武 迪， 張 玲， 吳夢(mèng)棋， 孫柳青， 王 武， 楊海麟

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122）

膽固醇是一種重要的甾醇化合物，可以作為甾體類藥物的原料[1]。 有些微生物可以切除膽固醇飽和側(cè)鏈、氧化甾核特定部位，從而得到多種有藥用價(jià)值的衍生物[2-4]。 利用Mycobacteriumsp.將膽固醇轉(zhuǎn)化為睪酮（TS）[5]；利用 Arthrobacter simplex 降解膽固醇成功生產(chǎn)了雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮（ADD）[6]；利用Rhodococcussp.將膽固醇轉(zhuǎn)化為膽甾-4-烯-3-酮[7]。除上述衍生物外，膽固醇還可被微生物轉(zhuǎn)化為膽甾-4-烯-3，6-二酮[8]。

膽甾-4-烯-3，6-二酮可應(yīng)用于制備治療或預(yù)防神經(jīng)元損傷藥物[9]，亦可用于制造脂質(zhì)代謝改善劑、飲食品和動(dòng)物飼料[10]，比膽甾-4-烯-3-酮具有更高的醫(yī)藥用價(jià)值。膽甾-4-烯-3，6-二酮可通過(guò)化學(xué)方法合成[11]，但化學(xué)合成法需使用大量強(qiáng)氧化劑且反應(yīng)條件劇烈，也可通過(guò)微生物的甾體轉(zhuǎn)化獲得膽甾-4-烯-3，6-二酮。目前微生物轉(zhuǎn)化甾醇獲得膽甾-4-烯-3-酮的報(bào)道較多[12-14]，但獲得膽甾-4-烯-3，6-二酮的報(bào)道較少。

底物膽固醇為疏水性有機(jī)化合物，不利于與轉(zhuǎn)化體系中細(xì)胞的接觸和反應(yīng)， 降低了產(chǎn)物的得率。可將膽固醇用有機(jī)溶劑溶解后加入轉(zhuǎn)化體系來(lái)解決這一問(wèn)題[8]，但有機(jī)溶劑易揮發(fā)、易燃易爆、污染環(huán)境、對(duì)菌體的生長(zhǎng)毒害較大，且操作者長(zhǎng)時(shí)間暴露于有機(jī)溶劑環(huán)境中，會(huì)對(duì)其神經(jīng)系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)造成損傷。 因此，可探索選取更環(huán)保廉價(jià)的促溶劑。

環(huán)糊精（cyclodextrin，簡(jiǎn)稱CD）具有截頂圓錐狀空腔結(jié)構(gòu)，內(nèi)腔疏水，外壁親水。 對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾，可以得到一系列具有修飾基團(tuán)的環(huán)糊精衍生物，它們可與疏水性物質(zhì)形成包結(jié)絡(luò)合物，促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。 在甾體的轉(zhuǎn)化反應(yīng)中應(yīng)用環(huán)糊精及其衍生物具有成功的案例[15-18]。向Saccharomyces cerevisiae轉(zhuǎn)化雄烯二酮 （AD） 的體系中添加 α-環(huán)糊精（α-CD） 可使其轉(zhuǎn)化率提高 44.44%[19]； 利用Nocardioides simplex轉(zhuǎn)化 AD 生成 ADD 的過(guò)程中，添加 β-環(huán)糊精（β-CD）使產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率達(dá) 25%[20]；在β-CD 存在下，Rhizopus nigricans對(duì)孕酮的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)速度幾乎提高了兩倍[21]。然而，在甾體生物轉(zhuǎn)化體系中應(yīng)用環(huán)糊精促溶獲得膽甾-4-烯-3，6-二酮的研究目前尚未有報(bào)道。

作者前期篩選鑒定獲得了一株能夠轉(zhuǎn)化膽固醇的Burkholderia cepaciaZWS15（B. cepacia，保藏編號(hào)為 CCTCC NO：M2017661）， 從B.cepacia轉(zhuǎn)化膽固醇的體系中分離并鑒定出膽甾-4-烯-3，6-二酮， 考察環(huán)糊精種類和添加摩爾比對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的影響。 選取最優(yōu)的環(huán)糊精種類，考察其對(duì)膽固醇官能團(tuán)的包埋效果，以期為環(huán)糊精在生物轉(zhuǎn)化膽固醇合成膽甾-4-烯-3，6-二酮的工業(yè)應(yīng)用提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Burkholderia cepaciaZWS15（CCTCC M2017661）由作者所在實(shí)驗(yàn)室前期篩選并鑒定。 固體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10，瓊脂粉 20；種子培養(yǎng)基（LB 培養(yǎng)基，g/L）：蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10； 發(fā)酵培養(yǎng)基 （g/L）： 蔗糖 5， 酵母粉 15，NaNO32，K2HPO4·3H2O 2，KCl 0.5，MgCl21.35，MnCl20.01，CaCl20.055，MgSO41，膽固醇 2（即 5.18 mmol/L）；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基（g/L）：環(huán)糊精具體添加量不同，其余同發(fā)酵培養(yǎng)基。 α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精、 甲基-β-環(huán)糊精、 羥乙基-β-環(huán)糊精、2-羥丙基-β-環(huán)糊精、膽固醇、乙酸乙酯、異丙醇、乙腈：均購(gòu)于國(guó)藥公司；硅膠板（GF254）：購(gòu)于煙臺(tái)新諾化工有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 取在-40 ℃甘油管保存的B.cepaciaZWS15，于固體培養(yǎng)基劃線分離，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24~26 h， 挑取單菌落接種于50 mL LB 液體培養(yǎng)基中，于 37 ℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)12 h，即為處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的種子液[22]。

1.2.2 羥乙基-β-環(huán)糊精-膽固醇包合物的制備稱取羥乙基-β-環(huán)糊精與膽固醇，使其摩爾比為2∶1。 將羥乙基-β-環(huán)糊精與膽固醇置于盛有 10 mL轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的50 mL 離心管中，使用超聲細(xì)胞破碎儀進(jìn)行超聲乳化，功率400 W，工作時(shí)間2 s，間歇時(shí)間 2 s，超聲乳化15 min。

1.2.3Burkholderia cepacia生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化膽固醇將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的種子液按體積分?jǐn)?shù)5%接種到裝有10 mL 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的50 mL 搖瓶中。轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中含2 g/L 膽固醇， 環(huán)糊精與膽固醇的摩爾比為1∶1。將搖瓶置于 30 ℃、200 r/min 全溫?fù)u床柜中培養(yǎng)2 d，通過(guò)煮沸或直接用乙酸乙酯萃取終止轉(zhuǎn)化。

1.2.4 薄層層析分離提取轉(zhuǎn)化產(chǎn)物 采用萃取法提取產(chǎn)物。用2 倍體積乙酸乙酯與轉(zhuǎn)化液混合，200 r/min 搖床中振蕩 10 min，6 000 r/min 離心 10 min，取上層乙酸乙酯。重復(fù)上述步驟，合并有機(jī)相。經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮有機(jī)相，用GF254 硅膠板（20 cm×20 cm，1.5~2 mm）分離產(chǎn)物，以V正己烷∶V無(wú)水乙醚＝2∶3 作為展開(kāi)劑。

1.2.5 質(zhì)譜、核磁和紅外光譜鑒定產(chǎn)物結(jié)構(gòu) 質(zhì)譜分析（LC-MS）檢測(cè)產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量（沃特世質(zhì)譜儀 MALDI SYNAPT MS）； 核磁共振碳譜 （13CNMR）、核磁共振氫譜（1H-NMR）測(cè)定產(chǎn)物碳和質(zhì)子的信號(hào) （布魯克核磁共振波譜儀Aduance Ⅲ 400 MHZ）， 溫度 25 ℃， 溶劑 CDCl3， 以四甲基硅烷（TMS）作為內(nèi)標(biāo)；傅立葉變換紅外光譜儀（FT-IR）檢測(cè)產(chǎn)物的官能團(tuán) （賽默飛紅外光譜儀Nicolet is10）。 為進(jìn)一步確認(rèn)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，除對(duì)測(cè)得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析外， 還將獲得的數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻(xiàn)和National Institute of Advanced Industrial Science and Technology 數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息進(jìn)行比對(duì)。

1.2.6 高效液相對(duì)產(chǎn)物定量分析 用高效液相色譜法 （HPLC） 定量分析產(chǎn)物。 色譜柱為 ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），V乙腈∶V異丙醇＝90∶10 作為流動(dòng)相，流量 0.8 mL/min，進(jìn)樣量 10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)249 nm，柱溫30 ℃，每批次做3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

取分離鑒定后的純產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品。 用異丙醇溶解產(chǎn)物，配制成不同濃度梯度的溶液，0.45 μm 有機(jī)膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC 測(cè)定。 以產(chǎn)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)做曲線，所得即為產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)曲線。

根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算產(chǎn)物產(chǎn)量，根據(jù)下式計(jì)算產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率[23]：

式中：c1為產(chǎn)物質(zhì)量濃度，mg/mL；c2為底物初始質(zhì)量濃度，mg/mL；M1為產(chǎn)物摩爾質(zhì)量，g/mol；M2為底物摩爾質(zhì)量，g/mol。

2 結(jié)果與討論

2.1 B. cepacia 轉(zhuǎn)化膽固醇的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定

菌株在LB 培養(yǎng)基活化后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在200 r/min、30 ℃全溫?fù)u瓶柜中培養(yǎng)2 d， 按1.2.4中方法分離純化其中一種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。

利用 LC-MS、FT-IR、NMR 等技術(shù)對(duì)該物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量、官能團(tuán)、C 及質(zhì)子信號(hào)等結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行了鑒定。 經(jīng)LC-MS 檢測(cè)該產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量為398.4。

圖 1 為該物質(zhì)的紅外光譜圖，1 700.32 和1 682.67 cm-1、1 603.52 cm-1的吸收峰分別是—C=O、—C=C—的伸縮振動(dòng)吸收峰，表明該物質(zhì)中含有兩個(gè)—C=O 和一個(gè)—C=C—， 推測(cè)其分子式為C27H42O2。 在誤差范圍內(nèi)，這與 Hunter AC 等報(bào)道的膽甾-4-烯-3，6-二酮紅外光譜信息一致[24]。

圖1 膽固醇轉(zhuǎn)化產(chǎn)物紅外光譜分析Fig. 1 FT-IR analysis of cholesterol conversion product

通過(guò)13C-NMR 測(cè)定不同位碳的化學(xué)位移（δ），確認(rèn)該產(chǎn)物酮基的數(shù)量和位置， 見(jiàn)圖 2（a），13C-NMR（101 MHz，Chloroform-d）信息詳見(jiàn)表 1。 其中δ 202.31 與δ 199.69 是酮基的特征吸收峰，表示C6 和 C3 位為酮基。 δ 161.07 和 δ 125.44 是碳碳雙鍵的特征吸收峰， 雙鍵位于C4 和C5 之間。 這與Hunter AC 等報(bào)道的膽甾-4-烯-3，6-二酮核磁共振碳譜信息一致[24]。

表1 鑒定產(chǎn)物與膽甾-4-烯-3，6-二酮13C-NMR 譜對(duì)比Table 1 Comparison of 13C-NMR spectrum of the product identified here with that of cholest-4-ene-3，6-dione

通過(guò)1H-NMR 譜測(cè)定該產(chǎn)物氫原子總數(shù)及特定位的質(zhì)子信號(hào)，見(jiàn)圖 2（b）。 δ 7.07 為 CDCl3特征吸收峰。δ 6.17 為單峰，是C4 位上的一個(gè)H，以該峰為標(biāo)峰， 對(duì)譜圖積分， 氫原子總數(shù)為42。1H-NMR（400 MHz，Chloroform-d） 信息見(jiàn)表 2。 在誤差范圍內(nèi)， 與 CUI JG 等報(bào)道的膽甾-4-烯-3，6-二酮核磁共振氫譜一致[25]。

圖2 膽固醇轉(zhuǎn)化產(chǎn)物核磁共振波譜Fig. 2 NMR spectra of cholesterol conversion product

表2 鑒定產(chǎn)物與膽甾-4-烯-3，6-二酮1H-NMR 譜的對(duì)比Table 2 Comparison of 1H-NMR spectrum of the product identified here with that of cholest-4-ene-3，6-dione

續(xù)表2

綜上所述，在誤差范圍內(nèi)，該產(chǎn)物質(zhì)譜、紅外光譜、 核磁共振波譜信息鑒定該物質(zhì)為膽甾-4-烯-3，6-二酮，見(jiàn)圖 3。

圖3 B. cepacia 轉(zhuǎn)化膽固醇生成膽甾-4-烯-3,6-二酮Fig. 3 Biotransfomation of cholesterol to cholest-4-ene-3,6-dione by B. cepacia

對(duì)比類似酮基產(chǎn)物的基本結(jié)構(gòu)信息見(jiàn)表3，進(jìn)一步確定Burkholderia cepaciaZWS15 轉(zhuǎn)化膽固醇的產(chǎn)物為膽甾-4-烯-3，6-二酮，而不是目前報(bào)道較多的膽甾-4-烯-3-酮。

表3 分離產(chǎn)物與膽甾-4-烯-3-酮的結(jié)構(gòu)信息對(duì)比Table 3 Comparison of structural information between the isolated product of this study and cholest-4-en-3-one

2.2 不同種類環(huán)糊精對(duì)膽甾-4-烯-3，6-二酮產(chǎn)率的影響

由于環(huán)糊精及其衍生物具有內(nèi)腔疏水，外壁親水的特性，且在生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中環(huán)糊精僅對(duì)細(xì)胞的形態(tài)造成小幅度影響而不至于使其凋亡，提高了菌體細(xì)胞的通透性，有助于生物轉(zhuǎn)化的進(jìn)行[27]。故選取α-環(huán)糊精（α-CD）、β-環(huán)糊精（β-CD）、γ-環(huán)糊精（γ-CD）、甲基-β-環(huán)糊精（M-β-CD）、羥乙基-β-環(huán)糊精（HE-β-CD）、羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD）分別加入B. cepacia轉(zhuǎn)化膽固醇的體系中，考察對(duì)膽甾-4-烯-3，6-二酮產(chǎn)率的影響。

在轉(zhuǎn)化過(guò)程中恒定膽固醇的初始添加量為2 g/L（即 5.18 mmol/L）。 按環(huán)糊精與膽固醇摩爾比 1∶1 向轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中添加環(huán)糊精并轉(zhuǎn)化2 d， 環(huán)糊精及膽固醇預(yù)先使用60 W 超聲波乳化15 min。

不同種類環(huán)糊精及衍生物對(duì)膽甾-4-烯-3，6-二酮轉(zhuǎn)化率的影響見(jiàn)圖4（a）。由于膽固醇的低水溶度，不添加任何環(huán)糊精時(shí)，膽甾-4-烯-3，6-二酮的轉(zhuǎn)化率僅為 0.2%。添加 M-β-CD、HE-β-CD 的實(shí)驗(yàn)組，膽甾-4-烯-3，6-二酮轉(zhuǎn)化率大幅提高，分別為對(duì)照組的 27.55 倍和 37.95 倍。 在 α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD 存在下，膽甾-4-烯-3，6-二酮的轉(zhuǎn)化率約為對(duì)照組的1.75~3.95 倍。

進(jìn)一步考察了HE-β-CD 添加量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖 4（b）。 當(dāng) HE-β-CD 與膽固醇摩爾比為 2∶1 時(shí)，膽甾-4-烯-3，6-二酮轉(zhuǎn)化率為 12.1%，比HE-β-CD 與膽固醇摩爾比為1∶1 的轉(zhuǎn)化率提高了59.42%。

圖4 環(huán)糊精對(duì)膽甾-4-烯-3，6-二酮轉(zhuǎn)化率的影響Fig. 4 Effect of cyclodextrin on the yield of cholest-4-ene-3，6-dione

與對(duì)照組（不添加環(huán)糊精）相比，所選的環(huán)糊精均能促進(jìn)膽甾-4-烯-3，6-二酮的生成，表明這幾種環(huán)糊精對(duì)膽固醇都有不同程度的包被[28-29]。 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率最高的為添加羥乙基-β-環(huán)糊精 （HE-β-CD）組。 當(dāng) HE-β-CD 與膽固醇的摩爾比為 2∶1 時(shí)，產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率不僅是對(duì)照組（不添加環(huán)糊精）的60 倍，還比HE-β-CD 與膽固醇的摩爾比為1∶1 組的轉(zhuǎn)化率提高了59.42%。 與其他環(huán)糊精相比，羥乙基-β-環(huán)糊精（HE-β-CD）可能更有效包被了膽固醇的官能團(tuán)，提高了與細(xì)菌細(xì)胞的接觸效率，從而提高了產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。

2.3 紅外光譜檢測(cè)羥乙基-β-環(huán)糊精對(duì)膽固醇官能團(tuán)的包埋

為了進(jìn)一步表征HE-β-CD 對(duì)膽固醇官能團(tuán)或部位的包埋情況，分別對(duì)膽固醇、HE-β-CD-膽固醇包合物（摩爾比為 2∶1）和 HE-β-CD 進(jìn)行紅外光譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 紅外光譜分析羥乙基-β-環(huán)糊精包埋膽固醇效果Fig. 5 FT-IR spectra of HE-β-CD-embedded cholesterol

3 423.79 cm-1為膽固醇C3 位羥基伸縮振動(dòng)吸收峰，在HE-β-CD/膽固醇包合物的紅外譜圖中，羥基伸縮振動(dòng)吸收峰依然存在， 這說(shuō)明羥基沒(méi)有被HE-β-CD 包埋； 而羥基伸縮振動(dòng)頻率向低頻位移至 3 326.89 cm-1， 表明膽固醇與 HE-β-CD 的羥基之間可能形成了氫鍵。2 930.41、2 900.03、2 865.82、2 848.71 cm-1為飽和烴的C—H 伸縮振動(dòng)吸收峰，在HE-β-CD/膽固醇包合物中， 這些吸收峰的強(qiáng)度明顯減弱，說(shuō)明膽固醇該處基團(tuán)被HE-β-CD 包結(jié)。膽固醇1 654.38 cm-1碳碳雙鍵吸收峰在HE-β-CD/膽固醇包合物中依然存在， 表明 C5 和C6 間的—C=C—沒(méi)有被包埋， 根據(jù)膽固醇的結(jié)構(gòu)式分析，HE-β-CD 將膽固醇甾核 A 環(huán)包埋。

膽固醇 C26、27 位偕二甲基于 1 463.94、1 376.34 cm-1裂分為雙峰 （1 463.94、1 438.34 cm-1為一個(gè)甲基吸收峰；1 376.34、1 364.71 cm-1為另一個(gè)甲基吸收峰），雙峰信號(hào)在HE-β-CD/膽固醇包合物中幾乎消失， 表明側(cè)鏈的C26、27 位甲基均被HE-β-CD 包埋。

綜合上述，HE-β-CD 與膽固醇的摩爾比為 2∶1時(shí)之所以能夠提高膽甾-4-烯-3，6-二酮的轉(zhuǎn)化率，可能是因?yàn)镠E-β-CD 通過(guò)分子間的非極性共價(jià)鍵對(duì)底物膽固醇甾核的A 環(huán)、側(cè)鏈的C26 和C27 進(jìn)行包被，形成穩(wěn)定的包結(jié)物（見(jiàn)圖6），進(jìn)而提高了膽固醇與菌體的接觸效率[30]。

圖6 羥乙基-β-環(huán)糊精與膽固醇包結(jié)物構(gòu)象示意圖Fig. 6 Schematic diagram of the conformation of hydroxyethyl-β-cyclodextrin and cholesterol inclusion complex

3 結(jié) 語(yǔ)

作者對(duì)Burkholderia cepaciaZWS15 轉(zhuǎn)化膽固醇的產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，通過(guò)LC-MS、FT-IR、NMR等技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，獲得了一種產(chǎn)物膽甾-4-烯-3，6-二酮。

通過(guò)考察 6 種環(huán)糊精 （α-CD、β-CD、γ-CD、M-β-CD、HE-β-CD、HP-β-CD）對(duì)菌體的影響，這幾種環(huán)糊精的添加幾乎不影響菌體的生長(zhǎng)。

向轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中添加與膽固醇摩爾比為1∶1 的環(huán)糊精，發(fā)現(xiàn)添加 α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD 的體系中，膽甾-4-烯-3，6-二酮的轉(zhuǎn)化率約為對(duì)照組的1.75~3.95 倍；添加β-CD 種類的轉(zhuǎn)化體系中，M-β-CD 和HE-β-CD 的效果較好，轉(zhuǎn)化率分別為對(duì)照組的27.55 倍和37.95 倍。

進(jìn)一步考察了HE-β-CD 與底物膽固醇摩爾比對(duì)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化得率的影響， 發(fā)現(xiàn)當(dāng)二者摩爾比為2∶1時(shí)， 膽甾-4-烯-3，6-二酮摩爾轉(zhuǎn)化率為 12.1%，比HE-β-CD 與膽固醇摩爾比為1∶1 的轉(zhuǎn)化率提高了59.42%。

對(duì) 2 mol HE-β-CD 與 1 mol 膽固醇的包合物進(jìn)行紅外光譜分析，結(jié)果表明，膽固醇甾核的A 環(huán)及側(cè)鏈的C26、C27 信號(hào)在包合物中消失，推測(cè)可能是因?yàn)? mol HE-β-CD 可通過(guò)分子間的非極性共價(jià)鍵與1 mol 膽固醇形成了穩(wěn)定的包結(jié)物， 這為HE-β-CD 在生物轉(zhuǎn)化合成膽甾-4-烯-3，6-二酮的工業(yè)應(yīng)用提供了借鑒。