韓 宇,張 蒙,段佳慧，張學(xué)明，李子義，唐 博*

(1.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,吉林 長春 130062；2.吉林大學(xué) 第一醫(yī)院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院 人類疾病動(dòng)物模型國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,吉林 長春 130062)

5-羥色胺(5-HT)，又稱血清素，是一種廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道的神經(jīng)遞質(zhì)，也是一種激素和生長因子，在動(dòng)物發(fā)育、生理和病理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1]。5-HT廣泛分布在雌性生殖組織如人類卵巢、大鼠子宮、輸卵管、卵巢和胎盤以及小鼠卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞[2]中，并在整個(gè)胚胎發(fā)育的早期階段起著至關(guān)重要的作用[3]。外源性添加5-HT，可抑制小鼠囊胚的形成，增加凋亡率[4]；植入后胚胎中添加5-HT會影響胎兒發(fā)育，導(dǎo)致胚胎畸形如顱面缺陷和先天性心臟畸形[5]。

在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中，父方和母方的基因組必須經(jīng)歷表觀遺傳重構(gòu)和轉(zhuǎn)錄模式的改變才能實(shí)現(xiàn)全能性[6]。表觀遺傳修飾是調(diào)節(jié)細(xì)胞命運(yùn)、分化和衰老等關(guān)鍵過程的決定性因素，主要包括DNA的共價(jià)修飾和組蛋白的翻譯后修飾[7]。組蛋白修飾是組蛋白在相關(guān)酶的激活下進(jìn)行甲基化、乙?；?、磷酸化、腺苷化等修飾過程，是一種廣泛存在于真核生物中的表觀遺傳修飾模式，在調(diào)節(jié)基因活性和染色質(zhì)狀態(tài)中發(fā)揮著重要作用[8]。不同類型的組蛋白修飾具有不同的分布和功能[9]，例如，H3K4me3可以標(biāo)記基因啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄的起始[10]， H3K27me3可作為發(fā)育基因啟動(dòng)子的抑制標(biāo)記[11]。此外，H3K27Ac是一種啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的活性標(biāo)記物[12]。因此，在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中，組蛋白修飾可以調(diào)控基因表達(dá)，影響轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

動(dòng)物在生存過程中受到刺激后會產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，在應(yīng)激狀態(tài)下，下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)失調(diào)，進(jìn)而使5-HT的分泌紊亂[13]。在母豬飼養(yǎng)過程中，存在很多應(yīng)激刺激，繼而造成母體5-HT的分泌變化，這是否會對胎兒發(fā)育產(chǎn)生影響？豬胚胎中5-HT的變化是否會影響胎兒的表觀遺傳？為了探索這些未知問題，本研究用5-HT處理豬孤雌胚胎，探究了5-HT與胚胎發(fā)育及表觀遺傳修飾三者之間的關(guān)系。本研究對5-HT在豬胚胎上的作用機(jī)制提供了新的見解，并揭示了其在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮作用的潛在途徑。

1 材料與方法

1.1 試劑RNA提取試劑盒(RNeasy Mini Kit),購自Qiagen公司(德國)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix)，購自全式金公司(中國)；細(xì)胞凋亡試劑盒(InSituCell Death Detection Kit)、熒光定量試劑盒，購自Roche公司(德國)；H3K4me2,H3K4me3一抗，購自Abcam 公司(英國)；5mC、5hmC一抗，購自Active Motif公司(美國)；熒光二抗購自武漢博士德公司；其他所使用的化學(xué)試劑除特殊指出之外，均購自Sigma公司(美國)。卵母細(xì)胞成熟及胚胎培養(yǎng)所用培養(yǎng)液配方參照文獻(xiàn)[14]配制。

1.2 卵母細(xì)胞的收集和體外成熟(IVM)豬卵巢取自長春當(dāng)?shù)赝涝讏?，置?5.0～38.5℃的無菌生理鹽水中并在4 h內(nèi)將其運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。用10 mL注射器抽取3～6 mm直徑的卵泡，在體式顯微鏡下挑選包裹著均勻顆粒細(xì)胞的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物(COCs)。在添加3%牛血清白蛋白(BSA)的TCM-199中洗滌3遍后，將COCs轉(zhuǎn)移至體外成熟培養(yǎng)液中，在38.5℃、5% CO2及100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42～44 h。

1.3 孤雌激活(PA)卵母細(xì)胞體外成熟后，利用透明質(zhì)酸酶去除卵丘細(xì)胞，并挑選出卵周隙明顯、卵黃膜完整且排出第一極體的成熟卵母細(xì)胞。將卵母細(xì)胞置于融合液(甘露醇0.3 mmol/L，CaCl21.0 mmol/L，MgCl20.1 mmol/L，Hepes 0.5 mmol/L)平衡1 min，轉(zhuǎn)入鋪滿融合液的融合槽中，利用BTX2001細(xì)胞融合儀以1.2 kV/cm,30 μs，2次直流脈沖的條件進(jìn)行激活。之后對照組轉(zhuǎn)入胚胎培養(yǎng)液PZM-3中進(jìn)行培養(yǎng)，試驗(yàn)組則置于添加了不同濃度的5-HT胚胎培養(yǎng)液PZM-3中，于38.5℃、5% CO2和100%濕度的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，48 h 后觀察卵裂情況，7 d后觀察并統(tǒng)計(jì)囊胚發(fā)育情況。

1.4 免疫熒光染色(IF)取出胚胎置于酸性臺式液中反復(fù)吹打以去除透明帶，在含0.1% PVA的PBS中清洗3次后轉(zhuǎn)入4%多聚甲醛中固定30 min。在PBS-PVA中洗滌3次后，將胚胎轉(zhuǎn)入0.1%Triton X-100中透化30 min(若一抗為5mC和5hmC，透化之后應(yīng)先置于4 mol/L HCl中處理30 min后轉(zhuǎn)入Tris-HCl中透化20 min)；在PBS-PVA中洗滌3次后轉(zhuǎn)入含有2%BSA的PBS中室溫封閉1 h或4℃過夜，隨后轉(zhuǎn)入一抗中室溫孵育1.5 h(一抗用含有2%BSA的PBS稀釋，稀釋比例見表1)； 在PBS-PVA中洗滌3次后，將胚胎轉(zhuǎn)移至Alexa Fluor 488山羊抗小鼠(1∶500稀釋液，A-11001，Invitrogen，MA，美國)或Alexa Fluor 594山羊抗兔(1∶500 稀釋液，A-11037，Invitrogen，MA，美國)中避光室溫孵育1 h；在PBS-PVA中洗滌3次，置于DAPI中染色10～15 min； 最后將胚胎轉(zhuǎn)移至載玻片上，并用抗熒光淬滅劑處理后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

表1 免疫熒光染色所用抗體

1.5 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和RT-qPCR收集對照組及5-HT處理組中不同發(fā)育時(shí)期(2-細(xì)胞、 4-細(xì)胞和囊胚)的胚胎，利用RNeasy Mini Kit(Qiagen，Hilden，德國)及反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix)，按照說明書進(jìn)行微量RNA提取及反轉(zhuǎn)錄。將所得cDNA作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR。表2列出了熒光定量PCR所用的引物。熒光定量PCR反應(yīng)體系為10 μL SYBR Green Master Mix，1 μL上游引物和1 μL下游引物，1 μL cDNA和7 μL RNase-free water。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min，之后40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增程序(95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s)，然后進(jìn)行溶解曲線分析(95℃ 60 s,60℃ 60 s,95℃ 1 s)，最后冷卻至4℃。結(jié)果使用2-△△Ct方法進(jìn)行計(jì)算。

表2 熒光定量PCR所用引物信息

1.6 TUNEL染色收集對照組及5-HT處理組的囊胚，置于酸性臺式液中反復(fù)吹打以去除透明帶，在含0.1%PVA的PBS中清洗3次后轉(zhuǎn)入4%多聚甲醛中固定30 min。在PBS-PVA中洗滌3次后，利用TUNEL凋亡染色試劑盒(InSituCell Death Detection Kit)進(jìn)行染色，之后在PBS-PVA中洗滌3次，將囊胚轉(zhuǎn)移到DAPI染色液中孵育10 min。將胚胎轉(zhuǎn)移至載玻片上，并用抗熒光淬滅劑處理后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 5-HT對豬孤雌胚胎發(fā)育能力的影響與對照組相比，500，1 000 μmol/L 5-HT處理組的卵裂率和囊胚率極顯著降低(P<0.01)(圖1)。由于經(jīng)過1 000 μmol/L 5-HT處理的胚胎無法發(fā)育到囊胚階段，則選擇500 μmol/L作為后續(xù)研究的最佳濃度。

A.對照組及處理組的卵裂率變化；B.對照組及處理組的囊胚率變化；C.24，48 h及6 d時(shí)胚胎的發(fā)育圖像(40×)。*P<0.05；**P<0.01。下同

為了評估5-HT處理對胚胎質(zhì)量的影響，收集對照組及處理組的囊胚利用TUNEL試劑盒進(jìn)行凋亡分析，測量總細(xì)胞數(shù)和凋亡率。TUNEL染色結(jié)果如圖2所示，5-HT處理組的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯高于對照組，而囊胚總細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.01)。

A.囊胚凋亡細(xì)胞染色(200×);Bright.明場;Merge.合并;B.囊胚總細(xì)胞數(shù)及凋亡細(xì)胞數(shù)的變化

2.2 5-HT對豬孤雌胚胎組蛋白甲基化的影響免疫熒光染色結(jié)果表明，與對照組相比，5-HT組的H3K4me2及H3K4me3水平在2-細(xì)胞期顯著降低(P<0.01)，在4-細(xì)胞期H3K4me2的水平有所提高，在囊胚期逐漸減弱(P<0.05)(圖3，4)。 熒光定量PCR結(jié)果顯示，在添加500 μmol/L 5-HT處理的2-細(xì)胞期胚胎中，去甲基酶KDM1A和KDM5B的含量明顯增加，而在4-細(xì)胞期顯著下降，最后在囊胚期顯著上升(圖5)。

A.通過免疫熒光染色檢測H3K4me2水平(200×);Bright.明場;Merge.合并;Blastocyst.囊胚；B.H3K4me2熒光強(qiáng)度分析

A.通過免疫熒光染色檢測H3K4me3水平(200×)；B.H3K4me3熒光強(qiáng)度分析

A.KDM1A的mRNA水平;B.KDM5B的mRNA水平

2.3 5-HT對豬孤雌胚胎DNA甲基化水平的影響根據(jù)免疫熒光染色和相對熒光強(qiáng)度的結(jié)果，對照組和5-HT組在2-細(xì)胞、4-細(xì)胞和囊胚期的5mC和5hmC信號水平均未觀察到顯著性差異(圖6)。

A.通過免疫熒光染色檢測DNA甲基化水平(200×);5mC.5甲基胞嘧啶；5hmC.5羥甲基胞嘧啶;B.5mC熒光強(qiáng)度分析;C.5hmC熒光強(qiáng)度分析

2.4 5-HT對多能性基因及凋亡基因的影響熒光定量PCR結(jié)果如圖7所示，5-HT處理組多能性基因SOX2的mRNA水平在2-細(xì)胞、4-細(xì)胞及囊胚期顯著上升，NANOG的mRNA水平在2-細(xì)胞、4-細(xì)胞及囊胚期顯著下降,促凋亡基因BAX在4-細(xì)胞及囊胚期顯著上升(P<0.01)，而抑凋亡基因BCL2則無顯著性差異。

A.多能性基因NANOG的mRNA水平;B.多能性基因SOX2的mRNA水平;C.促凋亡基因BAX的mRNA水平;D.抑凋亡基因BCL2的mRNA水平

3 討論

5-HT在不同的發(fā)育過程中起重要作用，包括細(xì)胞增殖、分化，卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育。LEONOV等[15]首次發(fā)現(xiàn)1 g/L的5-HT會抑制胚胎的發(fā)育。SAKHAROVA等[16]發(fā)現(xiàn)利用5 μmol/L 5-HT預(yù)處理后在4-細(xì)胞階段冷凍保存的胚胎活力明顯增強(qiáng)。IL′KOV等[17]觀察到1 μmol/L 5-HT顯著抑制小鼠植入前胚胎發(fā)育，增加凋亡率。本試驗(yàn)采用500，1 000 μmol/L 5-HT對豬植入前胚胎進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)其顯著降低卵裂率及囊胚率，增加凋亡細(xì)胞數(shù)，這與5-HT對小鼠胚胎的抑制作用是一致的。此外，5-HT處理增加了促凋亡基因BAX的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)一步證實(shí)5-HT對豬植入前胚胎發(fā)育具有抑制作用。

已有研究發(fā)現(xiàn)5-HT對哺乳動(dòng)物植入前胚胎發(fā)育具有抑制作用，但其對胚胎表觀遺傳修飾的作用鮮有研究。本試驗(yàn)中5-HT處理后H3K4me2和H3K4me3水平在2-細(xì)胞階段顯著降低，然后在4-細(xì)胞階段升高，而在囊胚階段逐漸恢復(fù)。H3K4me2和H3K4me3的動(dòng)態(tài)變化主要受組蛋白去甲基化酶KDM1A調(diào)控，而組蛋白去甲基化酶KDM5B可以調(diào)控早期胚胎中H3K4me3水平[18-19]。5-HT可以通過轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2(TGM2)與胞質(zhì)蛋白共價(jià)連接，進(jìn)而附著到組蛋白上(組蛋白5-羥色胺化)，而這一過程會破壞DNA與組蛋白的結(jié)合，并調(diào)控基因表達(dá)，這表明5-HT與組蛋白修飾之間存在密切的聯(lián)系[20-21]。組蛋白甲基化在早期胚胎發(fā)育和細(xì)胞命運(yùn)中起著至關(guān)重要的作用[22-23]。在真核細(xì)胞的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中，組蛋白H3賴氨酸4的甲基化與基因轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄沉默密切相關(guān)， 例如，H3K4me2可以募集HDAc以抑制轉(zhuǎn)錄起始，而H3K4me3主要吸引轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，標(biāo)記活性基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，并通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)來促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄[24]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示KDM1A和KDM5B的表達(dá)變化與H3K4me2和H3K4me3的水平保持一致，表明5-HT處理可通過影響組蛋白甲基化來抑制胚胎發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)5-HT處理可影響豬孤雌胚胎組蛋白甲基化水平，為豬雌配子在胚胎發(fā)育的表觀遺傳調(diào)控提供了新的見解。

在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育的早期，表觀遺傳的動(dòng)態(tài)變化在全基因組轉(zhuǎn)錄中起著至關(guān)重要的作用，從而導(dǎo)致了對諸多基因如多潛能相關(guān)基因的研究[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，5-HT處理顯著提高了SOX2 mRNA表達(dá)水平，但降低了NANOG mRNA的表達(dá)水平。因此，可推測多能性基因啟動(dòng)子處組蛋白修飾的動(dòng)態(tài)變化可能調(diào)節(jié)自身及其下游基因的表達(dá)，從而影響豬的早期胚胎發(fā)育。然而，在胚胎發(fā)育過程中父源基因組對5-HT的影響還有待于進(jìn)一步的研究，需進(jìn)一步探討5-HT對豬體外受精胚胎發(fā)育的影響及組蛋白修飾的調(diào)控。

綜上所述，5-HT對豬的植入前胚胎發(fā)育起著至關(guān)重要的作用，5-HT可能通過改變組蛋白修飾從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)，進(jìn)而抑制豬孤雌胚胎的發(fā)育。本研究為哺乳動(dòng)物體內(nèi)5-HT、組蛋白修飾及胚胎發(fā)育三者之間的關(guān)系提供了新的見解。