郭盼盼，閆 妍，張軍芳，金 鑫，李香子，嚴昌國*，尹云厚

(1.延邊大學 農學院，吉林 延吉 133000;2.貴州民族大學，貴州 貴陽 550025)

延邊黃牛是我國五大地方優(yōu)良品種之一，是我國畜禽品種基因庫中一份極其珍貴的“財富”，經過長期的自然選擇和人工選擇，已形成了適應性強、屠宰率高、肉質優(yōu)良等特點，具有生產高檔牛肉的優(yōu)秀潛力，但其優(yōu)良肉質性狀形成的具體調控機制仍不是很明確。目前，畜牧學研究者比較重視肌內脂肪的研究，因為動物肉品質的好壞與肌內脂肪含量的高低顯著相關[1]，而較低的肌內脂肪(大理石花紋)仍是提高延邊黃牛牛肉品質的挑戰(zhàn)。而且，在外來商業(yè)肉牛的競爭下，延邊黃牛的經濟價值也因其胴體中較低的肌內脂肪(大理石紋)含量而嚴重降低。因此，提高肌內脂肪含量便成為改善肉類品質的關鍵，而脂肪生成分子機制研究可為改善肉質提供寶貴的信息。

肌內脂肪的沉積涉及一個連續(xù)的過程鏈，包括前脂肪細胞的增殖、分化和成熟[2]。胰島素是調控機體能量代謝的主要激素之一，可以顯著提高脂肪細胞分化標志基因FAS和ACC1的表達，有效促進前體脂肪細胞的分化[3-4]，且存在明顯的劑量-效應關系。過氧化物酶體增殖物激活受體-PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)是調控脂肪細胞形成、脂肪組織發(fā)育和維持成熟脂肪細胞功能的關鍵調控因子，而環(huán)格列酮(ciglitazone)是PPARγ主要的激活劑之一，可通過激活PPARγ基因從而有效促進脂肪生成相關基因的表達[5-6]。單不飽和脂肪酸是前脂肪細胞增殖與分化過程重要的調控因子。其中油酸就是比其他長鏈脂肪酸更能充分誘導脂肪生成的一種重要的單不飽和脂肪酸(MUFA)，不但可以從牛的胃腸道吸收，還可以通過內源性生成[7-8]。而且油酸作為PPARγ的天然配體，可促進PPARγ向細胞核內的轉位，調節(jié)下游基因的表達[9]。

此前，我們已經確定了胰島素、油酸和環(huán)格列酮三者對延邊黃牛前脂肪細胞分化中主要基因表達的影響，為了繼續(xù)研究三者在調控前脂肪細胞分化機制中的作用，本試驗以延邊黃牛為研究對象，利用膠原酶消化法，在無菌條件下分離獲得延邊黃牛前脂肪細胞并建立體外培養(yǎng)體系，通過油紅O染色和實時熒光定量PCR技術比較分析胰島素和PPARγ激動因子對脂肪細胞分化過程中相關基因表達及脂滴生成情況的影響。試驗材料雖然是采集延邊黃牛皮下脂肪組織的前脂肪細胞，但目標是為了更好地了解調節(jié)脂肪生成的因素，以便將所發(fā)現應用于肌內脂肪細胞的發(fā)育研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑FBS、PBS、DMEM、青鏈霉素混合液(雙抗)、胰蛋白酶、TRIzol Reagent、環(huán)格列酮、油酸、油紅O染色試劑盒、甘油三酯試劑盒均購自長春朝陽區(qū)邁希試劑耗材經銷處；GAPDH、PPARγ、SCD、SREBP1、LPL、C/EBPβ引物購自英濰捷基(上海)貿易有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 培養(yǎng)液的配置基礎培養(yǎng)液：DMEM+10% FBS+1% PS(2.5 mg/L兩性霉素+50 mg/L慶大霉素)；分化培養(yǎng)液:DMEM+5% FBS+1% PS(2.5 mg/L 兩性霉素+50 mg/L慶大霉素)；凍存液:DMEM+10% DMSO+10% FBS；清洗液:1% PS+PBS+二酶(2.5 mg/L兩性霉素+50 mg/L慶大霉素)；消化液:DMEM+1% PS+2 g/L膠原酶(collagenase)+1% BSA。

1.3 原代脂肪細胞的分離培養(yǎng)從延邊黃牛皮下脂肪組織中提取原代脂肪細胞。取樣部位先用75%乙醇清洗，然后用無菌的手術刀小心取下100 g脂肪組織，用清洗液清洗2～3次后立即轉移到細胞培養(yǎng)室。

將取回的脂肪組織放置于滅菌的培養(yǎng)皿中，用清洗液清洗4～5次，用無菌鉗和剪刀去除血管和筋膜等，并將其剪碎，再用膠原酶進行酶消化，并在37℃水浴中持續(xù)1 h。每隔5 min振蕩1次，以保證充分消化，用等體積的培養(yǎng)液中和該消化混合物后，使用100 μm的細胞篩過濾。將過濾后的濾液1 500 r/min 離心10 min，去上清液，加入10 mL PBS清洗細胞顆粒，用70 μm細胞篩再次過濾，1 500 r/min 離心10 min，去除上清。最后將細胞懸浮于培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔48 h用PBS沖洗3次，以去除碎屑和游離漂浮細胞后更換培養(yǎng)液。

1.4 傳代培養(yǎng)及分化處理待細胞增殖到培養(yǎng)皿底面的70%～80% 時，吸出培養(yǎng)液，用PBS清洗2～3次，加入2 mL 0.25%的胰蛋白酶，放入37℃ 恒溫培養(yǎng)箱中消化2～3 min，加2 mL的基礎培養(yǎng)液終止消化。將細胞懸液轉移到離心管中， 1 500 r/min， 離心5 min，棄上清，再次用基礎培養(yǎng)液懸浮細胞后傳代至新的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)進行培養(yǎng)。

待細胞增殖到70%～80%后進行不同的分化處理。CON組：10 mg/L胰島素；IC組：10 mg/L胰島素+10 mg/L環(huán)格列酮；IO組：10 mg/L胰島素+100 μmol/L油酸；ICO組：10 mg/L胰島素+10 mg/L 環(huán)格列酮+100 μmol/L 油酸。每個處理重復3次，置于 37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h換1次分化培養(yǎng)液，分化處理96 h后，進行后續(xù)試驗。以上操作均在無菌條件下進行。

1.5 油紅O染色參照油紅O染色試劑盒(G1262)進行，用PBS緩沖液沖洗細胞2～3次后，用細胞色素固定劑在室溫條件下將其固定30 min，再使用PBS緩沖液沖洗1次，60%異丙醇清洗 20～30 s后，涂上油紅O染色(工作液)，在室溫下密閉染色 10～15 min，再加入60%異丙醇洗去染液，用PBS緩沖液沖洗2～3次，加入Mayer蘇木素染色液復染核 1～2 min，加 ORO Buffer處理 1 min，鏡檢采集細胞圖像，觀察脂質滴。

1.6 甘油三酯含量的測定使用普利來甘油三酯測定試劑盒進行甘油三酯含量的測定。用PBS清洗細胞2次，2 mL胰蛋白酶消化2～3 min后，加入同等體積的培養(yǎng)液終止消化，移液槍反復吹打制成細胞懸液，1 500 r/min，離心5 min，棄上清，反復2次，加入200 μL裂解液充分混勻，室溫條件下靜止10 min，使細胞中甘油三酯完全釋放于裂解液中，70℃金屬浴中10 min，2 000 r/min離心5 min并吸取上清。將10 μL待測樣品(每個樣品3個重復)和190 μL工作液加入到96孔板中，放置于37℃培養(yǎng)箱中孵育10 min，之后使用酶標儀在570 nm波長下測定吸光值，再根據標準曲線計算甘油三酯含量。

標準液濃度：0,200,400,600,800,1 000,1 200 mmol/L，酶標儀于570 nm波長下測定吸光值并繪制標準曲線。

1.7 相關基因mRNA表達量檢測用TRIzolTM試劑從細胞中提取總RNA,通過D260和D260/D280檢查提取總RNA的完整性。用TRIzol法提取各試驗組脂肪細胞總RNA，cDNA的構建參照TaKaRa的反轉錄試劑盒進行。GAPDH作為內參基因,引物序列參照表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 實時熒光定量PCR引物信息

PCR反應條件為：95℃條件下預變性 15 s，95℃變性 5 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。

1.8 統(tǒng)計分析使用 2-△△Ct計算相對mRNA表達量,利用Graph Pad Prism 6.0軟件進行數據分析與作圖，差異在P<0.05處有統(tǒng)計學意義，作為差異顯著性判斷標準。

2 結果

2.1 延邊黃牛前脂肪細胞生長趨勢應用MTS比色法每隔24 h測定1次490 nm的吸光值，每次取3個孔分別進行測定并繪制延邊黃牛前脂肪細胞生長曲線圖。由圖1可見，延邊黃牛前脂肪細胞具備穩(wěn)定的生長特性，培養(yǎng)2～6 d，細胞活力顯著增強，進入指數生長期，6～10 d細胞的增殖速度明顯減慢，進入平臺期，之后逐漸退出細胞增殖周期，因此可用于后續(xù)試驗。

圖1 延邊黃牛前脂肪細胞生長曲線

細胞進行體外培養(yǎng)，將消化酶處理后的細胞懸液接種到新的培養(yǎng)皿，細胞縮成小圓球形(圖2A),培養(yǎng)1 d后，有部分呈不規(guī)則三角形的細胞已經貼壁(圖2B)，之后的培養(yǎng)過程中，貼壁細胞逐步開始伸展變形,最后形成了均一、完整的單室脂肪細胞，大多數呈狹長梭形的成纖維樣細胞形態(tài)(圖2C)。繼續(xù)培養(yǎng)延邊黃牛前脂肪細胞，細胞增殖速度相對減緩，且細胞增殖到80%以上，準備開始進入分化階段(圖2D)。

A.復蘇0 h的細胞懸濁液,含有雜質細胞及肌肉組織碎片;B.培養(yǎng)1 d后細胞開始貼壁生長,呈長梭型;C.細胞進入快速生長期,大量增殖;D.細胞增殖到80%

2.2 不同處理對延邊黃牛前脂肪細胞脂滴形成及甘油三酯含量的影響油紅O染色結果(圖3)顯示，在分化處理96 h后，與對照組相比，各試驗組均有脂滴形成，IC組只有少量脂滴形成，而IO和ICO組形成的脂滴數量較多，且脂滴形態(tài)較大，說明胰島素和油酸共同處理可有效促進延邊黃牛前脂肪細胞脂滴的形成。

A.對照組(CON)組；B.IC組；C.IO組；D.ICO組

由圖4可知，與對照組相比，各試驗組均可提高甘油三酯含量，其中IO和ICO組顯著高于對照組和IC組(P<0.05)，且ICO組含量最高。

注：組間標注不同小寫字母示差異顯著，P<0.05。下同

2.3 不同處理對延邊黃牛前脂肪細胞分化相關基因表達的影響由圖5可知，各試驗組間PPARγ基因的mRNA表達量差異顯著(P<0.05)，與對照組相比，IC和ICO試驗組顯著高于對照組(P<0.05)，IO組與對照組間差異不顯著(P>0.05)。IC和ICO組SCD基因mRNA表達量高于對照組，其中IC組與對照組間差異顯著(P<0.05)，而IO組SCD基因mRNA的表達量最低。各試驗組間LPL基因mRNA表達量具有顯著性差異(P<0.05)，與對照組相比，IC和ICO組顯著上調LPL基因的mRNA表達量(P<0.05)，而IO組卻顯著下調了LPL基因的mRNA表達量(P<0.05)。相比于對照組，各試驗組均顯著提高了C/EBPβ基因mRNA表達量(P<0.05)，其中IO組表達量最高。胰島素分別與環(huán)格列酮和油酸處理，可明顯增加SREBP1基因的mRNA表達量，且顯著高于對照組和ICO組(P<0.05)，而相比于對照組，ICO組卻降低了該基因的表達量，但差異不顯著(P>0.05)。

圖5 PPARγ、SCD、 LPL、CEBP/β和SREBP1基因mRNA相對表達量

3 討 論

目前細胞增殖的研究方法比較多，MTS比色法是改良的MTT比色法，與 MTT 或 INT 法相比，對細胞毒性更小，步驟更為簡便[10-11]。所以本試驗延邊黃牛前脂肪細胞生長曲線的檢測采用MTS比色法，以期反映細胞生長的基本規(guī)律。研究表明，前脂肪細胞生長曲線劃分為潛伏期、指數生長期、平臺期以及退化衰亡期[12]。本試驗檢測結果顯示，培養(yǎng)2～6 d，細胞活力顯著增強，進入指數生長期；6～10 d 脂肪細胞進入平臺期，增殖速度明顯減慢。本試驗沒有出現潛伏期和衰亡期，這可能是由于測定時間點較少而導致的。培養(yǎng)8 d后細胞生長速度并未出現明顯減緩，這可能是由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分依然滿足高密度細胞的生長，細胞競爭性生長還未出現，所以細胞沒有出現凋亡的現象。

細胞主要是以甘油三酯和膽固醇酯的形式來儲存多余的能量[13]。油紅O為脂溶性染料，可高度溶解于脂肪內，使組織內甘油三酯等中性脂肪著色。前期試驗研究結果顯示，環(huán)格列酮和油酸單獨處理均可促進脂滴的形成，而環(huán)格列酮和油酸共同處理，脂滴數量肉眼判斷雖不如環(huán)格列酮組和油酸組多，但脂滴大小卻明顯大于環(huán)格列酮組和油酸組,而胰島素單獨處理卻不能促進脂滴的形成[5,20,22]，這與本試驗研究結果一致。本試驗中，在與前期試驗條件相一致的條件下，胰島素、油酸和環(huán)格列酮三者共處理組無論是脂滴的數量還是大小均優(yōu)于其他試驗組，這說明胰島素的添加，可提高油酸和環(huán)格列酮共處理本身對脂滴形成的影響效果。本試驗油紅O染色結果與甘油三酯結果相一致。

胰島β細胞分泌的內分泌激素——胰島素，在機體的血糖調節(jié)、能量代謝及細胞增殖、細胞分化等多個方面扮演重要角色[14-16]。在脂肪細胞中，胰島素是調節(jié)脂肪形成的主要激素，在抑制脂肪分解的同時，可誘導血液中脂肪的生成和對脂肪酸的攝取[3,17]。GUO等[18]研究發(fā)現胰島素可通過與前脂肪細胞膜表面的 IR 結合，激活PPARγ2 促進脂肪細胞的分化。FARMER等[19]發(fā)現胰島素信號通路在胰島素及cAMP激活劑的誘導刺激下，可促進多個成脂轉錄相關因子SREBP-1c、C/EBPβ、C/EBPα和PPARγ2 的表達。金鑫等[20]研究結果表明,胰島素處理牛的前脂肪細胞，雖不能促進脂滴的形成，但可顯著提高PPARγ基因的表達量。前期試驗表明，與油酸和環(huán)格列酮單獨處理相比較，兩者共同處理并不會顯著促進脂肪生成基因的表達。而本試驗中，胰島素添加后，胰島素與油酸、環(huán)格列酮共處理對PPARγ基因表達的促進作用卻明顯高于胰島素分別與油酸和環(huán)格列酮共處理對其的影響，這可能是由于胰島素促進了油酸和環(huán)格列酮的疊加使用導致的PPARγ信號通路上某些基因的表達。

游離脂肪酸是甘油三酯的重要組成成分,盡管其在血液中濃度很低,但卻是脂類代謝中最活躍的部分。大量研究結果表明游離脂肪酸能夠促進脂肪前體細胞的分化。GARCIA等[21]研究發(fā)現來源于牛飼料的不飽和脂肪酸和類胡蘿卜素能夠提高PPARγ的表達，是PPARγ的天然活化劑。金鑫等[22]研究發(fā)現油酸不僅對脂滴的形成有著明顯的促進作用,同時還顯著提高了PPARγ和SREBP1基因的表達量。張軍芳等[23]研究結果表明，添加油酸和棕櫚油酸等不飽和脂肪酸可增加脂肪合成相關基因PPARγ、SREBP1、C/EBPα表達,抑制SCD基因表達。張靖偉等[24]在細胞分化的過程中，用不同濃度(20，40，60 μmol/L)的油酸分別作用細胞3 d，應用油紅O染色和胞內甘油三酯測定法分析發(fā)現油酸可以在體外顯著地促進細胞胞漿中脂質的積累，促進脂肪干細胞成脂分化。宋沙等[25]研究發(fā)現油酸能促進肉牛前脂肪細胞的分化或提高脂肪細胞內的脂肪含量,提高牛肉的大理石紋等級和風味。以上研究結果均表明，油酸可促進相關脂肪生成基因的表達量，從而促進前脂肪細胞的分化。而本試驗中，在油酸處理中添加胰島素以后，在抑制SCD基因表達同時，也抑制了LPL基因的表達，但是卻提高了PPARγ、SREBP1和C/EBPβ基因mRNA的表達量，這與前人研究結果相似，說明胰島素和油酸共處理不會影響油酸本身對前脂肪細胞分化的影響，有可能還會提高促進分化的效果。

PPARγ的特異性配體主要是噻唑烷二酮類化合物，而環(huán)格列酮就屬于噻唑烷二酮類藥物(TZDs)，是PPARγ最主要的激活劑之一，其能夠將PPARγ活化，并提高相關脂肪因子的表達從而提高肌內脂肪沉積水平[26]。飼糧中添加PPARγ激活劑會使豬肌內脂肪含量和大理石紋評分等級顯著提高[27]。本試驗前期研究結果表明環(huán)格列酮單獨處理可提高PPARγ、C/EBPβ和SCD基因的相對表達量。而在本試驗中，環(huán)格列酮和胰島素共處理，均可顯著提高PPARγ、SCD、C/EBPβ、LPL以及SREBP1的表達量，這說明胰島素的添加并沒有抑制環(huán)格列酮對PPARγ的激活效果。

綜上所述，我們推測胰島素和PPARγ激動劑油酸和環(huán)格列酮共處理對延邊黃牛前脂肪細胞分化的促進作用要高于各因素單獨處理或兩兩共同處理的效果，這一研究結果為延邊黃牛脂肪代謝的研究提供一個新視角。但胰島素是如何與環(huán)格列酮和油酸相互作用來調控脂肪細胞成脂分化過程的具體的調控機制有待進一步研究。