李善政，葉幼榮，張笑冰，常振宇

(西藏農(nóng)牧學院 動物科學學院，西藏 林芝 860000)

藏雞是高海拔地區(qū)經(jīng)過長期自然選擇和人工馴養(yǎng)的原始地方雞種，也是世界上在高海拔生活歷史最久的雞種[1]。鈉氯同向轉(zhuǎn)運體(Na-Clcotransporter，NCC)是腎臟的一個協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白，主要在動物腎臟遠曲小管細胞內(nèi)發(fā)揮作用，具有重吸收Na+和Cl-的功能[2-4]。腎臟遠曲小管(distal convoluted tubule，DCT)根據(jù)不同的功能分為2段，分別為DCT1段和DCT2段，NCC遍布于整段DCT1[5]，是遠曲小管重吸收鈉的重要通道蛋白。鈉離子從上皮細胞轉(zhuǎn)運至組織間液的過程需要借助于 DCT1 段頂質(zhì)膜的 NCC 和基底外側(cè)膜的Na+-K+-ATPase才能完成[6-7]。研究表明，人類、家兔、雞、鼠和鰻魚的腎臟都有NCC的存在[8-10]。噻嗪類利尿劑主要通過抑制腎臟遠曲小管靶蛋白NCC的表達從而使小管液中的鈉離子濃度升高，水的重吸收降低，發(fā)揮利尿的作用[11-13]，而NCC對壓力性利尿具有決定性作用[14]。多巴胺(dopamine，DA)作為神經(jīng)遞質(zhì)，主要調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元之間的信息傳遞[15]。有研究表明：多巴胺作為利尿利鈉激素[16]，可以控制腎小管絕大部分Na+的重吸收，被廣泛用于各種相關(guān)病癥的治療，如心力衰竭、高血壓及頑固性腹水等[17]。低劑量多巴胺對藏雞腎臟NCC穿梭的調(diào)節(jié)目前尚未見報道。本試驗給藏雞低劑量注射左旋多巴胺后，檢測NCC蛋白和mRNA在腎臟中表達的變化，以期為多巴胺調(diào)控藏雞水鹽代謝的機制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物1日齡健康藏雞50只(購自西藏林芝市某養(yǎng)雞場)，雌雄各半，按常規(guī)飼養(yǎng)條件飼養(yǎng)，環(huán)境溫度10～20℃、濕度55%～65%，自由采食和飲水，給予24 h 光照。飼養(yǎng)至28日齡，隨機分為2組。試驗組采用輸液泵持續(xù)靜脈注射低劑量左旋多巴胺，對照組用相同劑量生理鹽水代替，注射時間均為4 h。

1.2 試驗方法將左旋多巴按2～5 μg·kg-1·min-1的劑量用生理鹽水稀釋，輸液泵以勻速模式，速度為2 mL/h持續(xù)向靜脈加注，采取雞的翅下靜脈注射，注射完成做好記錄。

1.2.1血清生化指標及mPAP檢測 2組藏雞經(jīng)多巴胺和生理鹽水處理后，剪開腹部，尋找腹主動脈，抽取約 5 mL 動脈血于離心管中，1 000 r/min離心30 min，吸取上清于無菌 EP 管中，用便攜式血氣分析儀(江蘇南分)測定血清中血鈉、血鉀、血氯，尿素氮、肌酐等指標的變化。

雞只在試驗前 5 h 內(nèi)禁食，對左股內(nèi)側(cè)進行局部麻醉，仰臥保定于操作臺上，剝離左側(cè)股動脈，遠心端結(jié)扎，近心端用止血鉗夾住，開一小口，沿近心端緩慢插入含有3.8% 檸檬酸鈉的導管，然后結(jié)扎血管，松開止血鉗，壓力信號由傳感器傳輸給多導儀，觀察壓力曲線，記錄壓力值。

1.2.2免疫組化檢測NCC蛋白的表達 腹主動脈取血后，分離腎臟并充分沖洗，待腎臟顏色變白后用4%甲醛溶液固定保存。腎組織經(jīng)包埋切片后，H2O2孵育，微波法熱修復抗原，常規(guī)血清封閉，按照常規(guī)免疫組化方法，依次滴加一抗(兔抗鼠NCC抗體)、二抗(山羊抗兔 HRP-IgG)、SABC復合物，陰性對照用PBS緩沖液代替一抗，DAB 法顯色、復染、脫水透明和封片，于顯微境下觀察不同組腎組織中NCC蛋白的表達。

1.2.3Western blot檢測NCC蛋白的表達 取不同組藏雞腎組織分別置于已預冷的裂解液和PMSF抑制劑中，組織勻漿，提取細胞膜蛋白及胞漿蛋白，冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心10 min。將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，用BCA試劑盒測定蛋白濃度及含量后加入上樣緩沖液，變性10 min。每孔30 μL進行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，滴加一抗(兔抗鼠NCC)，按1∶500用 TBST稀釋，4℃過夜，TBST于室溫下沖洗5 min×4次。山羊抗兔 HRP-IgG為二抗，按1∶5 000用 TBST稀釋，37℃孵育2 h，TBST于室溫下沖洗5 min×4次。膜上孵育1～2 min顯色，放入凝膠成像儀中曝光成像，并利用Quantity One軟件分析條帶灰度值，目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值之比作為結(jié)果進行比較。

1.2.4RT-qPCR檢測NCC mRNA的表達 采用常規(guī)TRIzol法提取不同組藏雞腎組織總RNA，用核酸定量儀對RNA的純度和濃度進行檢測，將檢測合格的 RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于-20℃。根據(jù)GenBank中NCC和GAPDH的mRNA 序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，引物信息見表1。用Light Cycler 480 PCR儀(Roche公司)對NCC和內(nèi)參基因β-actin的mRNA相對表達量進行檢測。RT-qPCR反應(yīng)體系20 μL：cDNA 2 μL，上、下游引物(10 μmoL/L)各1 μL，2×Master Mix 10 μL，ddH2O 6 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預變性15 min；95℃變性10 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，共40個循環(huán)。相對表達量采用2-ΔΔCt方法進行計算。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 藏雞mPAP檢測不同組藏雞平均動脈壓變化如圖1所示，注射多巴胺后，藏雞的mPAP有輕微波動，但與對照組相比，差異不顯著(P>0.05)。

圖1 平均動脈壓變化

2.2 血清生化指標結(jié)果由表2可知，2組藏雞血清中的鈉、鉀、氯、尿素氮以及肌酐等各項指標均未發(fā)生明顯變化(P>0.05)。

表2 試驗藏雞血清生化指標的變化

2.3 免疫組化檢測腎組織NCC表達2組藏雞腎臟遠曲小管頂質(zhì)膜NCC免疫組化結(jié)果如圖2所示，試驗組和對照組腎臟遠曲小管上皮細胞上顯示出明顯的棕黃色，陽性反應(yīng)強，表明NCC在藏雞腎臟遠曲小管中有表達，其中細胞膜陽性表達較細胞質(zhì)更強烈；空白組(不加一抗)無陽性反應(yīng)顯色。

A.空白組(不加一抗)；B.試驗組；C.對照組

2.4 Western blot 檢測腎組織NCC 表達結(jié)果由圖3可知,靜脈注射多巴胺后，NCC蛋白在遠曲小管上皮細胞胞膜中的表達水平顯著降低(P<0.05)，而細胞質(zhì)中NCC蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)。

A.細胞膜中NCC蛋白表達量；B.細胞質(zhì)中NCC蛋白表達量

2.5 RT-qPCR檢測腎組織NCC mRNA由圖3可知，與對照組相比，靜脈注射左旋多巴后，藏雞腎臟中 NCC mRNA表達水平未發(fā)生顯著變化(P>0.05)。

圖4 藏雞腎組織NCC mRNA表達水平

3 討論

腎臟是調(diào)節(jié)和維持電解質(zhì)、水鹽代謝和酸堿平衡的重要器官[18]。腎臟遠曲小管的生理功能是重吸收水分和鈉離子，是機體內(nèi)離子轉(zhuǎn)運和分泌的關(guān)鍵場所，對血液中酸堿平衡的調(diào)節(jié)起著至關(guān)重要的作用。多巴胺可以通過促進腎臟血管擴張來調(diào)節(jié)腎血流量的增加，從而調(diào)節(jié)腎臟鈉水的重吸收，促進利鈉排尿，起到保護腎臟、調(diào)節(jié)血壓的作用[19]。目前低劑量多巴胺已被廣泛應(yīng)用于心功能衰竭、腎功能衰竭及高血壓等的治療[17]。由于多巴胺的濫用，致使多巴胺的用途也飽受爭議[20]。有相關(guān)研究表明，多巴胺不能在腎臟中直接合成，但可在腎臟血液循環(huán)中捕獲左旋多巴經(jīng)芳香左旋氨基酸脫羧酶(AADC)轉(zhuǎn)化成多巴胺[21]。同時由于多巴胺在機體內(nèi)代謝的半衰期短[22]，所以在設(shè)計給藏雞輸送小劑量多巴胺的試驗時，采用的是靜脈持續(xù)注射。另外，腎臟內(nèi)轉(zhuǎn)化生成的多巴胺不能發(fā)揮收縮血管的作用，只是單獨調(diào)節(jié)水鈉通道及干擾其他激素來實現(xiàn)腎臟對水鹽的調(diào)節(jié)，發(fā)揮利鈉排尿的作用[19]。多巴胺有類似血管加壓素的功能，可調(diào)節(jié)NCC表達[23]。本試驗通過免疫組化檢測多巴胺組和對照組的藏雞腎遠曲小管NCC的表達，驗證了以上結(jié)論。

血清中的尿素氮和肌酐都是體現(xiàn)腎功能的主要指標，肌酐主要是由肌肉組織產(chǎn)生的代謝廢物，且主要通過腎臟排泄，可以體現(xiàn)腎小球的濾過功能[24]；尿素氮是一種含氮化合物，由腎小球濾過而排出體外[25]。本試驗以血清尿素氮指標來輔助血肌酐指標，驗證小劑量多巴胺對藏雞腎小球濾過率的影響，通過檢測發(fā)現(xiàn)，靜脈注射多巴胺后，藏雞血清中Na+、K+、Cl-、BUN和Cre等5項生化指標的變化差異不明顯。以此間接驗證了小劑量多巴胺不是通過調(diào)控腎小球濾過率，而是通過干擾腎小管的重吸收來達到利鈉排尿的效果。

為進一步驗證低劑量多巴胺對藏雞腎臟利鈉利尿的機制，本試驗通過Western blot對腎臟遠曲小管胞膜和胞質(zhì)中NCC蛋白的差異表達進行了檢測，發(fā)現(xiàn)注射多巴胺后，胞質(zhì)中NCC的表達顯著增多而胞膜中的表達顯著減少。由此可揭示低劑量多巴胺主要通過調(diào)節(jié)NCC蛋白在遠曲小管胞膜與胞質(zhì)之間的穿梭從而降低腎臟對水重吸收的功能[26]。本試驗還通過RT-qPCR檢測了NCC mRNA的水平變化，與對照組藏雞NCC mRNA相比，持續(xù)靜脈注射左旋多巴胺的藏雞NCC mRNA水平無明顯變化，由此推測低劑量多巴胺有可能是通過調(diào)控NCC的磷酸化來促進NCC內(nèi)化，從而減少了腎遠曲小管對水的重吸收[27-28]。在藏雞試驗組持續(xù)注射小劑量多巴胺0.5 h后也發(fā)現(xiàn)，試驗組藏雞的糞便明顯軟化至水樣，糞便中的尿量明顯增多，推測出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因為在多巴胺的影響下，NCC迅速內(nèi)化轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)，弱化了腎遠曲小管的對鈉水的重吸收，從而導致尿量增加[29-30]。

本試驗給藏雞靜脈連續(xù)注射小劑量左旋多巴胺后，藏雞的mPAP、血清生化指標以及NCC mRNA表達水平無顯著性變化，但NCC蛋白在腎臟遠曲小管細胞質(zhì)中表達量高于細胞膜；推測多巴胺可能是通過誘導腎小管細胞膜NCC蛋白向胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，瞬時調(diào)節(jié)NCC的穿梭，而不是通過長時調(diào)節(jié)來實現(xiàn)利鈉利尿的功能。