曹蔚堂，王文欣

0 引 言

膿毒癥是由感染導(dǎo)致器官功能障礙的臨床綜合征，是導(dǎo)致危重癥患者死亡的重要原因之一[1]。盡管抗感染治療、重癥監(jiān)護(hù)及器官保護(hù)措施顯著降低了膿毒癥患者死亡率，然而患者長期預(yù)后仍然較差[2]。因此，研究影響膿毒癥發(fā)病機(jī)制相關(guān)因素至關(guān)重要。炎癥反應(yīng)的過度激活導(dǎo)致的免疫功能障礙是膿毒癥的主要發(fā)病機(jī)制[3]。巨噬細(xì)胞是針對微生物入侵防御的第一道防線，在先天性免疫系統(tǒng)中有重要的作用。自噬與炎癥反應(yīng)和免疫密切相關(guān)，膿毒癥中自噬的激活能夠通過負(fù)調(diào)控異常巨噬細(xì)胞的活化、減少炎癥小體的活化和炎癥因子的釋放等途徑發(fā)揮保護(hù)作用[4]。LncRNA人漿細(xì)胞瘤變體易位1(LncRNA-plasmacytoma variant translocation 1，LncRNA-PVCT1)是一種長鏈非編碼RNA，研究表明PVT1與膿毒癥大鼠炎癥反應(yīng)、心臟功能障礙及急性腎損傷的發(fā)生有關(guān)[5-6]。目前LncRNA-PVT1在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬的相關(guān)機(jī)制尚不清楚。因此，本研究通過LPS體外刺激巨噬細(xì)胞，并轉(zhuǎn)染PVT1 siRNA重組質(zhì)粒，探討膿毒癥中PVT1在巨噬細(xì)胞自噬中的可能作用機(jī)制，為膿毒癥發(fā)病機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7購自于中國科學(xué)院細(xì)胞庫；DMEM、Glutamax、Sodium Pyruvate(11360070)、Lipofectamine 3000試劑盒購自美國Invitrogen公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；Alexa Fluor 488 anti-rabbit IgG購自美國Thermo Fisher公司；RNAiso plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR Premix Ex TaqTM II購自日本TAKARA公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素6(IL-6)、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購自美國BD Bioscience；兔抗鼠自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)、Beclin-1、ATG12、p62一抗、β-actin、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)、蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司；PVT1 mRNA、PVT1、PVT1-NC、PVT1 siRNA、si-NC、miR-148b、miR-148b mimics、miR-NC、U6、GAPDH，生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

共聚焦激光掃描顯微鏡LSM710購自德國Zeiss；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)儀ABI7300購自美國ABI公司；酶標(biāo)儀(Multiskan FC)購自美國Thermo Fisher公司；蛋白凝膠成像儀(ChemiDoc XRS)購自美國BIO-RAD公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理巨噬細(xì)胞株RAW264.7，培養(yǎng)于含DMEM完全培養(yǎng)液(DMEM 88 mL，Glutamax 1 mL，Sodium Pyruvate 100nmol/L，F(xiàn)BS 10 mL)中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。2～3 d更換一次培養(yǎng)液，3～5 d進(jìn)行一次傳代，傳代時(shí)，吸走部分營養(yǎng)液，留下少許營養(yǎng)液，無菌細(xì)胞刮拭培養(yǎng)表面細(xì)胞，吹打后接種至新培養(yǎng)瓶內(nèi)。

收集上述巨噬細(xì)胞RAW264.7，調(diào)整濃度為1×105個(gè)/mL，吸取100 μL細(xì)胞懸液加至96孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，培養(yǎng)液更換為含有10 μg/mL的LPS，培養(yǎng)4 h[7]。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組收集1.2.1中LPS細(xì)胞RAW264.7，調(diào)整細(xì)胞濃度為6×105個(gè)/孔接種至6孔板中，細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，更換為含10μg/mLLPS的無血清DMEM培養(yǎng)基。利用Lipofectamine 3000進(jìn)行對RAW264.7進(jìn)行轉(zhuǎn)染，操作嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。將細(xì)胞分為LPS組(細(xì)胞不進(jìn)行轉(zhuǎn)染)、LPS+si-NC組(轉(zhuǎn)染PVT1質(zhì)粒陰性對照)、LPS+PVT1 siRNA轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染PVT1 siRNA質(zhì)粒)、LPS+miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-148b mimics 陰性對照)、LPS+miR-148b mimics組(轉(zhuǎn)染miR-148b mimics)、LPS+PVT1-NC+miR-148b mimics組(轉(zhuǎn)染PVT1陰性對照和miR-148b mimics)、LPS+PVT1+miR-148b mimics組(轉(zhuǎn)染PVT1和miR-148b mimics)，上述各組均經(jīng)過LPS處理。同時(shí)設(shè)置空白組，空白組RAW264.7細(xì)胞既不進(jìn)行LPS處理也不進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.3qRT-PCR檢測細(xì)胞中LncRNA-PVT1、miR-148b的表達(dá)RNAiso Plus試劑盒提取1.2.2中空白組、LPS組、LPS+si-NC組及LPS+PVT1 siRNA組細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取到的RNA反轉(zhuǎn)錄呈cDNA，并進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為預(yù)變性 95 ℃ 30 s，變性 95 ℃ 30 s，退火 60 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。分別以GAPDH和U6作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算各組巨噬細(xì)胞RAW264.7中LncRNA-PVT1、miR-148b的相對表達(dá)量。引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 引物序列

1.2.4CCK-8法檢測細(xì)胞活力收集1.2.2中空白組、LPS組、LPS+si-NC組及LPS+PVT1 siRNA組RAW264.7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/孔接種至96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔僅添加細(xì)胞培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃避光培養(yǎng)2 h，棄上清，酶標(biāo)儀450nm波長處檢測每孔吸光度A值，細(xì)胞活力計(jì)算公式如下：

細(xì)胞活力(%)=[(實(shí)驗(yàn)孔A值-調(diào)零孔A值)/(對照孔A值-調(diào)零孔A值)]×100%

1.2.5免疫熒光染色檢測細(xì)胞中LC3表達(dá)收集1.2.2中各組RAW264.7細(xì)胞，室溫下用4%甲醛固定15 min；5%的Tris緩沖鹽水和Tween-20稀釋的脫脂奶粉中孵育1 h；加入LC3一抗(1∶1000稀釋)，4 ℃孵育過夜，加入二抗(1∶200 稀釋)室溫下孵育1 h；DAPI(100 ng/mL)室溫下孵育細(xì)胞30 min染色。共聚焦激光掃描顯微鏡觀察，Image-J 1.51圖像分析軟件進(jìn)行分析。熒光顯微鏡觀察細(xì)胞著色，細(xì)胞核為藍(lán)色，LC3陽性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)為紅色。

1.2.6ELISA法檢測細(xì)胞中炎癥因子水平收集1.2.2中各組RAW264.7細(xì)胞，以4×104/孔濃度接種至24孔板中，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞上清液，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，ELISA試劑盒檢測細(xì)胞中TNF-α和IL-6的水平，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.7載體構(gòu)建Starbase數(shù)據(jù)庫(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)顯示PVT1基因3’UTR含有與miR-148b的結(jié)合位點(diǎn)，對含結(jié)合位點(diǎn)PVT1區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，并連至pGL4質(zhì)粒，構(gòu)建pGL4-PVT1-WT質(zhì)粒；以此質(zhì)粒對模板進(jìn)行定點(diǎn)缺失(chr8:128902970-128902991位點(diǎn))突變，測序確定突變成功，構(gòu)建pGL4-PVT1-Del質(zhì)粒。

1.2.8雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析測序驗(yàn)證成功的重組質(zhì)粒pGL4-PVT1-WT、pGL4-PVT1-Del和miR-148b NC、miR-148b mimics共轉(zhuǎn)染至巨噬細(xì)胞RAW264.7中，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)基。質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染36h后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞；每孔加入50 μL的1×PLB，震蕩使細(xì)胞全部裂解；不透光96孔酶標(biāo)板中每孔加上述上清液10 μL，加入100 μL雙熒光素酶反應(yīng)試劑Ⅱ，檢測熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度，記為A；測定結(jié)束后加100 μLStop&Glo，檢測內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度，記為B。A/B數(shù)值為熒光素酶相對活性。

1.2.9蛋白免疫印跡法檢測細(xì)胞中自噬蛋白的表達(dá)收集1.2.2中各組細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后調(diào)整濃度為5×105個(gè)/mL，每孔100μL加至96孔板中，棄上清，PBS洗滌2次，重懸細(xì)胞，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒測定總蛋白濃度，蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉遮光封閉2 h；分別加入一抗稀釋液(LC3、Beclin1、p62、β-actin)均為1∶1000稀釋，Beclin-1 1∶2000稀釋，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗稀釋液(1∶1000稀釋)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次。蛋白凝膠成像儀分析蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染效率檢測轉(zhuǎn)染48 h后，顯微鏡下觀察RAW264.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況，轉(zhuǎn)染成功巨噬細(xì)胞RAW264.7均發(fā)出綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率達(dá)80%以上。見圖1。

圖1 倒置顯微鏡觀察RAW264.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況(×200)

2.2RAW264.7細(xì)胞中LncRNA-PVT1、miR-148b表達(dá)情況qRT-PCR結(jié)果表明，與空白組比較，LPS組細(xì)胞PVT1 mRNA表達(dá)顯著升高，miR-148b表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與LPS組、LPS+si-NC組比較，LPS+PVT1 siRNA組細(xì)胞PVT1 mRNA表達(dá)顯著降低，miR-148b表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見圖2。

與空白組比較，*P<0.05；與LPS組比較，#P<0.05；與LPS+si-NC組比較，△P<0.05

2.3沉默LncRNA-PVT1對RAW264.7細(xì)胞活力的影響CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組(100.00±0.00)比較，LPS組細(xì)胞活力(73.46±3.25)顯著降低(P<0.05)；與LPS組(73.46±3.25)、LPS+si-NC組(74.15±4.42)比較，LPS+PVT1 siRNA組細(xì)胞活力(90.38±2.16)顯著升高(P<0.05)。

2.4沉默LncRNA-PVT1對RAW264.7自噬的影響免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)顯示，LC3陽性細(xì)胞質(zhì)為紅色，LPS刺激后，巨噬細(xì)胞RAW264.7中LC3陽性表達(dá)增加；LPS刺激后再轉(zhuǎn)染PVT1 siRNA后，進(jìn)一步增加了細(xì)胞中LC3蛋白的陽性表達(dá)。見圖3。

a：空白組；b：LPS組；c：LPS+si-NC組；d：LPS+PVT1 siRNA組

WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組比較，LPS組細(xì)胞自噬蛋白LC3-II/LC3-I、Beclin-1表達(dá)顯著上調(diào)，p62表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)；與LPS組、LPS+si-NC組比較，LPS+PVT1 siRNA組自噬蛋白LC3-II/LC3-I、Beclin-1表達(dá)顯著上調(diào)，p62表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。見圖4，表2。

1：空白組；2：LPS組；3：LPS+si-NC組；4：LPS+PVT1 siRNA組

表2 沉默LncRNA-PVT1對RAW264.7細(xì)胞自噬蛋白表達(dá)的影響

2.5沉默LncRNA-PVT1對RAW264.7中炎癥因子的影響ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組比較，LPS組細(xì)胞中TNF-α、IL-6表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與LPS組、LPS+si-NC組比較，LPS+PVT1 siRNA組中TNF-α、IL-6表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見圖5。

2.6LncRNA-PVT1靶向調(diào)控miR-148b基因的關(guān)系驗(yàn)證Starbase(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果表明，PVT1基因3’UTR區(qū)有miR-148b的結(jié)合位點(diǎn)，位于LncRNA-PVT1 chr8:128902970-128902991區(qū)域，見圖6。熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染miR NC-pGL4-WT(2.13±0.04)比較，轉(zhuǎn)染miR-148b mimics-pGL4-WT熒光素酶活性(1.13±0.03)顯著降低(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染miR NC-pGL4-Del、miR-148b mimics-pGL4-Del熒光素酶活性(2.11±0.05、2.12±0.03)無顯著性變化(P>0.05)。

圖6 Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測LncRNA-PVT1與miR-148b具有靶向關(guān)系

2.7LncRNA-PVT1過表達(dá)抑制miR-148b過表達(dá)對RAW264.7自噬的影響免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與LPS組、LPS+miR-NC組比較，LPS+miR-148b mimics組細(xì)胞中LC3陽性表達(dá)升高；與LPS+miR-148b mimics組、LPS+PVT1-NC+miR-148b mimics組比較，LPS+PVT1+miR-148b mimics組細(xì)胞中LC3陽性表達(dá)降低，見圖7。

a：LPS組；b：LPS+miR-NC組；c：LPS+miR-148b mimics組；d：LPS+PVT1-NC+miR-148b mimics組；e：LPS+PVT1+miR-148b mimics組

WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與LPS組、LPS+miR-NC組比較，LPS+miR-148b mimics組細(xì)胞自噬蛋白LC3-II/LC3-I、Beclin-1表達(dá)顯著上調(diào)，p62表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)；與LPS+miR-148b mimics組、LPS+PVT1-NC+miR-148b mimics組細(xì)胞比較，LPS+PVT1+miR-148b mimics組細(xì)胞LC3-II/LC3-I、Beclin-1表達(dá)顯著下調(diào)，p62表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖8，表3。

1：LPS組；2：LPS+miR-NC組；3：LPS+miR-148b mimics組；4：LPS+PVT1-NC+miR-148b mimics組；5：LPS+PVT1+miR-148b mimics組

表3 LncRNA-PVT1過表達(dá)抑制miR-148b過表達(dá)對RAW264.7自噬的影響

2.8LncRNA-PVT1過表達(dá)抑制miR-148b過表達(dá)對RAW264.7炎癥的影響ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與LPS組、LPS+miR-NC組比較，LPS+miR-148b mimics組細(xì)胞TNF-α、IL-6表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與LPS+miR-148b mimics組、LPS+PVT1-NC+miR-148b mimics組細(xì)胞比較，LPS+PVT1+miR-148b mimics組細(xì)胞TNF-α、IL-6表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見表4。

表4 LncRNA-PVT1過表達(dá)抑制miR-148b過表達(dá)對RAW264.7炎癥因子表達(dá)的影響

3 討 論

膿毒癥是感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，威脅人類健康并消耗大量的健康資源，具有高發(fā)病率、高死亡率和高治療費(fèi)用的三高特點(diǎn)[1]。膿毒癥初始階段，LPS能夠誘導(dǎo)過度炎癥反應(yīng)[2]。本研究發(fā)現(xiàn)LPS刺激后巨噬細(xì)胞RAW264.7中炎癥因子TNF-α、IL-6表達(dá)顯著升高，細(xì)胞活力受到抑制。巨噬細(xì)胞是機(jī)體抗感染免疫應(yīng)答過程中的主要細(xì)胞。在膿毒癥中，自噬被認(rèn)為是一種限制細(xì)胞損傷和凋亡的細(xì)胞適應(yīng)性保護(hù)機(jī)制[8]，其不僅能夠消除受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，還能夠消除細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)菌和病原體[9]。本研究發(fā)現(xiàn)LPS刺激后，RAW264.7自噬活性顯著升高，提示自噬在膿毒癥中有一定的作用。既往研究表明自噬可能是逆轉(zhuǎn)膿毒癥免疫抑制的有效靶點(diǎn)，增加自噬可以減少器官損傷[10-11]。因此研究與自噬有關(guān)的機(jī)制可能為膿毒癥的治療提供新思路。

LncRNA是一種非編碼長鏈RNA，可與RNA、DNA或蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)蛋白編碼基因的表達(dá)，參與腫瘤形成及炎癥反應(yīng)等過程[12]。LncRNA-PVT1最早發(fā)現(xiàn)于鼠的漿細(xì)胞異位基因中，與胃癌、非小細(xì)胞肺癌等癌癥的發(fā)生有關(guān)[13-14]。有研究發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)的膿毒癥急性腎損傷小鼠模型腎臟組織中PVT1表達(dá)顯著高于正常對照組[5]。本研究結(jié)果表明，LPS刺激后巨噬細(xì)胞PVT1表達(dá)顯著升高，提示PVT1可能參與膿毒癥的發(fā)生機(jī)制。Huang等[15]研究表明PVT1促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的敗血性急性腎損傷，轉(zhuǎn)染si-PVT1能夠降低LPS誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中TNF-α、IL-6等炎癥因子水平。本研究對PVT1進(jìn)行沉默并轉(zhuǎn)染至RAW264.7中，結(jié)果表明PVT1 siRNA組細(xì)胞活力及自噬活性均顯著升高，而炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá)顯著降低，提示PVT1可能抑制LPS刺激后巨噬細(xì)胞的自噬，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥因子水平的升高。

miRNA是一種內(nèi)源性非編碼小RNA，在不同疾病發(fā)病機(jī)制的的先天性和適應(yīng)性免疫中起著重要的作用[16]。在膿毒癥發(fā)病過程中miRNA的表達(dá)與膿毒癥的炎癥反應(yīng)有關(guān)，Zhang等[17]研究表明miR-23b過表達(dá)能夠降低LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞THP-1炎癥因子TNF-α、IL-6的水平。miR-148b屬于miR-148/-152家族，Dong等[18]研究表明miR-148b可能是膿毒癥的候選生物標(biāo)志物。然而對miR-148b在膿毒癥發(fā)病機(jī)制中的作用，目前還少有研究。本研究發(fā)現(xiàn)與空白組比較，LPS組RAW264.7中miR-148b水平顯著降低，提示miR-148b可能參與膿毒癥的發(fā)生。Liu等[19]研究表明miR-148a過表達(dá)增加了自噬活性，從而抑制了肝星狀細(xì)胞LX-2的增殖并促進(jìn)其凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-148b mimics組細(xì)胞自噬蛋白LC3-II/LC3-I、Beclin-1表達(dá)較LPS組顯著上調(diào)，p62表達(dá)、炎癥因子TNF-α、IL-6表達(dá)水平則相反，提示miR-148b可能通過激活巨噬細(xì)胞自噬，減輕RAW264.7的炎癥反應(yīng)。miR-148b的表達(dá)受甲基化、轉(zhuǎn)錄因子及LncRNA等調(diào)控，在自身免疫性疾病、腫瘤發(fā)生、炎癥反應(yīng)等生理病理過程中有關(guān)鍵的作用[20]。Xi等[14]研究表明非小細(xì)胞肺癌組織中PVT1表達(dá)上調(diào)，而miR-148表達(dá)下調(diào)，PVT1通過靶向抑制miR-148促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖和遷移。Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果表明，PVT1基因3’UTR區(qū)有miR-148b的結(jié)合位點(diǎn)，且熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果表明PVT1能夠調(diào)控miR-148b的表達(dá)。進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)PVT1可逆轉(zhuǎn)miR-148b mimics對RAW264.7細(xì)胞自噬能力的促進(jìn)以及炎性反應(yīng)的抑制作用，提示沉默PVT1可能通過靶向下調(diào)miR-148b表達(dá)促進(jìn)巨噬細(xì)胞的自噬，降低炎癥因子水平從而發(fā)揮免疫保護(hù)作用。

綜上所述，LncRNA-PVT1可能通過介導(dǎo)miR-148b抑制膿毒癥巨噬細(xì)胞RAW264.7的自噬，從而引發(fā)過度炎癥反應(yīng)，可能是膿毒癥發(fā)生的機(jī)制。然而本研究僅在體外細(xì)胞水平上探討了膿毒癥LncRNA-PVT1、miR-148b對巨噬細(xì)胞自噬的影響機(jī)制，下一步需結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步炎癥兩者調(diào)控巨噬細(xì)胞自噬對膿毒癥發(fā)展的影響。