羅小琴，趙 云，劉朝奇，鄒云雷，李曉曉

0 引 言

微小RNA(microRNA, miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度約21～25個(gè)核苷酸的非編碼小單鏈RNA，通過(guò)與靶mRNA 3′非翻譯區(qū)部分或完全互補(bǔ)，以促進(jìn)其降解或抑制翻譯，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控。miRNA的異常表達(dá)與各種癌癥相關(guān)，其不僅可作為腫瘤抑制基因或癌基因，還是腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[1-2]。研究表明miRNA不僅可作為腫瘤診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物，還可作為腫瘤免疫治療的新靶標(biāo)，對(duì)提高癌癥患者生存率具有十分重要意義[3-4]。Cao等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在脂肪肉瘤組織和細(xì)胞中miR-195表達(dá)降低，而通過(guò)上調(diào)miR-195的表達(dá)量可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和遷移，并能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。Chen和Wang[6]研究發(fā)現(xiàn)，miR-195在肝癌細(xì)胞和血清中的表達(dá)下調(diào)，且miR-195表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)，而通過(guò)使用miR-195模擬物來(lái)過(guò)表達(dá)miR-195可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲，表明miR-195可作為肝癌患者的新型診斷標(biāo)志物參與肝癌的發(fā)展。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的程序性死亡配體1(programmed cell death-Ligand 1，PD-L1)可與T細(xì)胞表面高表達(dá)的程序性死亡受體 1 (programmed cell death protein 1，PD-1)結(jié)合，持續(xù)激活PD-1/PD-L1信號(hào)通路，抑制T細(xì)胞的活化和增殖，誘導(dǎo)T細(xì)胞的功能喪失，從而使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和殺傷，而阻斷 PD-1/PD-L1 信號(hào)通路可以逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫耐受狀態(tài)，增強(qiáng)抗腫瘤免疫效應(yīng)[7]。本研究旨在構(gòu)建miR-195真核表達(dá)載體，研究其與肝癌細(xì)胞中PD-L1的關(guān)系及其對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響，并通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-195的靶基因，并對(duì)靶基因結(jié)合進(jìn)行信號(hào)通路分析。

1 材料及方法

1.1 主要材料與設(shè)備SPF級(jí)雌性Bal b/c小鼠、體重18～20 g由三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)(NO.42010200004833)，飼養(yǎng)環(huán)境：20～25 ℃，(50±5)%相對(duì)濕度，12 h晝夜循環(huán)光照，標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)。人源性肝癌細(xì)胞瘤株HepG2、鼠源性肝癌細(xì)胞瘤株H22、真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)由三峽大學(xué)腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；RNA 提取試劑盒、大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞 、質(zhì)粒提取及純化試劑盒購(gòu)于Vazyme公司；限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和XhoI、T4 DNA連接酶、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Takara公司；轉(zhuǎn)染試劑Turbofect購(gòu)于Thermo Scientific公司；PCR儀購(gòu)于美國(guó) Whatman Biometra公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)于Biosciences公司。

1.2方法

1.2.1 miR-195引物設(shè)計(jì)和基因擴(kuò)增在GenBank 獲取miR-195的基因組序列，采用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，引物上游序列為：aggtGAATTCCACAC TGTGGTGTTA GAGC,下游序列為：aggtCTCGAGCTGTTCCCTC TTCTCTCC，其中上游引物中含有EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物中含有XhoⅠ酶切位點(diǎn)。以正常宮頸脫落細(xì)胞DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到miR-195前體。PCR循環(huán)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共30個(gè)循環(huán)。用純化試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，取5 μL純化后的目的片段，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物條帶。

1.2.2miR-195真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建用EcoRI、Xhol分別連續(xù)單酶切純化后的目的片段與空載體pcDNA3.1(+)，再用純化試劑盒純化。用T4 DNA連接酶將二者連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，置于氨芐抗性平板上，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，次日挑選單克隆菌落搖菌后進(jìn)行質(zhì)粒抽提。將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-miR-195通過(guò)EcoRI單酶切進(jìn)行鑒定，以pcDNA3.1(+)為對(duì)照，并將鑒定正確的質(zhì)粒送至武漢生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3miR-195靶基因預(yù)測(cè)使用在線靶基因預(yù)測(cè)工具miRPathDB、miRWalk、GeneCards預(yù)測(cè)miR-195的靶基因，為降低結(jié)果假陽(yáng)性率，取這3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)交集作為預(yù)測(cè)靶基因的結(jié)果。通過(guò)在線工具DIANA tools繪制韋恩圖，得到交集靶基因，并將3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中都存在靶向關(guān)系的基因用于后續(xù)分析。

1.2.4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞及分組取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2或H22細(xì)胞，以5×105/mL接種于6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)60%～70%時(shí)，用轉(zhuǎn)染試劑Turbofect將pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1-miR-195分別轉(zhuǎn)染入HepG2與H22細(xì)胞系中培養(yǎng)48h。設(shè)立空白對(duì)照組、pcDNA3.1組及實(shí)驗(yàn)組(miR-195組)。

1.2.5RT-PCR檢測(cè)HepG2細(xì)胞中miR-195及PD-L1的表達(dá)將HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，在無(wú)菌操作臺(tái)中用Trizol法提取總 RNA 并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，其中，miR-195的逆轉(zhuǎn)錄引物為：gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacGCCAATATTT；PD-L1為試劑盒提供的Oligo dT Primer和Random 6 mers。采用RT-PCR檢測(cè)HepG2細(xì)胞中miR-195和PD-L1表達(dá)水平，循環(huán)條件為：95 ℃預(yù)變性20 s，95 ℃變性3s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品重復(fù)3次，采用相對(duì)定量法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞表面PD-L1蛋白表達(dá)將pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1-miR-195轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞48 h后，用PE標(biāo)記的PD-L1抗體與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)1 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)PD-L1蛋白的表達(dá)情況。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-195對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響將Balb/c H22荷瘤小鼠處死后，在超凈臺(tái)中分離小鼠脾，研磨得到脾淋巴細(xì)胞，然后加入綠色熒光染料CFDA-SE(Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester)標(biāo)記淋巴細(xì)胞。將標(biāo)記后的淋巴細(xì)胞加入到經(jīng)pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1-miR-195轉(zhuǎn)染48 h的H22細(xì)胞中共培養(yǎng)，48 h后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)淋巴細(xì)的胞增殖情況。實(shí)驗(yàn)分為4組：淋巴細(xì)胞組(L組)，淋巴細(xì)胞+H22細(xì)胞組(L+T組)，淋巴細(xì)胞+H22細(xì)胞+ pcDNA3.1組(L+T+pcDNA3.1組)和淋巴細(xì)胞+H22細(xì)胞+pcDNA3.1-miR-195組(L+T+miR-195組)。

1.2.8miR-195預(yù)測(cè)靶基因生物功能及信號(hào)通路富集分析應(yīng)用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫(kù)，將miR-195的預(yù)測(cè)靶基因進(jìn)行基因本體論數(shù)據(jù)庫(kù)(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號(hào)通路富集分析，GO功能主要包括細(xì)胞成分(cellular component) 、分子功能(molecular function)、生物過(guò)程(biological process) ，并通過(guò)R語(yǔ)言ggplot 2安裝包對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析和圖形繪制，顯著相關(guān)基因P<0.05。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P≤0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 pri-miR-195 PCR擴(kuò)增及序列分析從正常宮頸脫落細(xì)胞提取DNA，以其為模板，PCR擴(kuò)增得到大小為400 bp特異性條帶，條帶清晰明亮，與預(yù)期產(chǎn)物大小相符，且無(wú)非特異性擴(kuò)增雜帶，見(jiàn)圖1。

1:Maker; 2、3:pri-miR-195

2.2miR-195真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定用EcoRI和Xhol分別連續(xù)單酶切空載體pcDNA3.1(+)及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將目的片段特異插入空載體pcDNA3.1(+)的相應(yīng)酶切位點(diǎn)。將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-miR-195與pcDNA3.1(+)經(jīng)EcoRI單酶切后進(jìn)行鑒定，pcDNA3.1-miR-195分子量大小較空載體pcDNA3.1(+)增大，說(shuō)明真核表達(dá)載體pcDNA3.1-miR-195構(gòu)建成功，見(jiàn)圖2。

1:Maker; 2、3:pcDNA3.1; 4、5：miR-195

2.3miR-195與PD-L1的靶向關(guān)系驗(yàn)證生物信息學(xué)預(yù)測(cè)PD-L1為miR-195的靶基因，miR-195與PD-L1部分堿基存在互補(bǔ)配對(duì)現(xiàn)象，結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖3。RT-PCR結(jié)果顯示，pcDNA3.1-miR-195轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞中miR-195表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和pcDNA3.1組，而PD-L1的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組和pcDNA3.1(+)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

圖3 miR-195與PD-L1結(jié)合位點(diǎn)

表1 pcDNA3.1-miR-195轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后miR-195及PD-L1 mRNA表達(dá)水平

此外，流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示對(duì)照組(44.37±2.35)和pcDNA3.1組(43.86±1.20)中PD-L1表達(dá)量明顯升高，而miR-195組中PD-L1表達(dá)量(20.33±1.03)顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

a:對(duì)照組; b:pcDNA3.1組; c:miR-195組

2.4miR-195對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響與L組(1.455±0.050)淋巴細(xì)胞增殖比較，L+T組(1.280±0.141)和L+T+pc-DNA3.1組(1.240±0.424))降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；L+T+miR-195(1.640+0.099)組與L+T組相比，淋巴細(xì)胞增殖增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；L+T+pc-DNA3.1組與L+T組相比，淋巴細(xì)胞增殖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖5。

a:L組; b:L+T 組; c:L+T+pcDNA3.1組; d: L+T+miR-195 組

2.5miR-195的靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果使用miRPathDB、miRWalk、GeneCards 3個(gè)在線數(shù)軟件預(yù)測(cè)miR-195的靶基因分別為8212、651、7297個(gè)，三者取交集得到342個(gè)交集靶基因，見(jiàn)圖6。

圖6 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-195靶基因

2.6miR-195預(yù)測(cè)靶基因GO功能及KEGG信號(hào)通路分析GO功能富集分析提示miR-195靶基因主要位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)溶膠等細(xì)胞組件中，參與蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性等分子功能，涉及以DNA為模板的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄的正/負(fù)調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化等生物過(guò)程。KEGG信號(hào)通路分析提示miR-195主要富集在PI3K-Akt、MAPK、Hippo和Wnt等信號(hào)通路。見(jiàn)圖7，表2-表5。

a:miR-195 靶基因細(xì)胞成分; b:miR-195 靶基因分子功能n; c:miR-195 靶基因生物過(guò)程；d:miR-195靶基因KEGG信號(hào)通路

表2 miR-195預(yù)測(cè)靶基因的細(xì)胞成分

表3 miR-195預(yù)測(cè)靶基因的分子功能

表5 miR-195預(yù)測(cè)靶基因的KEGG信號(hào)通路分析

3 討 論

miRNA作為抑癌或致癌基因在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。深入研究miR-195與腫瘤的相關(guān)性有望為臨床腫瘤診斷與治療提供新思路。研究發(fā)現(xiàn)，miR-195可作為乳腺癌早期檢測(cè)的一種新的非侵入性生物標(biāo)志物，miR-195的低表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期之間存在顯著相關(guān)性[9]。在直腸癌中，miR-195通過(guò)靶向調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[10]。Sun等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-195通過(guò)靶向Hippo-YAP信號(hào)通路抑制結(jié)直腸癌的增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，同時(shí)miR-195的低表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者的總體存活率差顯著相關(guān)。Zhao等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-195在胃癌組織和血清中低表達(dá)，但YAP高表達(dá)。雙重?zé)晒饷笀?bào)告基因顯示，miR-195和YAP之間存在靶向關(guān)系，過(guò)表達(dá)miR-195可通過(guò)抑制YAP介導(dǎo)的Wnt /β-catenin通路，抑制細(xì)胞增殖和侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在小細(xì)胞肺癌中，miRNA-195通過(guò)抑制Rap2C蛋白依賴(lài)性MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖[13]。上述研究表明，miR-195功能廣泛，可能在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)方面具有重要調(diào)節(jié)作用。

研究證實(shí)，PD-1/PD-L1信號(hào)通路是腫瘤免疫抑制的重要組成部分，可抑制CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的存活和增殖，并影響腫瘤浸潤(rùn)性T細(xì)胞的功能，最終抑制免疫反應(yīng)并誘導(dǎo)腫瘤的免疫耐受[14]。近年來(lái)，PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑在腫瘤的臨床治療中顯示出較好的安全性和療效。He等[15]等研究發(fā)現(xiàn)，彌漫性大B細(xì)胞瘤組織中miR-195表達(dá)下調(diào)，PD-L1表達(dá)上調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-195可通過(guò)靶向PD-L1促進(jìn)IFN-γ和TNF-α的分泌，從而減弱彌漫性大B細(xì)胞瘤的免疫逃逸，增強(qiáng)抗腫瘤免疫。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，miR-195可通過(guò)阻斷PD-L1免疫檢查點(diǎn)，在腫瘤微環(huán)境中激活T細(xì)胞來(lái)增強(qiáng)放療敏感性[16]。此外，臨床前研究表明，PD-1/PD-L1抑制劑通過(guò)選擇性阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路，對(duì)延長(zhǎng)晚期肝癌患者的中位無(wú)進(jìn)展生存期、提高患者生存質(zhì)量已顯示出優(yōu)勢(shì)[17-18]。然而在肝癌細(xì)胞中，miR-195與PD-L1的表達(dá)情況和作用機(jī)制文獻(xiàn)報(bào)道較少。

本研究成功構(gòu)建pcDNA3.1-miR-195真核表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)出miR-195的靶基因，并對(duì)靶基因集合進(jìn)行GO功能及KEGG信號(hào)通路分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-195主要調(diào)控以DNA為模板的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄的正/負(fù)調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化等生物過(guò)程，參與PI3K-Akt、MAPK、Hippo和Wnt等信號(hào)通路。此外，生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)出PD-L1為miR-195的靶基因。本研究將成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞后，進(jìn)一步分析miR-195與肝癌細(xì)胞中PD-L1的關(guān)系及其對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響。RT-PCR及流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，miR-195表達(dá)量的升高會(huì)不僅會(huì)降低腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá)，還能促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖。這可能是由于降低PD-L1的表達(dá)量會(huì)特異性阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路，進(jìn)而解除腫瘤免疫耐受狀態(tài)，恢復(fù)腫瘤特異性T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷，從而會(huì)促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖。此外，生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)出miR-195的相關(guān)通路，為后續(xù)研究miR-195在肝癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中潛在的分子作用機(jī)制提供依據(jù)。