馬姝蕊，秦靖雯，宋夢(mèng)清，胡丹慧，萬(wàn)國(guó)運(yùn)，姬盛路，張其清，陳紅麗

0 引 言

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)不僅有促血管生成作用，而且是表達(dá)VEGF受體(vascular endothelial growth factorreceptor, VEGFR)的癌細(xì)胞的生存和自分泌生長(zhǎng)因子，隨著VEGF在腫瘤中作用的研究進(jìn)展，引發(fā)了人們對(duì)其用于抗腫瘤治療的關(guān)注，針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子通路的抗血管生成療法用于臨床治療癌癥已經(jīng)超過(guò)十年，除了多種VEGF抑制劑外，沉默VEGF的表達(dá)是一種潛在療法。與小分子抑制劑不同的是，小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)分子作用持久、具有高度特異性的靶基因沉默能力，VEGF siRNA可以通過(guò)抑制VEGF的表達(dá)，從而抗腫瘤血管增生，比傳統(tǒng)的治療具有優(yōu)勢(shì)，這已經(jīng)成為抑制腫瘤生長(zhǎng)的有力工具[1-4]。近些年來(lái)，采用DNA、siRNA等核酸療法來(lái)下調(diào)突變基因，正在成為一種新型方法來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲，然而，游離siRNA是一種陰離子親水性雙鏈小RNA，不易被細(xì)胞吸收，siRNA的親水性和負(fù)電荷的性質(zhì)也使其不能輕易穿過(guò)帶負(fù)電荷的生物膜，在血清中的半衰期短，易被核酸酶降解，諸多因素使其在臨床應(yīng)用方面仍然存在著很大的挑戰(zhàn)。因此，需要設(shè)計(jì)一個(gè)輸送系統(tǒng)改善上述不足，目前，有許多納米材料被用于構(gòu)建siRNA治療的輸送載體，包括聚合物、脂質(zhì)金、二氧化硅和氧化鐵基納米粒子，可以有效改善游離siRNA在應(yīng)用中存在的問(wèn)題。因此，有效的VEGF siRNA聯(lián)合化療等治療方式以及與納米遞送系統(tǒng)的最佳組合為siRNA的臨床治療提供了思路，成為腫瘤治療新的發(fā)展方向[5-9]。

課題組前期制備了雙層納米粒(DL NPs)作為治療乳腺癌的藥物輸送體系，mPEG-g-CS作為DL NPs的外殼，內(nèi)層為聚乳酸聚羥基乙酸共聚物(PLGA)納米粒，內(nèi)外層可分別負(fù)載不同藥物[10-11]。本研究在前期研究基礎(chǔ)上首先探索質(zhì)粒(pDNA)與mPEG-g-CS復(fù)合成mPEG-g-CS-pDNA聚合物，考察基因負(fù)載能力，進(jìn)一步驗(yàn)證載VEGF siRNA和鹽酸表阿霉素(EPI)的DL-siRNA NPs的體內(nèi)外抑瘤效應(yīng)?；熀涂寡苌苫蛑委熉?lián)合作用在乳腺癌等腫瘤治療上的協(xié)同作用機(jī)制有待做進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器PLGA(分子量30 000 000，乳酸:羥基乙酸比為50:50)購(gòu)于山東省醫(yī)療器械研究所，EPI購(gòu)于浙江海正藥業(yè)股份有限公司，mPEG-g-CS(采用甲醛連接法合成，聚乙二醇接枝率為12.54%)課題組合成[11]，VEGF siRNA(正義鏈5′GGAGUACCCUGAUGAGAUCUU3′，反義鏈5′GAUCUCAUCAGGGUACUCCUU3′)由上海生工生物工程有限公司合成。熒光分光光度計(jì)(Spectramaxplus 384，美國(guó)分子儀器公司)、納米粒度分析儀(nanoZS，英國(guó)馬爾文儀器有限公司)。

1.2納米粒的制備與表征

1.2.1 mPEG-g-CS/pDNA聚合物的制備超純水溶解mPEG-g-CS，使其終濃度為0.1 mg/mL，超純水稀釋pDNA儲(chǔ)存液，向一定體積的pDNA溶液中加入適量體積的mPEG-g-CS溶液，渦旋振蕩30 s后靜置獲得不同N/P比(mPEG-g-CS聚合物與pDNA 的相對(duì)比例)的mPEG-g-CS-pDNA NPs。

1.2.2納米粒包載siRNA復(fù)合物的制備及其理化表征不同N/P比的納米粒-siRNA復(fù)合物(mPEG-g-CS-siRNA NPs，DL-siRNA NPs)的制備：將納米粒溶液加入到20 μmol/L的 siRNA溶液中，渦旋振蕩30 s，靜置20～30 min，即可獲得。

1.2.3納米粒粒徑分析及表面Zeta電位測(cè)定將上述納米粒用超純水稀釋成適當(dāng)濃度的溶液，動(dòng)態(tài)光散射(DLS)法測(cè)定納米粒的平均粒徑和Zeta電位。

1.3瓊脂糖凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)為了評(píng)估m(xù)PEG-g-CS對(duì)于siRNA縮合凝聚的效果，先將mPEG-g-CS與pDNA按N/P分別為0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、2.0的比例混合，形成復(fù)合物，后依次上樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，于凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳條帶。

1.4納米粒體外細(xì)胞毒及抑瘤實(shí)驗(yàn)CCK8試劑法考察納米粒體外細(xì)胞毒效應(yīng)：將2種細(xì)胞分別接種于96孔板，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基更換成含不同濃度的納米?；騊EI的新鮮培養(yǎng)基，再次置于培養(yǎng)箱分別孵育24 h和48 h。每孔加入CCK-8試劑，繼續(xù)孵育1.5 h，酶標(biāo)儀450 nm 處測(cè)定各孔的吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。體外抑瘤實(shí)驗(yàn)中，考察不同載藥納米粒對(duì)細(xì)胞活力影響，DL-NPs siRNA中EPI的載藥量為4.48%[10-11]，EPI組加入的游離藥物濃度分別與對(duì)應(yīng)組別納米粒包載EPI濃度相等。

1.5納米粒體內(nèi)抑瘤效應(yīng)雌性BALB/c-Nude 裸鼠，約5周齡，體重約18 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：No.1100111911057095，適應(yīng)溫度(25±2)℃，相對(duì)濕度45%～60%的標(biāo)準(zhǔn)條件。右側(cè)腋窩皮下接種MCF-7細(xì)胞懸液，待腫瘤生長(zhǎng)至約100 mm3，將裸鼠隨機(jī)數(shù)字表法分成4組，每組6只，重復(fù)3次：等滲鹽水組，游離EPI組、mPEG-g-CS-siRNA NPs組以及DL NPs-siRNA組，EPI給藥劑量為25 mg EPI/kg，mPEG-g-CS-siRNA以及DL-siRNA NPs給藥劑量為65 μg siRNA/ kg，開(kāi)始進(jìn)行治療。定期測(cè)量腫瘤長(zhǎng)寬，22 d時(shí)處死裸鼠，取出腫瘤組織、稱(chēng)重。當(dāng)雙層空白納米粒作為轉(zhuǎn)染試劑，siRNA濃度為100 nmol/L和150 nmol/L時(shí)，MCF-7細(xì)胞存活率分別為83.34%和80.21%，發(fā)現(xiàn)siRNA在100 nmol/L和150 nmol/L這兩種濃度下對(duì)于細(xì)胞活力的影響沒(méi)有顯著性差別，綜合材料用量以及效果的考慮，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為100 nmol/L為siRNA的最佳轉(zhuǎn)染濃度。

2 結(jié) 果

2.1 納米粒表面形貌表征N/P比例對(duì)于納米粒zeta電位有顯著影響，在N/P比例區(qū)間范圍為5～40內(nèi)逐漸增加時(shí)，mPEG-g-CS-siRNA與DL NPs-siRNA的Zeta 電位從負(fù)電位逐漸增加，最終變?yōu)檎娢弧４送釴/P比例和納米粒子的組成對(duì)于納米粒的尺寸大小也有一定影響，并且納米粒的尺寸大小并不隨著N/P比例的遞增呈現(xiàn)趨勢(shì)。當(dāng)N/P比例為5時(shí)，mPEG-g-CS-siRNA的粒徑最小[(-12.70±0.42)nm]，當(dāng)N/P比例為10時(shí)，mPEG-g-CS-siRNA的粒徑次大[(178.50±20.61)nm]；而對(duì)DL NPs-siRNA而言，當(dāng)N/P比例為20時(shí)其粒徑最小[(153.82±30.15)nm]，當(dāng)N/P比例為5時(shí)其粒徑次大[(160.00±30.02)nm]。

2.2瓊脂糖凝膠電泳阻滯分析瓊脂糖凝膠電泳條帶結(jié)果如圖1所示，以 N/P = 0即裸pDNA為對(duì)照，可以看出有明顯的熒光條帶，并且mPEG-g-CS 對(duì)于pDNA的縮合凝聚能力隨N/P比例增加增加；當(dāng) N/P 比例為0.1時(shí)，可以看到有少量的 pDNA遷移，此時(shí) mPEG-g-CS 不能完全縮合pDNA；當(dāng) N/P 比例為0.4及之上，pDNA完全被 mPEG-g-CS 阻滯，mPEG-g-CS完全縮合pDNA。

1:Marker 5000; 2-8：分別為N/P為0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、2.0

2.3體外細(xì)胞毒評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，以聚乙烯亞胺(PEI)為陽(yáng)性對(duì)照，MCF-7細(xì)胞、HUVEC細(xì)胞與納米粒共孵育24、48、72h后，mPEG-g-CS-pDNA NPs 都顯示出較低的毒性。但是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，mPEG-g-CS-pDNA NPs的毒性增加，見(jiàn)圖2。

a:MCF-7; b:HUVEC

與本課題組制備的材料相比，當(dāng)PEI作為基因負(fù)載材料，siRNA濃度為100 nmol/L時(shí)，MCF-7細(xì)胞存活率為78.66%，HUVEC的細(xì)胞存活率為85.69%，毒性更大；與空白載體相比，細(xì)胞毒性隨載siRNA濃度的增大而增加。見(jiàn)圖3。

a:MCF-7; b:HUVEC

2.4體外抑瘤效果在孵育24 h時(shí)，DL NPs-siRNA濃度為0.5、50和500 μg/mL時(shí)MCF-7細(xì)胞的平均存活率分別是92.4%、78.1%和51.4%，且隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，各組細(xì)胞存活率均降低。相同條件下DL NPs-siRNA組抑制MCF-7和HUVEC細(xì)胞效果顯著高于mPEG-g-CS- siRNA NPs和EPI組。見(jiàn)圖4。

a:MCF-7 24 h; b:MCF-7 48 h; c:HUVEC 24 h; d:HUVEC 48 h

2.5基因/化療藥物雙層納米粒體內(nèi)抑瘤效應(yīng)對(duì)照組的腫瘤體積不斷增長(zhǎng)；與對(duì)照組相比，EPI、mPEG-g-CS-siRNA、DL NPs-siRNA組均表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤效果。治療4 d后，游離EPI組的腫瘤體積持續(xù)攀升，而mPEG-g-CS-siRNA、DL NPs-siRNA組腫瘤體積開(kāi)始減小，并且DL NPs-siRNA聯(lián)合治療組對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)有顯著抑制作用(P<0.01)；治療22 d后，游離EPI組、mPEG-g-CS-siRNA組、DL NPs-siRNA組的腫瘤抑制率分別為22.36%、85.01%和99.90%。22 d后，解剖小鼠，取出腫瘤組織，對(duì)照組的腫瘤體積和質(zhì)量最大，DL NPs-siRNA組最小，腫瘤幾乎完全消失。見(jiàn)圖5。

與對(duì)照組比較，*P<0.05

3 討 論

VEGF是一種特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞因子，可促進(jìn)腫瘤血管生成。已知siRNA不產(chǎn)生耐藥，可以特異性抑制靶基因的表達(dá)，而不會(huì)造成顯著的毒性[12-13]，VEGF siRNA將通過(guò)抑制VEGF的表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤血管生成的作用[14-16]。VEGF siRNA和化療藥物聯(lián)合，可發(fā)揮協(xié)同治療腫瘤的功效，有望成為一種潛在的有用的治療高血管化腫瘤的方式。

親水性的聚乙二醇在血液中具有穩(wěn)定長(zhǎng)循環(huán)特點(diǎn)，可以自組裝成納米粒，并且聚乙二醇化的納米粒在全身給藥物/基因后可以靶向腫瘤，增加藥效。除此之外，靜脈注射聚乙二醇化siRNA脂質(zhì)體還可顯著降低siRNA在肺內(nèi)的積累[17-20]。殼聚糖的陽(yáng)離子性質(zhì)使其可以復(fù)合豐富的陰離子核酸，保護(hù)血清中核酸酶的降解，實(shí)現(xiàn)高效的基因治療。此外，殼聚糖包裹基因后，形成尺寸很小的納米粒，容易穿透細(xì)胞膜，是一種有效的基因載體[21-26]。

因此，本研究利用課題組前期制備的雙層納米粒(DL NPs)作為乳腺癌聯(lián)合化療用的藥物輸送體系，外層為mPEG-g-CS，包載VEGF siRNA，內(nèi)層為PLGA，包載EPI。結(jié)果表明，N/P比例和納米粒子的組成對(duì)于納米粒的尺寸大小和Zeta電位有明顯的影響，考慮到納米粒的尺寸大小和Zeta電位的影響，進(jìn)行凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)。pDNA和siRNA都屬于核酸類(lèi)分子，且分子量大，條帶區(qū)分明顯，除此之外，RNA易在空氣中被降解。因此，我們制備 mPEG-g-CS/pDNA 聚合物，代替mPEG-g-CS負(fù)載siRNA，進(jìn)行凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)。證明N/P比例還對(duì)納米粒對(duì)于pDNA的縮合凝聚能力有顯著的影響，當(dāng)N/P 為0.4時(shí)，mPEG-g-CS與pDNA充分結(jié)合。在所有陽(yáng)離子聚合物中，聚乙烯亞胺(PEI)因其具有較強(qiáng)的基因絡(luò)合性和較高的轉(zhuǎn)染效率而成為研究最多的基因傳遞陽(yáng)離子聚合物。但其毒性問(wèn)題嚴(yán)重，在臨床試驗(yàn)中的應(yīng)用受到限制。因此，我們以其為陽(yáng)性對(duì)照，探究納米粒的體外細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)雙層空白納米粒與PEI相比，毒性更小。凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)均表明，mPEG-g-CS可以作為基因載體。載基因和化療藥物的雙層納米粒體內(nèi)外抑瘤效應(yīng)的結(jié)果顯示，載基因和化療藥物納米粒對(duì)MCF-7細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞的抑制作用均具有濃度和時(shí)間依賴(lài)性；化療藥物和抗血管增生基因治療聯(lián)合治療時(shí)，腫瘤體積明顯更小，初步表明負(fù)載VEGF siRNA和EPI的藥物輸送體系體系在體內(nèi)外發(fā)揮了較好的抗腫瘤的作用。

綜上所述，本研究作為輸送載體的DL NPs，制備簡(jiǎn)單，毒性小，mPEG-g-CS在N/P 為0.4時(shí)，可以完全縮合pDNA，是一種有效的基因載體。本研究選用抗VEGF siRNA與化療藥物聯(lián)合治療，有效的抑制了乳腺癌的生長(zhǎng)。因此，DL NPs有望成為一種有前景的藥物輸送體系。