孟金柱，吳震洋，安清明，趙園園

(銅仁學(xué)院，貴州 銅仁 554300)

雌性動(dòng)物卵泡顆粒細(xì)胞(GCs)通過特異表達(dá)細(xì)胞色素P450芳構(gòu)化酶(CYP19A1)，將膜細(xì)胞(TCs)分泌的雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素(E2)，從而促進(jìn)優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育成為排卵卵泡[1]。排卵卵泡在促黃體素(LH)峰的作用下發(fā)生破裂，卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體得以釋放，而卵泡壁上的GCs和TCs分別分化成為大黃體細(xì)胞(LLCs，直徑大于25 μm)和小黃體細(xì)胞(SLCs，直徑12～25 μm)[2]。在牛和羊卵巢上，LLCs和SLCs都可以分泌孕激素(P4)，但LLCs由于對(duì)LH有一定的類固醇生成反應(yīng)，因此其分泌P4的能力是SLCs的20倍[3-4]。

通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)牛不同大小卵泡中GCs和TCs進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)GLDC、MGARP、GPX3、CHST8等細(xì)胞外基質(zhì)基因是GCs的潛在標(biāo)記物[5]。對(duì)不同品種的牛在不同溫度應(yīng)激下的卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞進(jìn)行高通量測(cè)序表明，不同牛品種的卵母細(xì)胞在組織和細(xì)胞死亡方面存在很大差異；在卵丘細(xì)胞中，品種和溫度都會(huì)影響mRNA的豐度，涉及細(xì)胞組織和氧化應(yīng)激[6]。目前，有文獻(xiàn)報(bào)道了牛GCs和TCs在黃體生成素(LH)峰和卵泡內(nèi)前列腺素峰出現(xiàn)時(shí)的短期變化[7]，但從卵泡到黃體的轉(zhuǎn)變機(jī)制尚不明晰。本研究通過篩選GEO數(shù)據(jù)庫(kù)GSE83524 RNA-seq表達(dá)譜中LLCs和GCs之間的差異表達(dá)基因，應(yīng)用生物信息學(xué)分析結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，為詳述這2種細(xì)胞在卵巢生理學(xué)中的功能、深入研究細(xì)胞特異性及GCs細(xì)胞向LLCs的分化機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料在貴州省銅仁市萬(wàn)山區(qū)肉牛屠宰場(chǎng)選取10頭健康思南黃牛，屠宰后摘除卵巢，迅速置于4℃滅菌杜氏磷酸緩沖液(DPBS)中并運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。采集每頭牛卵巢上的最大卵泡(直徑8～10 mm)，參照課題組前期研究方法篩選優(yōu)勢(shì)卵泡[8]，用眼科剪刀將優(yōu)勢(shì)卵泡剪開，通過細(xì)胞刮刀刮取卵泡內(nèi)壁上的顆粒細(xì)胞(GCs)；使用淘洗法[9]從卵巢黃體中分離出黃體細(xì)胞，并通過500目細(xì)胞篩篩選其中的大黃體細(xì)胞(LLCs，直徑>30 μm)；-80℃ 冰箱中保存用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)。

1.2 芯片數(shù)據(jù)在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)篩選牛卵泡發(fā)育相關(guān)表達(dá)譜數(shù)據(jù)，并下載GSE83524 RNA-seq芯片數(shù)據(jù)，其中包含4頭牛優(yōu)勢(shì)卵泡GCs樣本和3頭牛卵巢黃體 LLCs樣本。

1.3 差異表達(dá)基因篩選及數(shù)據(jù)分析使用R軟件limma包中的DESeq2來篩選牛優(yōu)勢(shì)卵泡GCs和卵巢黃體LLCs中的差異表達(dá)基因，其閾值設(shè)定為FPKM≥2，| log2(fold change) |≥2，校正后的P<0.01；通過DAVID軟件對(duì)獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG信號(hào)通路分析；使用String軟件構(gòu)建差異表達(dá)基因之間的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)；將互作數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行可視化分析，同時(shí)利用軟件自帶Cyto-Hubba插件的MCC算法篩選連通度最大的前10位的關(guān)鍵(Hub)基因。

1.4 總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及引物合成將存放于-80℃冰箱中的GCs和LLCs樣品取出并解凍，分別加入1 mL TRIzol抽提總RNA。用NanoDrop 2000檢測(cè)其濃度和純度后，按照EasyScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，合成體系20 μL：總RNA 4 μL；Anchored Oligo(dT) Primer 1 μL；2×ES Reaction Mix 10 μL；EasyScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL；RNase free ddH2O 4 μL。反應(yīng)條件設(shè)定：42℃ 15 min，85℃ 5 s。以GenBank中牛(Bostaurus)屬各目的基因和RPLP0(內(nèi)參基因)序列作為模板，在線NCBI軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，送交上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 供試引物序列

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增采用SYBR Green Ⅰ法建立20.0 μL PCR反應(yīng)體系：cDNA模板 4.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，SYBR Mix 10.0 μL，加ddH2O至20.0 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性30 s；94℃變性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線條件：94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s。反應(yīng)設(shè)置3個(gè)樣本重復(fù)，4個(gè)技術(shù)重復(fù)，通過LightCycler 480平臺(tái)運(yùn)行。各目的基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt來計(jì)算，并使用SPSS17.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因的篩選通過R軟件limma包中的DESeq2分析后，在2種細(xì)胞中共獲得242個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)基因156個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因86個(gè)(圖1)。表2列出了10個(gè)差異倍數(shù)最高的基因及其功能(上、下調(diào)各5個(gè))。

表2 牛卵巢LLCs與GCs中差異倍數(shù)最高的10個(gè)基因及其功能

圖1 牛卵巢LLCs和GCs差異表達(dá)基因火山圖

2.2 差異表達(dá)基因GO功能富集分析通過DAVID軟件對(duì)242個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析顯示，生物學(xué)過程(biological process)占46.97%，主要包括了血管生成、細(xì)胞黏附及細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)；細(xì)胞組分(cellular component)占31.82%，主要富集在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及細(xì)胞外外泌體；分子功能(molecular function)占21.21%，主要參與了以下功能，即ATP結(jié)合、蛋白激酶活性和受體結(jié)合(圖2)。

圖2 牛卵巢LLCs與GCs差異表達(dá)基因GO分析

2.3 差異表達(dá)基因KEGG信號(hào)通路分析為了獲得與卵泡GCs增殖和黃體化相關(guān)的信號(hào)通路，通過DAVID軟件對(duì)所獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析，共發(fā)現(xiàn)16條通路(圖3)，在這些通路中，F(xiàn)oxO信號(hào)通路與GCs的增殖、卵泡的發(fā)育、閉鎖和黃體化密切相關(guān)，共有7個(gè)基因在此通路中扮演了重要角色(圖4)。

圖3 牛卵巢LLCs與GCs差異表達(dá)基因KEGG通路分析

圖4 FOXO信號(hào)通路

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)互作分析通過String軟件對(duì)242個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)互作分析(圖5)，同時(shí)使用Cytoscape軟件對(duì)得到的互作數(shù)據(jù)進(jìn)行互作可視化分析，并通過其自帶Cyto-Hubba插件的MCC算法篩選連通度最大的前10位的關(guān)鍵基因，分別是KIF11、KIF15、CENPE、ASPM、NCA-PG、MELK、TPX2、NDC80、ECT2、PBK(圖6)。

圖5 牛卵巢LLCs與GCs差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)互作分析

圖6 牛卵巢LLCs與GCs中關(guān)鍵基因的PPI網(wǎng)絡(luò)互作分析

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證分析通過功能篩選，選取與卵泡顆粒細(xì)胞黃體化相關(guān)的5個(gè)差異表達(dá)基因(PRLR、SPARCL1、INHA、GREB1、CYP-19A1)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證分析。結(jié)果顯示，PRLR、SPARCL1、INHA、GREB1、CYP19A1在LLCs和GCs中的表達(dá)趨勢(shì)與GEO芯片數(shù)據(jù)結(jié)果一致，且PRLR在LLCs中的表達(dá)量極顯著地高于GCs(P<0.01)，SPARCL1在LLCs中的表達(dá)量顯著高于GCs(P<0.05)；GREB1、CYP19A1在GCs中的表達(dá)量極顯著地高于LLCs (P<0.01)，INHA在GCs中的表達(dá)量顯著高于LLCs(P<0.05)(圖7)。

注：**和*分別表示在 P <0.01和 P <0.05水平上差異顯著

3 討論

雌性動(dòng)物的卵巢是一個(gè)快速生長(zhǎng)和周期性退化的動(dòng)態(tài)組織[10]。在卵巢周期中，細(xì)胞增殖、分化和轉(zhuǎn)化的重復(fù)模式發(fā)生在卵泡發(fā)育和黃體形成及退化的過程[11]。卵泡在排卵前，位于其內(nèi)的GCs可以分泌一系列的激活素、抑制素和胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)，通過自分泌/旁分泌作用于卵巢，從而保持卵巢功能的動(dòng)態(tài)性[12]。GCs合成的E2經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)垂體，促進(jìn)垂體釋放LH,LH又與GCs上的受體結(jié)合，最終通過縫隙連接傳遞到卵母細(xì)胞，促使卵母細(xì)胞減數(shù)分裂，排出第1極體，靜止在第2次減數(shù)分裂的中期[13]。排卵后的卵泡轉(zhuǎn)化為黃體，GCs分化為L(zhǎng)LCs，其中大量前列腺素F2α受體(PTGFR)得以表達(dá)，抑制垂體分泌LH，導(dǎo)致排卵不能發(fā)生，如果排出的卵子不能正常受精，前列腺素F2α就會(huì)與LLCs中PTGFR結(jié)合觸發(fā)黃體溶解、退化，卵泡的發(fā)育得以繼續(xù)[14]；相反，當(dāng)卵母細(xì)胞的受精和著床成功時(shí)，母體對(duì)妊娠的認(rèn)知導(dǎo)致黃體的維持，而黃體反過來又起著支持胚胎發(fā)育的作用[15]。

在E2作用下GCs產(chǎn)生更多的FSH受體和LH受體，導(dǎo)致芳香化酶活性增強(qiáng)，進(jìn)一步促進(jìn)E2的分泌，使卵泡迅速生長(zhǎng)，在這個(gè)過程中CYP19A1起了關(guān)鍵作用[16]。E2對(duì)哺乳動(dòng)物的卵泡發(fā)育及排卵至關(guān)重要，CYP19A1通過將來自TCs的雄激素轉(zhuǎn)化為E2，敲除CYP19A1的小鼠則不能排卵[17]。本研究通過生物信息學(xué)分析并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)CYP19A1在GCs中的表達(dá)量極顯著地高于LLCs(P<0.01)，證實(shí)CYP19A1在GCs中發(fā)揮了重要作用。在妊娠綿羊體內(nèi)通過釋放干擾素T(IFNT)與子宮內(nèi)膜中的受體結(jié)合，激活抗黃體溶解反應(yīng)，使黃體持續(xù)產(chǎn)生P4來維持妊娠[18]?；趯?duì)子宮靜脈血液中IFNT的檢測(cè)，進(jìn)一步證實(shí)IFNT通過誘導(dǎo)IFN刺激基因(ISGs)的表達(dá)對(duì)黃體起作用，例如IFN刺激基因15(ISG15)[19]。本研究通過對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)GSE83524 LLCs與GCs轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，在2種細(xì)胞中獲得242個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)基因156個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因86個(gè)。FoxO 信號(hào)通路在細(xì)胞凋亡、代謝、周期阻滯、分化、自噬及氧化應(yīng)激等方面都起著關(guān)鍵作用[20]。在豬和牛等哺乳動(dòng)物中，F(xiàn)oxO 通過負(fù)調(diào)控作用來抑制卵泡GCs的增殖[21]。本試驗(yàn)通過對(duì)獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO、KEGG信號(hào)通路及PPI網(wǎng)絡(luò)互作分析，發(fā)現(xiàn)FoxO信號(hào)通路與GCs的增殖、卵泡的發(fā)育、閉鎖和黃體化密切相關(guān)，共有7個(gè)基因在此通路中扮演了重要角色。實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，PRLR、SPARCL1、INHA、GREB1、CYP19A1在LLCs和GCs中的表達(dá)趨勢(shì)與GEO芯片數(shù)據(jù)結(jié)果完全一致。

促乳素受體(PRLR)對(duì)反芻動(dòng)物P4的分泌以及黃體的維持起著至關(guān)重要的作用[22]。由垂體分泌的PRL經(jīng)血液循環(huán)直接作用于子宮內(nèi)膜在動(dòng)物妊娠過程中產(chǎn)生作用[23]，且PRL還在動(dòng)物排卵、著床及胎盤發(fā)育的過程中起促進(jìn)作用[24],敲除小鼠卵泡中的PRL，使得卵母細(xì)胞釋放延遲，成熟受損進(jìn)而導(dǎo)致排卵減少[25]。本研究結(jié)果得出，PRLR在LLCs中的表達(dá)量極顯著地高于GCs(P<0.01)，也進(jìn)一步驗(yàn)證了PRLR在黃體細(xì)胞中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。研究表明，GREB1通過與染色質(zhì)結(jié)合進(jìn)而激活E2與其受體的結(jié)合，這種功能來源于其穩(wěn)定E2受體與其他輔助因子之間的相互作用[26]。GREB1在E2受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄過程中也起著至關(guān)重要的作用[27]。SPARCL1通過抑制細(xì)胞從G1期進(jìn)入到S期從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[28]。研究發(fā)現(xiàn)，SPARCL1具有抗黏附作用，在腫瘤細(xì)胞的增殖過程中起抑制作用，而SPARCL1作為下調(diào)表達(dá)基因在卵巢上表達(dá)，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[29]。

綜上所述,本研究通過生物信息學(xué)方法篩選出了5個(gè)與卵泡GCs增殖和黃體化相關(guān)的差異表達(dá)基因，推測(cè)這些基因在牛卵巢中對(duì)GCs黃體化起了重要作用，為深入研究細(xì)胞特異性及GCs向LLCs的分化機(jī)制奠定基礎(chǔ)。