梗皂苷D的含量測(cè)定方法，為進(jìn)一步評(píng)價(jià)玄麥甘桔顆粒的品質(zhì)提供科學(xué)的辦法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695液相色譜儀及配套工作站，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，色譜柱為Agilent C18柱,4.6 mm×150 mm,流速1.0 mL/min。

1.2 試藥 玄麥甘桔顆粒分別來自于云南白藥股份有限公司(樣1、樣2)、葵花藥業(yè)集團(tuán)(重慶)有限公司(樣3、樣4)、太極集團(tuán)重慶中藥二廠有限公司(樣5、樣6)；桔梗皂苷D來源于中國(guó)食品藥品檢定研究院(批號(hào)：111851-201405，含量:93.0%)；乙腈為色譜純，甲醇、正丁醇、氨水、等試液均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18(250 mm×4.6 mm 5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(25∶75)：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)；柱溫30 ℃；流速：1.0 mL/min；測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品溶液10 μL與供試品溶液10～20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取桔梗皂苷D對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.25 mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的本品，混勻，取適量，研細(xì)，取約20 g，精密稱定，置具塞錐瓶中，精密加入甲醇150 mL，稱定重量，超聲(功率250 w,頻率35 kHz)提取30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過,精密量取續(xù)濾液100 mL，置水浴上蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨試液50 mL洗滌，棄去氨液，再用正丁醇飽和的水50 mL洗滌，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.4 陰性供試品溶液的制備 取缺桔梗的陰性樣品，按照2.3制備成陰性供試品溶液，即得。

2.5 專屬性考察 取桔梗皂苷D對(duì)照品溶液、玄麥甘桔顆粒供試品溶液及陰性供試品溶液，按照“2.1”色譜條件注入液相色譜儀，供試品溶液色譜在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置有相應(yīng)的色譜峰，且陰性無干擾，如圖1所示。

圖1 玄麥甘桔顆粒桔梗皂苷D色譜圖

2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取桔梗皂苷D對(duì)照品溶液(0.2397 μg/mL)2 μL、4 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL依次注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得出桔梗皂苷D線性回歸方程為：y=1.7258x-0.4426,r=0.9994。桔梗皂苷D在0.4794～5.9915 μg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗(yàn) 精密量取同一混合對(duì)照品10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖峰面積，桔梗皂苷D對(duì)照品的峰面積RSD為0.5%，結(jié)果說明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批玄麥甘桔顆粒，按“2.3”供試品溶液制備方法制備6份，按“2.1”色譜條件測(cè)定桔梗皂苷D的含量，結(jié)果測(cè)定桔梗皂苷D平均含量43.3 μg/g,RSD為1.8%，表明方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批玄麥甘桔顆粒，按“2.1”色譜條件，于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、18 h，測(cè)定桔梗皂苷D的峰面積，RSD為1.7%，表明供試品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法.取已測(cè)定含量的玄麥甘桔顆粒(平均含量43.3 μg/g)10 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入含桔梗皂苷D對(duì)照品溶液(2.12412 μg/mL)150 mL,稱定重量，自“超聲處理……”起按“2.3”供試品溶液制備方法制備6份，按“2.1”色譜條件測(cè)定桔梗皂苷D的含量，計(jì)算回收率。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度良好,見表1。

2.11 樣品測(cè)定 取三家企業(yè)各2批玄麥甘桔顆粒樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”色譜條件測(cè)定桔梗皂苷D的含量， 結(jié)果見表2。

表1 桔梗皂苷D回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 三家企業(yè)樣品含量結(jié)果

3 討論

桔梗皂苷D為2015年版《中國(guó)藥典》桔梗的含量控制指標(biāo)，丁大勇等[3]采用75%乙醇對(duì)樣品進(jìn)行回流提取，提取液離心，上清液大孔樹脂吸附過柱，不同濃度乙醇洗脫。文獻(xiàn)[4]也提出了大孔吸附樹脂分離桔?？傇碥盏姆椒?。朱丹妮等[5]以甲醇為溶劑，使用超聲提取法提取桔梗中的桔梗皂苷D，不進(jìn)行后續(xù)純化處理?！吨袊?guó)藥典》桔梗項(xiàng)下方法最為復(fù)雜，使用50%甲醇超聲提取后，對(duì)提取液進(jìn)行了萃取、萃取后藥液加于硅膠柱上，以三氯甲烷-甲醇不同比例混合溶液分次洗脫[1]277。

參照《中國(guó)藥典》和相關(guān)文獻(xiàn)[3-7]，考察實(shí)驗(yàn)條件。單純超聲提取，桔梗皂苷D和其他成分無法達(dá)到較好的分離效果；超聲提取后，使用正丁醇萃取，氨試液洗滌，樣品能較好分離；在此基礎(chǔ)上分別使用大孔樹脂和硅膠柱進(jìn)行洗脫分離，結(jié)果大孔樹脂分離的結(jié)果含量較低，硅膠柱分離結(jié)果含量與未過柱前無明顯差異，故選擇了更加簡(jiǎn)單、且無需使用易制毒試劑三氯甲烷的方法。

在供試品溶液制備提取溶劑的選擇中，對(duì)50%甲醇、80%甲醇、甲醇、乙醇的提取效果進(jìn)行比較，結(jié)果乙醇提取含量較低，而不同濃度的甲醇提取含量值無明顯變化，因甲醇處理的樣品容易過濾，故選擇甲醇方便操作。經(jīng)方法學(xué)考察，表面本法準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，靈敏度高，為今后桔梗皂苷D在制劑中的定量分析提供參考。