王忠清，楊顯朝，劉 娟,2*

(1.西南大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，重慶 榮昌 402460；2.西南大學(xué) 免疫學(xué)研究中心，重慶 榮昌 402460；3.重慶市萬州區(qū)茨竹鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，重慶 萬州 404100)

現(xiàn)代集約化養(yǎng)殖方式使得畜禽活動(dòng)受到嚴(yán)格限制，畜禽會因久臥或久坐而傷及脾胃，故脾虛證在動(dòng)物生產(chǎn)中發(fā)病率較高。脾虛證主要表現(xiàn)為消化不良或腹瀉，嚴(yán)重影響著畜禽的生產(chǎn)性能[1]。機(jī)體消化功能與胃腸激素的分泌有著密切聯(lián)系[2]，胃腸激素中的胃泌素(gastrin,GAS)和胃動(dòng)素(motilin,MTL)分別能通過刺激胃酸分泌和胃腸運(yùn)動(dòng)來促進(jìn)胃腸消化吸收[3]。此外，脾虛證動(dòng)物也會因?yàn)榧?xì)胞免疫因子的分泌紊亂，繼而出現(xiàn)免疫功能下降的現(xiàn)象[4-5]。研究表明，脾虛證家兔細(xì)胞免疫功能降低的原因可能與血液中T淋巴細(xì)胞比例下降有關(guān)[6]；而活化的T淋巴細(xì)胞所分泌的IL-2、IL-4、IFN-γ是維持機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要因子[7]。而且環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)、環(huán)鳥苷酸(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)作為細(xì)胞內(nèi)第二信使，cAMP/cGMP的平衡也對機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和維持細(xì)胞能量代謝發(fā)揮著重要作用[8]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，黨參及其炮制品(米黨參和蜜黨參)均能有效治療家兔脾虛證[9]。中獸醫(yī)臨床上治療脾虛證，宜補(bǔ)脾益氣，健脾利水；常采取中藥復(fù)方治療，如四君子湯(sijunzi decoction,SJZD)、六君子湯、理中湯等。為豐富黨參炮制品的臨床應(yīng)用，我們制備了含黨參的四君子湯(SJZD-Ⅰ)、含米黨參的四君子湯(SJZD-Ⅱ)和含蜜黨參的四君子湯(SJZD-Ⅲ)擬用于治療動(dòng)物脾虛證。本研究中，我們探討了SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ對脾虛證家兔的療效，并探究其對脾虛證家兔部分血液生理指標(biāo)、料重比和血清中胃腸激素(GAS、MTL)、免疫因子(IL-2、IFN-γ、IL-4)、cAMP/cGMP水平的影響，為黨參炮制品的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物50只健康家兔，體質(zhì)量(1.5±0.3) kg，雌雄各半，由西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 試驗(yàn)藥物黨參(批號：150401)購自廣州健澤藥業(yè)有限公司，厚樸(批號：160301)、枳實(shí)(批號：160901)、麩炒白術(shù)(160701)、茯苓(批號：160301)購自成都仁濟(jì)宏藥業(yè)有限公司，大黃(批號：170301)、炙甘草(批號：170301)購自重慶眾妙藥業(yè)有限公司。

1.3 主要試劑兔IL-2、IL-4、IFN-γ、GAS、MTL、cAMP、cGMP等ELISA試劑盒(批號：201712)均購自廈門惠嘉生物科技有限公司。

1.4 藥物制備

1.4.1厚樸三物湯的制備 參照文獻(xiàn)[10]稱取厚樸、枳實(shí)、大黃三味中藥(3∶3∶2)，加水將厚樸、枳實(shí)浸泡40 min，大黃浸泡20 min；再將厚樸、枳實(shí)煎沸10 min，然后加大黃共煎10 min，過濾；加水再次煎沸10 min，過濾。合并2次濾液，于60℃濃縮至藥液質(zhì)量濃度為0.5 kg/mL，保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2黨參炮制品及SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ的制備 取200 g大米至炒藥鍋中，中火加熱至大米冒煙時(shí)，倒入1 000 g切制好的黨參片，炒至大米呈老黃色，篩去米，放冷即得米黨參。取250 g煉蜜加入適量沸水稀釋，加入1 000 g黨參片拌勻并燜透，置炒藥鍋中,文火加熱并炒至棕黃色，不黏手時(shí)取出，放冷即得蜜黨參。SJZD-Ⅰ的制備：稱取黨參、麩炒白術(shù)、茯苓、炙甘草(2∶2∶2∶1)四味藥，加水浸泡30 min,煎煮3次，時(shí)間分別為2.0，1.5，1.0 h，合并3次濾液，濃縮至生藥0.5 kg/mL，即得。同法分別將黨參替換為米黨參和蜜黨參制備得到SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ藥液，保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 分組與處理將家兔適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，隨機(jī)分為對照組、模型組、SJZD-Ⅰ組、SJZD-Ⅱ組和SJZD-Ⅲ組，每組10只。模型組、SJZD-Ⅰ組、SJZD-Ⅱ組和SJZD-Ⅲ組家兔采用厚樸三物湯(按照5 mL/kg,2 d灌胃)加饑飽失常法(灌胃當(dāng)日禁食，次日飼喂料不限量)建立家兔脾虛證模型，對照組家兔按照同樣方法灌胃生理鹽水。參照《中獸醫(yī)診斷學(xué)》[11]，家兔表現(xiàn)有精神倦怠、采食量下降或食欲減退、糞便軟或溏、舌色淡白、脈細(xì)弱等主要臨床癥狀，說明家兔脾虛證模型成功建立。家兔脾虛證模型建立后，SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ組按照2 mL/kg/d分別灌胃SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ藥液，對照組和模型組按照同樣方法灌胃生理鹽水，1次/d，連續(xù)灌胃5 d，自由飲食，末次給藥后再觀察2 d。

1.6 脾虛家兔療效觀察與料重比測定臨床觀察并記錄家兔精神、采食、被毛、口舌及糞便等情況，根據(jù)文獻(xiàn)資料[12]制定脾虛家兔臨床癥狀評分標(biāo)準(zhǔn)(表1所示)，并參考《中獸醫(yī)學(xué)》[13]和《中獸醫(yī)內(nèi)科學(xué)》[14]診療判定標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)療效(表2)。在造模成功后和治療結(jié)束時(shí)，對家兔空腹稱體質(zhì)量并記錄。

表1 家兔脾虛的臨床癥狀評分標(biāo)準(zhǔn)

表2 家兔脾虛療效判定標(biāo)準(zhǔn)

1.7 家兔部分血液生理指標(biāo)、胃腸激素、細(xì)胞因子及cAMP/cGMP水平測定末次給藥2 d后禁食不禁水8 h，采集家兔耳緣靜脈血抗凝血樣，檢測RBC和Hb水平；采集凝血血樣置4℃過夜，4 000 r/min離心10 min，吸取血清，嚴(yán)格參照酶聯(lián)免疫(ELISA)法試劑盒說明書，測定血清中GAS、MTL、IL-2、IL-4、IFN-γ、cAMP和cGMP水平。

1.8 數(shù)據(jù)分析所有數(shù)據(jù)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用單因素方差分析和Duncan多重比較，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同黨參炮制四君子湯對脾虛證家兔的臨床治療效果觀察對照組家兔活動(dòng)敏捷、皮毛光亮、飲食欲俱佳、糞便正常。模型組家兔出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍，精神倦怠，飲食欲低下，體瘦毛焦，肚腹脹滿，糞便稀軟，舌苔嫩白，脈細(xì)弱等癥狀。與模型組比較，SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ組家兔精神狀況和飲食欲恢復(fù)正常，被毛、口舌、脈象及糞便形態(tài)基本恢復(fù)正常。各治療組脾虛家兔的治療結(jié)果詳見表3。

表3 各治療組脾虛證家兔療效

2.2 不同黨參炮制四君子湯對脾虛證家兔料重比及血液生理指標(biāo)的影響如表4所示，與對照組比較，模型組家兔體質(zhì)量下降，其平均日增重和料重比為負(fù)值，差異極顯著(P<0.01)。與模型組比較，SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ組家兔平均日增重增加，料重比為正值，差異極顯著(P<0.01)。如圖1所示，與對照組比較，模型組家兔血液中RBC和Hb含量均有降低的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)；與模型組比較，SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ組家兔血液中RBC和Hb含量有升高的趨勢，其中SJZD-Ⅲ組家兔血液中Hb含量顯著升高(P<0.05)。

圖1 家兔部分血液生理指標(biāo)變化

表4 家兔料重比變化

2.3 不同黨參炮制四君子湯對脾虛證家兔胃腸激素的影響與對照組比較，模型組家兔血清中GAS水平降低，差異不顯著(P>0.05)；MTL水平降低，差異極顯著(P<0.01)。與模型組比較，SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ組家兔血清中GAS水平均升高，差異顯著(P<0.05)；SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ組家兔血清中MTL水平均升高，差異極顯著(P<0.01)，見圖2。

圖2 家兔血清中GAS、MTL水平變化

2.4 不同黨參炮制四君子湯對脾虛證家兔血清IL-2、IL-4、IFN-γ的影響與對照組比較，模型組家兔血清中IL-2、IFN-γ水平極顯著降低(P<0.01)，IL-4水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ組家兔血清IL-2、IFN-γ水平均極顯著升高(P<0.01)，SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ組家兔血清中IL-4水平有降低的趨勢，其中SJZD-Ⅱ組家兔血清中IL-4水平顯著降低(P<0.05)，見圖3。

圖3 家兔血清中IL-2、IL-4，IFN-γ水平變化

2.5 不同黨參炮制四君子湯對脾虛證家兔血清cAMP、cGMP水平及cAMP/cGMP的影響與對照組比較，模型組家兔血清cAMP水平、cAMP/cGMP比值均極顯著降低(P<0.01)，cGMP水平極顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ組家兔血清cAMP水平、cAMP/cGMP比值均極顯著升高(P<0.01)，SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ組家兔血清中cGMP水平均有降低的趨勢，SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ組家兔血清中cGMP水平分別極顯著和顯著降低(P<0.01和P<0.05)，見圖4。

圖4 家兔血清中cAMP、cGMP水平及其比值變化

3 討論

研究表明，四君子湯能通過改善腸道菌群的多樣性調(diào)理脾虛證[15]。經(jīng)典四君子湯和獸用四君子湯的君藥分別為人參和黨參，而人參和黨參都?xì)w脾、肺二經(jīng)，能補(bǔ)脾益氣，提高機(jī)體免疫力。中藥炮制的目的主要是加強(qiáng)藥物功效，減輕毒性或副作用。蜜炙的方法多用于炮制止咳平喘，補(bǔ)脾益氣的藥材；米炒的炮制方法能緩和黨參燥性，用于治療脾胃虛弱等證候[16]。本研究表明，含黨參、米黨參和蜜黨參的四君子湯對家兔脾虛證的治愈率分別達(dá)到了80%，80%，90%，說明不同黨參炮制四君子湯均對動(dòng)物脾虛證有較好的療效，其中以含蜜黨參的四君子湯效果最佳，推測黨參經(jīng)過蜜炙后其補(bǔ)中益氣作用得以增強(qiáng)。

中醫(yī)“脾”的功能主要以消化為主，消化系統(tǒng)功能的異常是脾虛證最基本的病理變化。在消化過程中，GAS能刺激消化液分泌，促進(jìn)胃竇收縮；MTL則刺激胃蛋白酶分泌，促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)。研究表明，脾虛證動(dòng)物血清中GAS、MTL水平明顯低于正常動(dòng)物[17]；高云芳等[18]研究結(jié)果提示，四君子湯可能通過促進(jìn)胃液分泌而提高胃泌素的分泌水平。本研究結(jié)果表明，脾虛證家兔血清中GAS、MTL水平降低，體質(zhì)量減少；而不同黨參炮制四君子湯均能提高脾虛證家兔血清中GAS、MTL水平，促進(jìn)體質(zhì)量增加，說明不同黨參炮制四君子湯均能增強(qiáng)脾虛證動(dòng)物胃腸道消化功能。本研究結(jié)果提示，四君子湯中米黨參和蜜黨參相比黨參組方更能促進(jìn)胃腸消化吸收。

中醫(yī)古籍記載“中焦受氣取汁，變化而赤，是謂血”，當(dāng)中焦脾胃虛弱時(shí)，則不能運(yùn)化水谷精微，血液化源不足，導(dǎo)致出現(xiàn)如貧血、口色淡白等血虛之癥。機(jī)體血液中RBC、Hb水平可作為評價(jià)脾虛證的穩(wěn)定性指標(biāo)[19]。本研究表明，脾虛證家兔血液中RBC和Hb水平有降低的趨勢，與曹立亭等[20]研究報(bào)道結(jié)果基本一致；而不同黨參炮制四君子湯均能提高血液中RBC和Hb水平。血液中RBC的增加是貧血恢復(fù)的指征，說明不同黨參炮制四君子湯均發(fā)揮了補(bǔ)脾益氣的效果。血紅蛋白水平的增高是機(jī)體免疫力提高的表現(xiàn)[21]，提示不同黨參炮制四君子湯均能增強(qiáng)脾虛動(dòng)物的免疫功能。

“四季脾旺不受邪”的論述亦表明脾虛證動(dòng)物的免疫功能低下[22]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，脾臟的免疫功能與體液免疫和細(xì)胞免疫有一定相關(guān)性，且還與多種細(xì)胞因子相關(guān)[23]。IL-2、IFN-γ和IL-4等免疫因子可由活化的T淋巴細(xì)胞分泌，參與機(jī)體廣泛的免疫調(diào)節(jié)。IL-2能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞活性；IFN-γ能上調(diào)MHC分子表達(dá)，增強(qiáng)抗原呈遞能力；IL-4能促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖以及產(chǎn)生抗體[24]。研究認(rèn)為，脾虛證動(dòng)物免疫功能低下主要是以細(xì)胞免疫因子的活性降低和紊亂為主[4]。本研究表明，脾虛證家兔血清中IL-2、IFN-γ水平顯著降低，IL-4水平顯著升高，說明脾虛證家兔免疫功能出現(xiàn)紊亂，導(dǎo)致IL-2、IFN-γ、IL-4水平異常變化，與文獻(xiàn)[25]結(jié)果一致。不同黨參炮制四君子湯均能提高家兔血清中IL-2、IFN-γ水平，降低IL-4水平，推測不同黨參炮制四君子湯可能通過調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞活性，增強(qiáng)脾虛證動(dòng)物免疫功能。

環(huán)磷酸腺苷蛋白激酶(cyclic adenosine monophosphate-protein kinase A,cAMP-PKA)信號傳導(dǎo)通路是物質(zhì)能量代謝的主要細(xì)胞傳導(dǎo)通路，該通路的激活為細(xì)胞代謝輸送能量。研究表明，cAMP-PKA通路在脾虛證的過程中被激活[26]。有學(xué)者認(rèn)為cAMP/cGMP在細(xì)胞代謝及免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，cAMP/cGMP的比值升高利于機(jī)體免疫功能增強(qiáng)；且兩者具有明顯的拮抗性，與陰陽對立、消長十分相似[27]。魏彥明等[6]認(rèn)為，cAMP/cGMP具有免疫調(diào)節(jié)作用，當(dāng)cAMP升高而cGMP降低時(shí)，巨噬細(xì)胞的功能最強(qiáng)；cAMP還能增強(qiáng)干擾素的活性。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，脾虛證家兔血清中cAMP水平和cAMP/cGMP比值顯著降低，而cGMP的水平顯著升高，與文獻(xiàn)[28]結(jié)果一致。推測脾虛動(dòng)物因cAMP、cGMP分泌紊亂，導(dǎo)致了水谷運(yùn)化不暢，細(xì)胞能量轉(zhuǎn)化受阻，免疫功能降低。經(jīng)不同黨參炮制四君子湯治療后，脾虛家兔血清中cAMP水平和cAMP/cGMP比值均顯著升高，cGMP的水平降低，cAMP、cGMP水平趨于平衡，說明不同黨參炮制四君子湯均能通過調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路來增強(qiáng)免疫，達(dá)到陰平陽秘的作用。