楊福明 馬 鶯

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，哈爾濱 150090) (九三糧油工業(yè)集團(tuán)有限公司2，哈爾濱 150060)

高效液相色譜法同時(shí)檢測植物甾醇與植物甾醇酯

楊福明1，2馬 鶯1

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，哈爾濱 150090) (九三糧油工業(yè)集團(tuán)有限公司2，哈爾濱 150060)

采用反相高效液相色譜，對同時(shí)檢測植物甾醇和甾醇酯的分析方法進(jìn)行了研究。通過檢測條件優(yōu)化，植物甾醇和甾醇酯的12種不同組分在以丙酮和乙腈(3∶1)為流動(dòng)相，柱溫30 ℃，流動(dòng)相流速1.0 mL/min，等度洗脫的條件下，達(dá)到最好分離效果。此方法不需要樣品的前處理，分析時(shí)間25 min，檢出限為5.1～1.1 μg/mL，定量限為17.0～137.0 μg/mL，回收率93.81%～111.98%。植物甾醇與甾醇乙酸酯在0.01～1.0 mg/mL的濃度范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，甾醇亞油酸酯與甾醇油酸酯在0.1～1.0 mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均超過0.998。該方法可應(yīng)用于多種甾醇和甾醇酯產(chǎn)品的同時(shí)檢測。

植物甾醇 植物甾醇酯 高效液相色譜法 同時(shí)檢測

植物甾醇是一種天然活性物質(zhì)，主要由菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇幾種主要成分組成，具有降低膽固醇[1-2]、抗癌[3]、預(yù)防心腦血管疾病[4]等十分重要的生理功能，在食品、保健品、化妝品、藥品等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。植物甾醇本身的理化性質(zhì)決定了其不溶于水，在油中的溶解度小，降低了實(shí)際的使用價(jià)值。為擴(kuò)大甾醇的應(yīng)用范圍，當(dāng)前普遍采用的方法是將植物甾醇進(jìn)行酯化，得到甾醇乙酸酯、甾醇亞油酸酯、甾醇油酸酯等甾醇酯產(chǎn)品[5-8]。植物甾醇酯有更優(yōu)的脂親和性，在油中的溶解度可以大大提高，擴(kuò)大了甾醇的應(yīng)用范圍。

測定植物甾醇的方法很多，有紫外分光光度法、液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法[9-12]。檢測植物甾醇酯的研究并不多見，目前僅有關(guān)于液相色譜檢測甾醇煙酸酯[13]、氣相色譜檢測甾醇亞麻酸酯[14]的報(bào)道。液相法檢測甾醇煙酸酯采用的是以純甲醇為流動(dòng)相，此流動(dòng)相如果用來檢測甾醇乙酸酯需要35～40 min，且無法檢測出甾醇亞油酸酯和甾醇油酸酯。氣相色譜法檢測甾醇亞麻酸酯采用的是先將甾醇酯皂化預(yù)處理，變成游離甾醇，通過內(nèi)標(biāo)法檢測甾醇的含量然后折算成甾醇酯的含量，氣相色譜法前處理過程較復(fù)雜，檢測溫度高。普通液相色譜法同時(shí)檢測多種甾醇和甾醇酯的研究鮮見報(bào)道，因此，采用液相色譜的方法在較短時(shí)間內(nèi)同時(shí)分析多種植物甾醇和甾醇酯的含量，對促進(jìn)甾醇酯產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)分析方法的應(yīng)用很有意義。

本研究以大豆甾醇、大豆甾醇乙酸酯、大豆甾醇亞油酸酯、大豆甾醇油酸酯含量的檢測為研究對象，采用反相液相色譜法，通過優(yōu)化不同的流動(dòng)相、流速、等度洗脫、梯度洗脫、色譜柱、柱溫等條件，建立在較短時(shí)間內(nèi)同時(shí)分析12種植物甾醇和甾醇酯組分的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆甾醇(≥95%)、大豆甾醇乙酸酯(≥95%)、大豆甾醇亞油酸酯(≥60%)、大豆甾醇油酸酯(≥85%)：九三糧油工業(yè)集團(tuán)有限公司；菜油甾醇標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%)、豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%)、β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%)：成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；油酰氯(≥99%)、亞油酸(≥99%)：Sigma公司；乙酸酐、NaCl、NaHCO3、正己烷：天津科密歐試劑公司；色譜純丙酮、色譜純乙腈：霍尼韋爾公司色譜純試劑。Waters 2695液相色譜儀、UV2489檢測器：美國沃特世公司。

1.2 植物甾醇酯標(biāo)準(zhǔn)品的制備

甾醇乙酸酯、甾醇亞油酸酯、甾醇油酸酯均為實(shí)驗(yàn)室合成。為提高合成效率，甾醇油酸酯與亞油酸酯的合成采用酰氯法。但由于沒有商業(yè)化的亞油酰氯，因此在參考前人方法的基礎(chǔ)上[13]，以高純度的亞油酸(≥99%)為原料，實(shí)驗(yàn)室合成了高純度亞油酰氯，用于甾醇亞油酸酯標(biāo)準(zhǔn)品的合成。具體合成步驟為：取3個(gè)50 mL磨口三角瓶，分別加入菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品各100 mg，然后加入摩爾比1∶1.1的乙酸酐(油酰氯或亞油酰氯)，連接與磨口三角瓶相配套的冷凝管，135 ℃(油酰氯與亞油酰氯反應(yīng)溫度為85 ℃)加熱條件下，冷凝回流反應(yīng)1 h。冷卻后往三角瓶中加入過量的飽和NaHCO3溶液，漩渦振蕩，充分混合，除掉未反應(yīng)的酸性物質(zhì)。加入5 mL正己烷，磨口三角瓶加塞顛倒混勻數(shù)次，萃取合成的甾醇酯產(chǎn)物。加入飽和的NaCl溶液使液面升至瓶口處，吸取上層有機(jī)相，氮?dú)獯蹈?。最后取少量產(chǎn)物液相色譜上機(jī)檢測，采用面積歸一化法和標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證法對合成的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量分析，產(chǎn)物中幾乎無未反應(yīng)的甾醇時(shí)(甾醇酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)，則認(rèn)為得到了合格的甾醇酯標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3 植物甾醇與甾醇酯標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱量菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品各50 mg溶于50 mL丙酮中，制成這幾種物質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確量取0.1、0.5、2.5、5、10 mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用丙酮定容至10 mL，制成菜油甾醇(0.01～1.0 mg/mL)、豆甾醇(0.01～1.0 mg/mL)、β-谷甾醇(0.01～1.0 mg/mL)5個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液在液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣器上吸取10 μL進(jìn)行含量檢測，制成5點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線。甾醇乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備與植物甾醇相同，甾醇亞油酸酯、甾醇油酸酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度稍有不同，各組分質(zhì)量濃度范圍為0.1～1.0 mg/mL。

1.4 樣品的制備與色譜條件

稱取適量的大豆甾醇、甾醇乙酸酯、甾醇亞油酸酯、甾醇油酸酯樣品用合適體積的丙酮定容，取其中的1.5 mL用0.45 μm濾墊過濾后置于1.5 mL進(jìn)樣瓶中備用。

色譜柱采用C18反相色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，流動(dòng)相流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃，紫外檢測器波長210 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的確定

采用傳統(tǒng)的甲醇、乙腈為流動(dòng)相，對甾醇和甾醇酯產(chǎn)品進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)這2種流動(dòng)相可以檢測出甾醇和甾醇乙酸酯的各種組分，甾醇乙酸酯的檢測時(shí)間過長，達(dá)到了40 min。但以甲醇、乙腈為流動(dòng)相時(shí)，未能檢測出甾醇亞油酸酯和甾醇油酸酯。經(jīng)過其他流動(dòng)相的試驗(yàn)和探索，在參考安廣杰等[15]測定甘三酯組成研究的基礎(chǔ)上略作改進(jìn)，得到了最好的分離效果。安廣杰等[15]采用的流動(dòng)相為乙腈+丙酮(36.4∶63.6)，本研究通過梯度洗脫來優(yōu)化乙腈與丙酮最佳比例，流動(dòng)相確定為乙腈+丙酮(1∶3)。這樣的流動(dòng)相比例可能與甾醇、甾醇酯的極性特點(diǎn)有關(guān)，根據(jù)相似相溶原理，甲醇、乙腈的極性太強(qiáng)，不適合甾醇油酸酯和甾醇亞油酸酯的分析。

2.2 色譜柱柱溫的選擇

流動(dòng)相確定后，為使植物甾醇和植物甾醇酯各組分達(dá)到最佳的分離度，對25～45 ℃柱溫時(shí)的檢測結(jié)果進(jìn)行了考查。25 ℃時(shí)色譜峰的峰寬較大，但檢測時(shí)間長，45 ℃時(shí)色譜峰的峰寬較小，峰值高，但不同組分的分離效果不好。30 ℃時(shí)色譜峰的峰形最好，且檢測時(shí)間適中，因此選擇色譜柱溫度為30 ℃。此時(shí)大豆甾醇、甾醇乙酸酯、甾醇亞油酸酯、甾醇油酸酯標(biāo)準(zhǔn)品的檢測結(jié)果如圖1所示。從色譜圖可以看出，在此檢測條件下色譜的基線平穩(wěn)，25 min的分析時(shí)間內(nèi)植物甾醇和甾醇酯的12種不同組分得到了較好的分離。這種現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是由于，在其他條件都不變的情況下，柱溫不同峰高和峰寬會(huì)隨之改變。柱溫高有利于傳質(zhì)，柱箱溫度越高，峰高越高，峰寬越窄，但是峰與峰之間的間距會(huì)越小。柱溫過高時(shí)，分配系數(shù)變小，不利于分離。反之柱溫越低，峰高越低，峰寬越寬，峰之間的間距越大，有利于組分的分離。但溫度過低，被測組分傳質(zhì)阻力增加，使色譜峰擴(kuò)張，甚至拖尾，所以不一定溫度越低分離越好。試驗(yàn)通過選擇最佳柱溫，使被檢測組分既完全分離，又不使峰形擴(kuò)展、拖尾，達(dá)到最合適的效果。

注：色譜峰1～12分別為菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇乙酸酯、豆甾醇乙酸酯、β-谷甾醇乙酸酯、菜油甾醇亞油酸酯、豆甾醇亞油酸酯、β-谷甾醇亞酸酯、菜油甾醇油酸酯、豆甾醇油酸酯、β-谷甾醇油酸酯。圖1 30 ℃條件下甾醇與甾醇酯標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖

2.3 甾醇酯標(biāo)準(zhǔn)品的確認(rèn)

甾醇酯標(biāo)準(zhǔn)品合成反應(yīng)中采取了酸過量的方式，反應(yīng)完成后對合成產(chǎn)物使用過量的飽和NaHCO3溶液進(jìn)行處理，去除未反應(yīng)的酸性物質(zhì)。

標(biāo)準(zhǔn)品合成后采用2種方式對其真實(shí)含量進(jìn)行確認(rèn)。面積歸一化法：由于在試驗(yàn)得到的最佳檢測條件下，甾醇與甾醇酯各組分全部流出色譜柱，可以實(shí)現(xiàn)很好的分離，且基線平穩(wěn)，在色譜圖上都顯示色譜峰，因此可以采用面積歸一化法從10、20、40 μL 3個(gè)不同的進(jìn)樣量對合成的甾醇酯標(biāo)準(zhǔn)品純度進(jìn)行確認(rèn)。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)驗(yàn)證法：合成反應(yīng)后剩余甾醇的量很少，用甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線對未反應(yīng)的甾醇定量，每個(gè)樣品重復(fù)檢測3次，然后根據(jù)未反應(yīng)甾醇的量計(jì)算出甾醇酯含量。2種確認(rèn)方式得到的甾醇酯標(biāo)準(zhǔn)品含量如表1所示，得到結(jié)果的一致性較好，終含量取兩者平均值。

表1 甾醇酯標(biāo)準(zhǔn)品含量的確認(rèn)結(jié)果

2.4 檢出限、定量限與精確度

檢出限是指在適當(dāng)?shù)闹眯鸥怕时粰z出的組分最低濃度或最小量，一般表示為分析物質(zhì)的濃度。本試驗(yàn)中檢出限和定量限通過以下方法獲得：對接近標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的甾醇和甾醇酯的標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)檢測10次，計(jì)算得出平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。標(biāo)準(zhǔn)偏差值的3倍即為檢出限，標(biāo)準(zhǔn)偏差值的10倍為定量限。12種不同組分的檢測和計(jì)算結(jié)果如表2所示，從表2可以看出不同的甾醇與甾醇酯組分的檢出限為5.1～41.1 μg/mL，定量限為17.0～137.0 μg/mL。從各種組分檢測含量的平均值也可以看出實(shí)測值與實(shí)際含量相差不大，方法的準(zhǔn)確度好，達(dá)到了GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》中檢測方法確認(rèn)的技術(shù)要求。另外，從表2中可以看出SD值普遍較小，RSD值為4.37%～8.98%，方法的精確度較高。

2.5 線性范圍與回收率

大豆甾醇、甾醇乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)品在質(zhì)量濃度0.01～1.0 mg/mL范圍內(nèi)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，甾醇亞油酸酯、甾醇油酸酯標(biāo)準(zhǔn)品在質(zhì)量濃度0.1～1.0 mg/mL范圍內(nèi)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，每種組分標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)都超過了0.998，線性關(guān)系較好，濃度范圍和相關(guān)系數(shù)符合GB/T 27404—2008。

對各組分的具體含量進(jìn)行了加標(biāo)回收試驗(yàn)，取4份已知濃度的樣品溶液，其中3份加入分別加入高、中、低不同量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，4份按相同的分析步驟分析，每份樣品重復(fù)檢測3次。加標(biāo)的1份所得的結(jié)果減去未加標(biāo)1份所得的結(jié)果，其差值同加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的理論值之比即為樣品加標(biāo)回收率。具體的試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，從試驗(yàn)結(jié)果可知甾醇與甾醇酯各組分的加標(biāo)回收率為93.81%～111.98%，除個(gè)別數(shù)據(jù)(93.81%、111.98%)外，回收率達(dá)到GB/T 27404—2008中的要求(95%～105%)。

表2 甾醇、甾醇酯各組分的檢出限、定量限和精確度

表3 甾醇、甾醇酯各組分的線性范圍和加標(biāo)回收率

2.6 實(shí)際樣品的定量分析

用標(biāo)準(zhǔn)曲線對市售大豆甾醇(≥95%)、甾醇油酸酯(≥85%)、甾醇乙酸酯(≥95%)、甾醇亞油酸酯(≥60%)幾種產(chǎn)品進(jìn)行定量分析，每個(gè)樣品重復(fù)檢測3次，樣品檢測的色譜圖分別如圖2～圖5所示，各個(gè)產(chǎn)品總含量與每種組分的含量的檢測結(jié)果如表4所示。幾種不同規(guī)格的產(chǎn)品大豆甾醇、甾醇油酸酯、甾醇乙酸酯、甾醇亞油酸酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為96.41%、91.53%、95.73%、69.40%，通過實(shí)際含量的檢測可以看出所測產(chǎn)品的總含量均合格，各種不同的組分也能得到準(zhǔn)確的定量。大豆甾醇中含有水分以及微量不溶性雜質(zhì)，甾醇油酸酯含有未酯化甾醇和少量的其他類型脂肪酸酯，甾醇乙酸酯含有少量的未酯化甾醇，甾醇亞油酸酯是含有較大量的甾醇油酸酯，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這些產(chǎn)品中的非目標(biāo)分析物未對分離產(chǎn)生影響。樣品中不含有蛋白、鹽類等其他雜質(zhì)，含有的少量不溶性雜質(zhì)被濾膜過濾，直接進(jìn)樣對色譜柱的影響不大，因此可以采用直接進(jìn)樣的方式。

圖2 大豆甾醇產(chǎn)品的檢測色譜圖

圖3 甾醇油酸酯產(chǎn)品的檢測色譜圖

圖4 甾醇乙酸酯產(chǎn)品的檢測色譜圖

圖5 甾醇亞油酸酯產(chǎn)品的檢測色譜圖

表4 植物甾醇、甾醇酯產(chǎn)品實(shí)際含量的檢測結(jié)果

產(chǎn)品總量/%菜油甾醇或酯/%豆甾醇或酯/%β-谷甾醇或酯/%大豆甾醇96.41±0.5824.39±0.1526.42±0.1645.02±0.27甾醇乙酸酯95.73±0.7924.22±0.2026.23±0.2244.71±0.37甾醇亞油酸酯69.40±1.7117.56±0.4319.02±0.4732.41±0.80甾醇油酸酯91.53±0.6223.16±0.1625.08±0.1742.74±0.29

3 結(jié)論

采用普通的液相色譜方法可以在25 min的分析時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)12種不同的甾醇和甾醇酯組分的分離，達(dá)到對植物甾醇和植物甾醇酯各組分同時(shí)檢測的目的。研究發(fā)現(xiàn)，液相色譜法不需要樣品的前處理、檢測時(shí)間短、定量準(zhǔn)確。盡管試驗(yàn)過程中，當(dāng)樣品濃度過高時(shí)部分組分的分離度會(huì)降低，色譜峰沒有完全分離，且由于試驗(yàn)條件所限，本研究未對甾醇亞麻酸酯、甾醇月桂酸酯、甾醇煙酸酯等其他更多形式產(chǎn)品的同時(shí)檢測進(jìn)行研究。但是從理論上分析，此方法可以應(yīng)用在其他類型產(chǎn)品的含量檢測上。建議在檢測工作中可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行適當(dāng)?shù)臈l件優(yōu)化。

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Simultaneous Detection of Phytosterols and Phytosterol Esters with HPLC

Yang Fuming1，2Ma Ying1

(College of food science and engineering，Harbin Institute of Technology1，Haerbin 150090) (Jiusan Grains & Oils Industry Group Co.，Ltd2.，Haerbin 150060)

Simultaneous detection method of phytosterols and phytosterol esters was studied by reversed-phase HPLC.Acetone and acetonitrile(3∶1)was used as mobile phase，12 compounds of phytosterols and phytosterol esters could be separated completely under the conditions of flow rate 1.0 mL/min，column temperature 30 ℃ and isocratic elution.Analysis time was only 25 minutes in this method，and there was no sample pretreatment.Limit of detection ranged from 5.1 to 41.1 μg/mL，and limit of quantitative ranged from 17.0 to 137.0 μg/mL，and recovery rates ranged from 93.81% to 111.98%.Sterol linoleate and sterol oleate in the concentration range of 0.01～1.0 mg/mL showed a linear correlation.Linearity range of sterol linoleate and sterol oleate was 0.1～1.0 mg/mL.All the regression coefficients of standard curves were over 0.998.This method could be used in simultaneous detection of different sterol and sterol ester products，and worthy of promotion.

phytosterol，phytosterol esters，HPLC，simultaneous detection

2015-11-13

楊福明，男，1981年出生，博士，食品科學(xué)與工程

馬鶯，女，1961年出生，教授，食品科學(xué)與工程

O656.3

A

1003-0174(2017)06-0134-06