崔建鑫，楊艷陽，喬 娜，張卓煒，鄧紀(jì)昌，黃坤玄，楊 帆，李 英*，唐兆新*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物群發(fā)性疾病監(jiān)測與防控研究所，江西 南昌 330045)

國內(nèi)現(xiàn)代瘦肉型母豬養(yǎng)殖使用年限是3～4年，平均年產(chǎn)2.2～2.5胎，年提供仔豬一般水平為20頭(國外可達(dá)到30頭左右)。增加母豬生產(chǎn)胎次和提高高胎齡母豬所產(chǎn)仔豬體質(zhì)可以有效提高母豬的利用率。根據(jù)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展現(xiàn)狀，提高母豬胎次，加強(qiáng)仔豬體質(zhì)迫在眉睫。鈣是影響母豬繁殖的重要因素，在胚胎著床、發(fā)育中起著重要作用，同時(shí)高臍帶血鈣可能有助于胚胎的發(fā)育[1-3]。妊娠期間，母體需要更多的鈣，但隨著年齡的增加，高胎齡母豬整體機(jī)能減弱，鈣攝取能力降低，且經(jīng)過多次生產(chǎn)后更易出現(xiàn)缺鈣現(xiàn)象[4-5]。維生素D是一種脂溶性維生素，可以增強(qiáng)小腸對鈣的吸收，被稱作補(bǔ)鈣劑。與口服維生素D相比，口服25(OH)D3是一種更加安全高效的補(bǔ)充維生素D的方式[6]。這種新型的維生素D在2007年被允許用到豬飼料中[7]，我國農(nóng)業(yè)部第2045號公告將25(OH)D3列入《飼料添加劑品種目錄(2013)》，準(zhǔn)許25(OH)D3在豬生產(chǎn)上作為維生素及類維生素類飼料添加劑使用。近年來的研究認(rèn)為在飼糧中添加25(OH)D3可以提高母豬的生產(chǎn)性能[8]，但在高胎齡母豬及高胎齡缺鈣母豬攻胎飼糧中添加25(OH)D3對母豬及仔豬體內(nèi)激素及抗氧化水平產(chǎn)生的影響尚不清楚。本試驗(yàn)將40頭妊娠85 d 的母豬按照飼糧中鈣含量及是否添加25(OH)D3隨機(jī)分為4組，連續(xù)飼喂至分娩前1 d，探究攻胎飼糧中添加25(OH)D3對高胎齡母豬及初生仔豬血清激素及抗氧化水平的影響，為高胎齡母豬及缺鈣高胎齡母豬攻胎飼糧的配制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)選用健康狀況良好、遺傳背景相似、預(yù)產(chǎn)期均衡的7胎齡妊娠母豬40頭，隨機(jī)分為4組，每組10個重復(fù)。試驗(yàn)日糧配比在符合NRC(2012)標(biāo)準(zhǔn)配比的基礎(chǔ)上，按照試驗(yàn)要求有目的的對飼料鈣、磷和25(OH)D3的含量進(jìn)行調(diào)整并將其分為對照組、低鈣組、25(OH)D3組和低鈣+25(OH)D3組。飼料組成及其營養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)過程中，鈣、磷和25(OH)D3添加情況見表2。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ)) %

表2 試驗(yàn)飼料鈣、磷和25(OH)D3添加水平

1.2 飼養(yǎng)管理試驗(yàn)在廣州韶關(guān)翁源縣豐澤畜牧養(yǎng)殖有限公司豬場進(jìn)行。在母豬妊娠85～114 d按照試驗(yàn)分組飼喂母豬，85～90 d每頭母豬每日飼喂2 kg，91 d至分娩,每頭母豬每天飼喂3 kg，懷孕110 d，轉(zhuǎn)入產(chǎn)房。母豬分娩后，改用母豬哺乳料。產(chǎn)房溫度控制在20℃，試驗(yàn)期間按豬場日常管理程序給試驗(yàn)豬喂料、飲水和免疫。

1.3 母豬血樣采集分別在母豬妊娠85，114 d 耳緣靜脈采血，新鮮血液于4℃放置30 min，3 000 r/min 離心15 min，收集上清，分裝于0.5 mL離心管，液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

仔豬血樣：仔豬初生2 h內(nèi)，前腔靜脈采集血液。血清收集和儲存方法與母豬血樣相同。

1.4 試驗(yàn)材料及儀器雌二醇(E2)、豬促紅細(xì)胞生成素(EPO)、豬甲狀旁腺素(PTH)、豬皮質(zhì)醇(Cor)和豬甲狀腺激素(T4)酶聯(lián)免疫分析試劑盒均購自上海酶聯(lián)公司。過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、血清丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)試劑盒購自南京建成。Elx 808型酶標(biāo)儀，購自Bio Teck公司(美國)；Nanodrop2000型，微量紫外分光光度計(jì)，購自Thermo Fisher科技公司(美國)。

1.5 母豬及仔豬血清激素水平檢測母豬及仔豬血清冰上融化后，離心，使用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測母豬血清中E2、EPO、PTH、Cor和T4激素水平和仔豬血清中EPO、PTH、Cor和T4激素水平。檢測過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 母豬及仔豬血清抗氧化水平檢測母豬及仔豬血清冰上融化后，離心，采用酶標(biāo)儀法測定血清中MDA含量、ROS水平以及SOD的活力，其中ROS水平用熒光強(qiáng)度值(FIV)表示。微孔法檢測血清中CAT、GSH-Px的活力。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果

2.1 攻胎飼糧添加25(OH)D3對高胎齡母豬血清激素的影響檢測結(jié)果如表3所示，母豬妊娠85 d血清內(nèi)E2、EPO、PTH、T4、Cor激素在各組之間均無顯著性差異(P>0.05)。表4中的結(jié)果表明，與對照組相比，母豬妊娠114 d時(shí)的25(OH)D3組E2激素含量顯著降低(P<0.05)，但EPO激素含量顯著上升(P<0.05)。妊娠114 d，母豬血液內(nèi)T4激素含量均有升高，但各組之間均無顯著性差異(P>0.05)；低鈣組母豬血清中PTH含量顯著高于25(OH)D3組和低鈣+25(OH)D3組(P<0.05)，但與對照組相比沒有顯著性差異(P>0.05)。Cor激素在低鈣+25(OH)D3組含量最高，且顯著高于25(OH)D3組(P<0.05)，除此之外，其他各組之間均差異不顯著(P>0.05)。主效應(yīng)分析表明，飼糧中添加25(OH)D3可顯著提高母豬EPO的激素水平(P<0.05)，低鈣的情況下可造成Cor含量上升。

表3 各組妊娠85 d母豬血清中激素表達(dá)水平

表4 各組妊娠114 d母豬血清中激素表達(dá)水平

2.2 攻胎飼糧中添加25(OH)D3對仔豬血清激素的影響初生仔豬血清激素檢測結(jié)果如表5所示，25(OH)D3組仔豬血清中EPO含量顯著高于對照組(P<0.05)，低鈣+25(OH)D3組EPO含量顯著低于低鈣組和25(OH)D3組(P<0.05)。仔豬血清T4含量在各組之間均無顯著性差異(P>0.05)。與對照組相比，低鈣組、25(OH)D3組和低鈣+25(OH)D3組血清PTH激素含量均顯著升高(P<0.05)。Cor含量在25(OH)D3組顯著低于其他3個試驗(yàn)組(P<0.05)。主效應(yīng)分析表明，鈣和25(OH)D3聯(lián)合能顯著降低EPO激素水平的表達(dá)(P<0.05),鈣能顯著影響Cor激素水平。

表5 各組初生仔豬血清中激素表達(dá)水平

2.3 添加25(OH)D3對高胎齡母豬血清抗氧化水平的影響如表6所示，母豬妊娠85 d，抗氧化各指標(biāo)在各組之間均無顯著性差異。表7所示，相比于對照組，妊娠母豬114 d時(shí)，25(OH)D3組與低鈣組的ROS水平顯著降低(P<0.05)，但低鈣+25(OH)D3組ROS含量高于兩者。妊娠114 d母豬血清中，25(OH)D3組和低鈣+25(OH)D3組血清中SOD、CAT、GSH-Px的含量顯著高于對照組和低鈣組(P<0.05)，與此同時(shí)，低鈣組中CAT含量與對照組相比顯著降低(P<0.05)。MDA水平在各組之間均沒有顯著變化(P>0.05)。主效應(yīng)分析表明，在飼料中添加25(OH)D3可顯著提升SOD、CAT、GSH-Px的表達(dá)量(P<0.05)。

表6 各組妊娠85 d母豬血清中抗氧化指標(biāo)水平

表7 各組妊娠114 d母豬血清中抗氧化指標(biāo)水平

2.4 母豬飼糧中添加25(OH)D3對仔豬血清抗氧化水平的影響如表8所示，初生仔豬低鈣組和低鈣+25(OH)D3組血清中ROS水平顯著低于對照組(P<0.05)。與母豬血清激素抗氧化水平檢測結(jié)果相同，初生仔豬25(OH)D3組和低鈣+25(OH)D3組血清中SOD、CAT的含量顯著高于對照組和低鈣組(P<0.05)。GSH-Px和MDA水平在各組之間均沒有顯著變化(P>0.05)。主效應(yīng)分析結(jié)果表明，25(OH)D3可以顯著提高仔豬的抗氧化水平。

表8 各組初生仔豬血清中抗氧化指標(biāo)水平

3 討論

3.1 攻胎飼糧中添加25(OH)D3對母豬及仔豬血清激素的影響膽骨化醇是補(bǔ)充維生素D常見的渠道，腸黏膜吸收膽骨化醇之后轉(zhuǎn)變?yōu)?5(OH)D3，繼而轉(zhuǎn)變?yōu)?,25-二羥基維生素D3(1,25(OH)2D3)。激素對機(jī)體的生長、發(fā)育、繁殖、代謝等起著重要的調(diào)節(jié)作用，適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)激素水平對機(jī)體生長發(fā)育等有促進(jìn)作用[9-10]。鈣穩(wěn)態(tài)是通過腸道吸收、腎臟排泄和骨代謝來調(diào)節(jié)的，這些過程受PTH、性激素和維生素D等調(diào)控[11]。PTH作為與機(jī)體生長發(fā)育至關(guān)重要的激素之一，其含量與機(jī)體內(nèi)鈣和25(OH)D3的含量密不可分。機(jī)體可通過調(diào)節(jié)PTH的含量來控制血清內(nèi)25(OH)D3與鈣的平衡，當(dāng)機(jī)體缺乏維生素D時(shí)，PTH分泌增多，且血清中的PTH與25(OH)D3含量成反比[12-13]。同時(shí)有研究表明[14]，PTH能動員鈣從骨組織中釋放到血清中，低鈣會在一定程度上提高PTH的表達(dá)量。在本研究中，低鈣組母豬和仔豬血清內(nèi)PTH含量最高，且低鈣組母豬血清內(nèi)PTH含量顯著高于25(OH)D3組和低鈣+25(OH)D3組，同時(shí)低鈣組仔豬血清PTH含量顯著高于其他3個試驗(yàn)組，本試驗(yàn)結(jié)果對PTH、鈣、維生素D之間的相互影響做了印證。4個試驗(yàn)組中，25(OH)D3組的E2激素表達(dá)量最低并顯著低于對照組，低鈣+25(OH)D3組表達(dá)量也低于對照組，但差異不顯著。母體妊娠8周之后，E2主要由胎兒-胎盤分泌，且妊娠后期母體E2水平上升會導(dǎo)致胎兒獲得的營養(yǎng)物質(zhì)減少，引起胎兒T4水平下降，生長速度下降[15,16]。而本試驗(yàn)中，各試驗(yàn)組間母豬和仔豬血清T4含量均沒有顯著性差異。且母豬25(OH)D3組血清內(nèi)T4含量最高，低鈣組及低鈣+25(OH)D3組依次低于對照組；仔豬25(OH)D3組血清內(nèi)T4含量最低，低鈣+25(OH)D3組及低鈣組依次高于對照組。陳勝等[15]在對兔的研究中發(fā)現(xiàn)，母兔TH水平上升對初生仔兔TH水平無顯著影響。但BUZZARD等[17]認(rèn)為，由于種間成熟期以及胎盤屏障的通透性的差異性，其結(jié)果會有一定的差異。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果推測機(jī)體內(nèi)鈣和25(OH)D3的含量對T4水平?jīng)]有顯著的影響。

促紅細(xì)胞生成素(EPO)是由腎皮質(zhì)腎小管周圍間質(zhì)細(xì)胞和肝臟細(xì)胞分泌的一種激素類物質(zhì)，參與紅細(xì)胞前體細(xì)胞的分化與成熟。KIM等[18]發(fā)現(xiàn)EPO在體內(nèi)可通過激活JAK/STAT信號通路促進(jìn)骨形態(tài)蛋白(BMP2)的產(chǎn)生和骨形成，同時(shí)EPO在體外可以直接激活間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞[18]。用25(OH)D3喂養(yǎng)高胎次母豬可減少骨代謝，改善骨狀態(tài)，同時(shí)也可增強(qiáng)初生仔豬的生長性能及骨狀態(tài)[19]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，25(OH)D3組母豬及仔豬血清內(nèi)EPO激素水平顯著高于對照組，但是低鈣組母豬及仔豬血清中EPO含量均高于對照組，但差異不顯著。對各組EPO的表達(dá)量進(jìn)行分析后我們發(fā)現(xiàn)，25(OH)D3在母豬血清EPO的變化中起主效應(yīng)；而在仔豬血清中鈣和25(OH)D3聯(lián)合作用起主效應(yīng),但對于仔豬低鈣組EPO表達(dá)量的升高，推斷缺鈣初期機(jī)體會代償性產(chǎn)生較多的EPO，但其作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。Cor是一種內(nèi)源性的糖皮質(zhì)激素，參與哺乳動物各種復(fù)雜的生物效應(yīng)，如生長、免疫反應(yīng)和新陳代謝，在機(jī)體受到壓力時(shí)會升高。試驗(yàn)結(jié)果顯示，25(OH)D3組母豬與仔豬血清中Cor含量最低，由此推斷25(OH)D3可以減輕母豬孕期壓力。對各組母豬血清內(nèi)Cor含量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，鈣在Cor的表達(dá)中起主效應(yīng)。

3.2 攻胎飼糧中添加25(OH)D3對母豬及仔豬血清抗氧化水平的影響ROS被認(rèn)為是生成ATP過程中的氧化代謝產(chǎn)物，ROS的積累超過細(xì)胞抗氧化能力水平時(shí)會損傷細(xì)胞，有研究表明Ca2+與ROS有一定的關(guān)聯(lián)[20-21]。母豬缺鈣會使線粒體呼吸會受到一定程度的抑制，導(dǎo)致ROS含量降低[22]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示妊娠母豬低鈣組血清中的ROS含量顯著低于對照組，同時(shí)妊娠114 d的母豬25(OH)D3組血清內(nèi)的ROS含量低于低鈣組，推測其可能是因?yàn)镃a2+參與呼吸鏈中部分酶的合成，誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生。機(jī)體抗氧化水平與Ca2+的攝取量呈正相關(guān)，同時(shí)也受到1,25(OH)2D3激素的調(diào)控[23]。目前發(fā)現(xiàn)1,25(OH)2D3能增加抗氧化酶、解耦連蛋白2(CUP2)、CUP3的表達(dá)[24]。UCP可抑制電子傳遞鏈中電子泄露，降低能量代謝中產(chǎn)生的自由基[25]。

SOD是一種需氧生物中以超氧陰離子為底物的酶，也是一類重要的氧自由基清除劑，妊娠后逐漸增加。CAT是一種機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一類末端氧化酶，能催化H2O2分解，減少羥自由基(·OH)的產(chǎn)生，清除體內(nèi)ROS，減輕其對細(xì)胞的損害[26]。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)存在的含硒清除自由基和抑制自由基反應(yīng)的系統(tǒng)，可以清除ROS和酯質(zhì)過氧化物。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，25(OH)D3組在母豬及仔豬血清中SOD、CAT的活力顯著高于對照組與低鈣組，而低鈣+25(OH)D3組SOD、CAT的活力處于25(OH)D3組和低鈣組之間，且25(OH)D3對SOD、CAT的活力影響起主效應(yīng)，同時(shí)母豬血清中GSH-Px有著相同的結(jié)果；表明25(OH)D3可以有效改善高胎齡母豬及初生仔豬的抗氧化能力。