吳 江 ， 洪文榮 ， 蘇 敏 ， 洪曉明

（1. AUCH International Trading Pty Ltd，Sydney，NSW2000，Australia； 2. 莆田學(xué)院， 福建 莆田 351100；3. 重慶能源學(xué)院醫(yī)藥和營養(yǎng)研究中心，重慶 402260）

甲基硒代半胱氨酸 （Se-methylselenocysteine SeMCys）是一種天然含硒的氨基酸。 它是近年來發(fā)現(xiàn)的第21 種氨基酸硒代半胱氨酸的甲基化衍生物[1]。 作為第三代的有機硒化合物，甲基硒代半胱氨酸比硒酵母、硒代蛋氨酸和其他硒代氨基酸具有更好的生物利用度，更強的抗氧化作用[2]，以及更強的抗衰老和抗癌生物活性等優(yōu)點[3-4]。 美國FDA 已經(jīng)批準(zhǔn)了用甲基硒代半胱氨酸作為抗腫瘤化療試劑進行動物和臨床試驗[5]。 試驗結(jié)果表明，甲基硒代半胱氨酸比其他硒化合物在化療輔助治療方面效果更好，同時能更有效消除化療帶來的毒性[6]。 目前的臨床試驗結(jié)果表明，化療時結(jié)合甲基硒代半胱氨酸治療能顯著提高腫瘤細(xì)胞的殺死率[7]。 在中國，甲基硒代半胱氨酸已于2009 年被衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新型營養(yǎng)強化劑[8]，并開始廣泛應(yīng)用于食品和保健品等方面。

甲基硒代半胱氨酸最早從植物中分離得到，生長在富硒地區(qū)的植物具有積聚甲基硒代半胱氨酸的能力，例如大蒜、洋蔥、青花菜[9]、豆科植物[10]、野生的韭菜[11]等植物。 富硒大蒜在提高免疫功能和預(yù)防癌癥方面有一定的效果，將在含硒培養(yǎng)液中培養(yǎng)的大蒜通過HPLC-ICP-MS 分析， 可檢測到其中含有甲基硒代半胱氨酸[12]。1987 年美國FDA 批準(zhǔn)了用硒酵母作為無機硒替代物用于動物飼料添加劑以及保健品[13]，使得硒酵母發(fā)酵的研究和生產(chǎn)進入了新的階段。 其基本原理是在發(fā)酵過程中加入無機硒鹽，酵母在繁殖過程中吸收無機硒轉(zhuǎn)化成為有機硒而存儲在細(xì)胞中成為硒酵母。Schrauzer[14]報道，在酵母發(fā)酵過程中，加入硒鹽使酵母最終積累有機硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)達3 000 μg/g， 其中硒代蛋氨酸和硒代半胱氨酸含量可達總含量的60% 以上。 Rajashree 和Muthukumar[15]報道了用釀酒酵母突變株采用流加發(fā)酵工藝生產(chǎn)硒酵母，最終有機硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到3 758 μg/g，發(fā)酵液中菌體質(zhì)量濃度達到32.09 g/L。但是在利用酵母發(fā)酵生產(chǎn)有機硒的報道中，絕大多數(shù)的硒酵母中含有的有機硒主要成分是硒代蛋氨酸和硒代半胱氨酸的混合物，而這些硒代氨基酸是參與蛋白質(zhì)合成的，因此這些有機硒需要降解后才能被人體吸收代謝。 Mapelli[16]等為了生產(chǎn)價值更高的甲基硒代半胱氨酸，構(gòu)建了能夠高效表達異質(zhì)硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)化酶的工程酵母菌，通過優(yōu)化流加發(fā)酵工藝，使酵母細(xì)胞有機硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到1 061 μg/g， 但其中甲基硒代半胱氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)卻很低，只有 2.6 μg/g。 Klimaszewska[17]等利用真菌Lentinula edodes生產(chǎn)甲基硒代半胱氨酸，通過液體發(fā)酵收獲的菌絲體經(jīng)過萃取后得到120 μg/g 甲基硒代半胱氨酸。 Ogra[18]等通過生物轉(zhuǎn)化的方法闡明了釀酒酵母合成各種有機硒的代謝途徑，分析測定了主要硒代氨基酸的含量，發(fā)現(xiàn)有微量甲基硒代半胱氨酸生成。 至今為止，通過發(fā)酵法生產(chǎn)甲基硒代半胱氨酸的研究鮮有報道。 作者以釀酒酵母突變株XM2-9 為生產(chǎn)菌株，采用雙流加補料發(fā)酵方式解除了Crabtree 效應(yīng)， 使得菌體濃度和葡萄糖的產(chǎn)率大大提高。 同時，以亞硒酸鈉溶液為單獨流加補料，以最佳比硒消耗速率為依據(jù)，有效地控制亞硒酸鈉的流量，使硒轉(zhuǎn)化率大大提高。 最終得到發(fā)酵液的菌體質(zhì)量濃度為35.6 g/L， 細(xì)胞中有機硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到4 937 μg/g， 其中甲基硒代半胱氨酸的產(chǎn)量高達8 189 μg/g。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 釀酒酵母Saccharomyces cerevisiaeXM2-9 突變株，由 AUCH Lab 保藏。

1.1.2 斜面和種子培養(yǎng)基 葡萄糖 20 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，瓊脂15 g/L。種子培養(yǎng)基不加瓊脂，調(diào)至pH 4.5。

1.1.3 分批培養(yǎng)基

1） 低濃度硫培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，氯化銨4 g/L，磷酸二氫鉀3 g/L，七水硫酸鎂 0.05 g/L，氯化鎂0.85 g/L， 加入20 mL 微量元素母液 （氯化鐵 970 mg/L，氯化鋅760 mg/L，鉬酸鈉152 mg/L，氯化鈷70 mg/L，氯化錳 78 mg/L）。 加入 20 mL 維生素母液（生物素10 mg/L，泛酸鈣120 mg/L，維生素B660 mg/L，肌醇 120 mg/L）。

2） 正常硫培養(yǎng)基：其他成分相同，只改變七水硫酸鎂為9.7 g/L。

1.1.4 流加培養(yǎng)基 葡萄糖110 g/L，氯化銨15 g/L，磷酸二氫鉀4.3 g/L，七水硫酸鎂10.2 g/L，微量元素母液40 mL/L，維生素母液40 mL/L。

1.1.5 亞硒酸鈉溶液 亞硒酸鈉（Na2SeO3）20 mg/mL（Sigma-Aldrich）。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵罐及其控制 發(fā)酵罐是New Brunswick BioFlo 610 自動控制發(fā)酵罐，裝液體積30 L。發(fā)酵溫度為35 ℃，溶氧由通氣和攪拌轉(zhuǎn)速來調(diào)節(jié)，通氣量為 0.5~0.7 vvm， 攪拌轉(zhuǎn)速為 200~400 r/min。 溶氧（DO）控制在 1~2 μg/g，pH 通過自動流加 30% 的氨水和2 mol/L 鹽酸來調(diào)節(jié)。

1.2.2 葡萄糖和乙醇質(zhì)量濃度的測定 發(fā)酵液中葡萄糖和乙醇的濃度用HPLC 的方法測定[16]并進行了改進，使用Shimadzu HPLC System，用Supelco 分析柱，流動相使用1 g/L H3PO4，流量為0.7 mL/min，溫度為50 ℃。

1.2.3 硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

1） 酵母細(xì)胞中硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定： 稱取0.5 g干硒酵母粉放入20 mL 試管中，加入5 mL 70% 的濃硝酸混勻。 將試管放入80 ℃烘箱中消化2 h，然后將消化液到入100 mL 容量瓶中， 加入蒸餾水至100 mL。 用原子吸收光譜儀（Perkin Elmer A-Analyst 200）測定，條件是選擇元素硒，波長為196.03 nm。

2） 發(fā)酵液上清液中總硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定：取10 mL 發(fā)酵液，放入離心管中，以5 000 r/min 離心5 min，上清液直接用原子吸收光譜法測定。

3） 發(fā)酵上清液無機硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定：發(fā)酵上清液無機硒按照甲基藍(lán)還原法測定[19]。

1.2.4 菌體濃度測定 取10 mL 發(fā)酵液在5 000 r/min下離心5 min， 去上清液， 用蒸餾水洗滌酵母3 次后，再在5 000 r/min 下離心5 min。 去上清液，將酵母沉淀放入105 ℃烘箱中干燥2 h 至恒質(zhì)量后稱質(zhì)量。

1.2.5 分批發(fā)酵和流加發(fā)酵 分批發(fā)酵：將培養(yǎng)好400 mL 的搖瓶種子接到裝液體積為30 L 的發(fā)酵罐中，pH 4.5、35 ℃自動控制進行發(fā)酵，溶氧控制在1~2 μg/g。

流加發(fā)酵： 在同樣發(fā)酵罐中先加入10 L 分批發(fā)酵培養(yǎng)基，接入種子后，開始分批發(fā)酵。 隨著菌體的生長，發(fā)酵液中殘?zhí)琴|(zhì)量濃度不斷下降至0.1 g/L以下時，開始用流加培養(yǎng)基通入發(fā)酵罐，恒速流加量分別控制在F=0.6、0.8、1 L/h，同時亞硒酸鈉溶液通過蠕動泵加入發(fā)酵罐。 控制發(fā)酵液的殘?zhí)琴|(zhì)量濃度為限制性底物質(zhì)量濃度。

指數(shù)流加發(fā)酵：流加培養(yǎng)基的流加量按照下列公式計算：

式中：F為培養(yǎng)基流加量，L/h；S為發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度，g/L；μ 為比生長速率，h-1；V為發(fā)酵液體積，L；SF為流加培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度，g/L；Yx/s為菌體細(xì)胞對葡萄糖的得率，g/g；（VX）0為流加發(fā)酵的初始細(xì)胞質(zhì)量，g。

1.2.6 酵母細(xì)胞比生長速率的計算

式中：t1和t2分別表示菌體培養(yǎng)對數(shù)生長期時間1和時間 2，min；X1和X2分別表示在t1和t2所對應(yīng)的菌體質(zhì)量濃度，g/L。

1.2.7 抑制性底物對比生長速率的影響 在酵母培養(yǎng)過程中，由于亞硒酸鈉的毒性對于酵母生長有一定的抑制作用，Andrew[21]提出了菌體生長模型，其比生長速率和亞硒酸鈉底物濃度的關(guān)系為：

式中：Ks為飽和常數(shù)，g/L；KIS為抑制常數(shù)，g/L；S為限制性底物質(zhì)量濃度，g/L；SI為抑制性底物質(zhì)量濃度，g/L；μmax為無底物抑制的最大比生長速率。

在亞硒酸鈉存在的情況下， 如果SI>KIS， 則μ<μmax，菌體的比生長速率顯著下降，因此在菌體發(fā)酵過程中培養(yǎng)基中的亞硒酸鈉要控制在最佳的范圍內(nèi)。

1.2.8 亞硒酸鈉溶液流加量 亞硒酸鈉流加量以比硒消耗速率為 0.5 mg/（g·h）為依據(jù)[22]，即

式中：fi為亞硒酸鈉流加量，mL/h；V為發(fā)酵液體積，L；X為發(fā)酵液中菌體質(zhì)量濃度，g/L。

當(dāng)亞硒酸鈉溶液質(zhì)量濃度為20 mg/mL 時，亞硒酸鈉流加量fi= 0.055VX。

2 結(jié)果與討論

2.1 分批發(fā)酵參數(shù)的計算和條件優(yōu)化

2.1.1 初始亞硒酸鈉質(zhì)量濃度對硒酵母生長的影響 當(dāng)葡萄糖初始質(zhì)量濃度為30.2 g/L， 無機硒初始質(zhì)量濃度分別為 0、10.5、30.3、40.2 g/L 時，經(jīng)分批發(fā)酵得到的細(xì)胞生長曲線見圖1。從圖1 可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基中硒質(zhì)量濃度為零時，細(xì)胞生長最快。 隨著初始硒質(zhì)量濃度的增加，菌體的比生長速率逐漸下降，葡萄糖的比消耗速率也逐步下降。 說明無機硒質(zhì)量濃度越高， 對于菌體生長的抑制越明顯，細(xì)胞生長符合Andrew 模型。 但是，由于此突變株對無機硒的抗性作用， 即使在初始硒質(zhì)量濃度達到40 mg/L，細(xì)胞仍然保持一定的比生長速率，表1 為分批發(fā)酵得到的數(shù)據(jù)。

圖1 不同初始亞硒酸鈉質(zhì)量濃度下硒酵母XM2-9 的發(fā)酵過程Fig. 1 Batch fermentation of S.cerevisiae XM2 -9 in glucose medium with different initial selenium concentrations

表1 不同初始硒質(zhì)量濃度下酵母發(fā)酵過程參數(shù)的比較Table 1 Parameters of selenium yeast fermentation with different initialselenium concentrations

實驗數(shù)據(jù)表明， 在不含亞硒酸鈉的培養(yǎng)基中，細(xì)胞的比生長速率最高，達到μ=0.125 h-1；當(dāng)培養(yǎng)基中初始硒質(zhì)量濃度分別為10.5、30.3、40.2 mg/L 時，細(xì)胞的比生長速率分別為 0.123、0.117、0.101 h-1，其比生長速率呈下降趨勢。 同樣地，最終的菌體質(zhì)量濃度也是隨著初始硒質(zhì)量濃度增加而下降。 實驗還表明，隨著初始硒質(zhì)量濃度的增加，最終酵母細(xì)胞中有機硒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也相應(yīng)增加， 它們分別為766、2 265、3 117 μg/g。 這說明該酵母菌具有很強的無機硒轉(zhuǎn)化能力，但是由于分批發(fā)酵后期的營養(yǎng)和無機硒耗盡，菌體出現(xiàn)老化，導(dǎo)致分批發(fā)酵難以實現(xiàn)硒酵母高生產(chǎn)強度和高硒轉(zhuǎn)化率的生產(chǎn)要求。顯然，只有通過其他的發(fā)酵模式才能實現(xiàn)有機硒酵母高產(chǎn)的目標(biāo)。

2.1.2 培養(yǎng)基中硫酸鎂質(zhì)量濃度對硒酵母發(fā)酵的影響 硒和硫在化學(xué)性質(zhì)上具有相似性，但細(xì)胞對硫和硒吸收和轉(zhuǎn)化上表現(xiàn)出不同的親和性。 硫是菌體生長所必需的元素，因此硫質(zhì)量濃度的大小對菌體生長有一定的影響，同時硫?qū)ξ奈辙D(zhuǎn)化還存在競爭性抑制。 Mapelli[23]認(rèn)為在硒酵母發(fā)酵過程中硫質(zhì)量濃度達到某一關(guān)鍵點時細(xì)胞對硒的吸收會顯著下降。

為了考察在低硫質(zhì)量濃度下是否有利于菌體對無機硒的吸收和代謝，特設(shè)定了2 種培養(yǎng)基進行分批發(fā)酵，一種是酵母正常生長所需的硫酸根質(zhì)量濃度3.8 g/L， 另一種為低硫酸根質(zhì)量濃度0.02 g/L[16]，結(jié)果見圖2。 從 圖2 可以看出，低質(zhì)量濃度硫培養(yǎng)基在開始階段菌體生長的遲滯期比正常硫培養(yǎng)基延長了2 h 左右， 但是在進入對數(shù)生長期后低質(zhì)量濃度硫培養(yǎng)基的菌體細(xì)胞比生長速率逐步接近正常硫培養(yǎng)基的菌體， 它們的比生長速率分別為0.125、0.122 h-1， 最終的菌體質(zhì)量濃度分別為 12.9、12.5 g/L。為了比較細(xì)胞在兩種培養(yǎng)基中對無機硒的吸收和轉(zhuǎn)化率的影響，分別在這兩種培養(yǎng)基中加入亞硒酸鈉，初始質(zhì)量濃度都為30.3 mg/L。 酵母細(xì)胞在兩種培養(yǎng)基下無機硒的殘留質(zhì)量濃度和菌體質(zhì)量濃度隨時間的變化曲線見圖3。可以看到，在低質(zhì)量濃度硫培養(yǎng)基中，菌體生長速度稍低于正常硫培養(yǎng)基中菌體生長速度，但是在這兩種培養(yǎng)基中菌體細(xì)胞對于硒的吸收和比硒消耗速率幾乎相同。 表2列出了這兩種培養(yǎng)基發(fā)酵參數(shù)。

圖2 在正常硫質(zhì)量濃度和低硫質(zhì)量濃度的葡萄糖培養(yǎng)基條件下酵母XM2-9 的發(fā)酵過程Fig.2 Batch fermentation of S. cerevisiae XM2-9 in glucose medium with normal and low sulphur concen -trations

圖3 在正常硫質(zhì)量濃度和低硫質(zhì)量濃度的葡萄糖培養(yǎng)基下硒酵母XM2-9 的發(fā)酵過程及其發(fā)酵液中殘留硒質(zhì)量濃度的變化Fig. 3 Selenium yeast batch fermentation by S. cerevisiae XM2-9 in glucose medium with normal and low sulphur concentrations

表2 不同初始硫質(zhì)量濃度下硒酵母發(fā)酵過程參數(shù)的測定和計算結(jié)果Table 2 Determination and calculation of fermentation parameters of selenium yeast with different initial sulphur concentration

由表2 可以看出，在對數(shù)生長期，通過計算得到在正常硫培養(yǎng)基下細(xì)胞的最大比硒消耗速率為d[cSe]/（Xdt）=0.47 mg/（g·h） 略大于低質(zhì)量濃度硫培養(yǎng)基下比硒消耗速率0.46 mg/（g·h），表明在此條件下低硫質(zhì)量濃度對無機硒的吸收和代謝并沒有改善。 但是這兩個比硒消耗速率數(shù)值和Suhajda[22]描述的最佳比硒消耗速率相吻合。 該比硒消耗速率值為后面流加發(fā)酵時亞硒酸鈉溶液的流量計算提供了理論依據(jù)。 實驗顯示，在這兩個硫質(zhì)量濃度相差比較大的情況下得到了非常相近的比生長速率和比硒消耗速率的數(shù)值。 為了證實實驗的可靠性，在培養(yǎng)基優(yōu)化時將硫酸鎂質(zhì)量濃度從0.05 g/L 增加到0.1 g/L， 所得到的比生長速率和比硒消耗速率是一致的。 由此可以推斷，在設(shè)定的正常硫酸根質(zhì)量濃度和低硫酸根質(zhì)量濃度之間酵母的比硒消耗速率是幾乎相同的。 實驗還證明，菌體生長在正常硫酸根質(zhì)量濃度下的遲滯期比在低硫酸根質(zhì)量濃度培養(yǎng)基下遲滯期大大縮短， 更加有利于硒酵母發(fā)酵，因此在后面流加發(fā)酵實驗中用正常硫酸鎂質(zhì)量濃度培養(yǎng)基。

2.2 恒速流加發(fā)酵對細(xì)胞生長與硒轉(zhuǎn)化的影響

流加發(fā)酵在酵母生產(chǎn)和一些初級代謝產(chǎn)物發(fā)酵中有廣泛應(yīng)用。 在發(fā)酵過程中通過控制培養(yǎng)基流量來減少發(fā)酵過程中產(chǎn)生的葡萄糖效應(yīng)[24]，與此同時，流加亞硒酸鈉溶液使菌體細(xì)胞在生長的同時不斷地吸收和代謝無機硒，從而獲得高產(chǎn)的甲基硒代半胱氨酸酵母。

在發(fā)酵罐中先加10 L 分批發(fā)酵培養(yǎng)基，接種后開始間歇發(fā)酵。 當(dāng)發(fā)酵液中殘?zhí)琴|(zhì)量濃度下降至0.1 g/L 以下時，開始流加發(fā)酵模式，流加量根據(jù)菌體比生長速率μ=0.117 h-1為參考。 初始發(fā)酵體積以10 L 計算，當(dāng)稀釋率分別選為D=0.06、0.08、0.1 h-1，則葡萄糖培養(yǎng)基流加量分別為F= 0.6、0.8、1 L/h泵入發(fā)酵罐。 同時亞硒酸鈉溶液也流加入罐內(nèi)，流量控制在比硒消耗速率 0.5 mg/（g·h）為佳。 當(dāng)亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為20 mg/mL 時， 無機硒流加量按公式f= 0.055XV計算。 當(dāng)起始發(fā)酵液體積V=10 L、菌體質(zhì)量濃度X=11 g/L、 亞硒酸鈉初始流加量為f1=6.05 mL/h，以此類推，流加量隨著發(fā)酵液體積和菌體濃度這兩個參數(shù)的乘積增加而增加。 但是到發(fā)酵后期隨著菌體細(xì)胞的逐步老化，細(xì)胞對無機硒的吸收和代謝速率下降，這時無機硒流加量應(yīng)有所變化。 將比硒消耗速率控制在 0.4 mg/（g·h）以下，同時測定發(fā)酵液中殘留的無機硒質(zhì)量濃度，控制發(fā)酵液中殘留的無機硒質(zhì)量濃度低于30 mg/L。 圖4 顯示恒速流加發(fā)酵過程中菌體質(zhì)量濃度和菌體中有機硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨時間變化的曲線。 發(fā)酵結(jié)束時分別測定發(fā)酵液中菌體質(zhì)量濃度和酵母中有機硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)等進行物料衡算， 并計算發(fā)酵動力學(xué)參數(shù)，見表3。

表3 不同流加量下硒酵母流加補料發(fā)酵的結(jié)果Table 3 Selenium yeast production by fed-batch fermentation under different flow rates

從圖4 可以看出， 當(dāng)葡萄糖培養(yǎng)基流加量為0.6 L/h 時，最終的菌體質(zhì)量濃度達到34.2 g/L，有機硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)也達到4 463 μg/g，發(fā)酵周期較長，有機硒生產(chǎn)強度為9.16 mg/（L·h）；當(dāng)流加量增加到1 L/h時，菌體在較快的比生長速率下繁殖，硒鹽的流加量也相應(yīng)加快，在此流加量下有機硒生產(chǎn)強度提高到9.69 mg/（L·h），但是菌體質(zhì)量濃度卻降低為 32.8 g/L，其有機硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)也降低到2 953 μg/g； 當(dāng)流加量為0.8 L/h 時， 細(xì)胞比生長速率介于前兩者之間，菌體細(xì)胞對硒的吸收和亞硒酸鈉流加量更匹配。 有機硒生產(chǎn)強度高于其他兩個流量的有機硒生產(chǎn)強度，達到 10.16 mg/（L·h）， 發(fā)酵結(jié)束時酵母的菌體質(zhì)量濃度為33.5 g/L，有機硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到3 791 μg/g。以上實驗結(jié)果說明，培養(yǎng)基的流加量與有機硒生產(chǎn)強度有密切的關(guān)系，當(dāng)流加量增加到某一值時，有機硒生產(chǎn)強度達到最大值，這是恒速流加發(fā)酵生產(chǎn)有機硒酵母的關(guān)鍵。

圖4 葡萄糖培養(yǎng)基在流加量0.6、0.8、1 L/h 時恒速流加硒酵母發(fā)酵過程Fig. 4 Fed-batch fermentation with a constant feeding at different flow rates of 0.6, 0.8 and 1 L/h

2.3 指數(shù)流加發(fā)酵優(yōu)化

恒速流加葡萄糖培養(yǎng)基發(fā)酵提高了有機硒生產(chǎn)強度和無機硒的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率， 但是在流加的初期，由于菌體質(zhì)量濃度比較低，在高速流加葡萄糖培養(yǎng)基情況下菌體來不及消耗葡萄糖，導(dǎo)致發(fā)酵液中殘?zhí)遣粩嘣黾樱猩倭恳掖嫉漠a(chǎn)生，乙醇質(zhì)量濃度積累至1.0~1.5 g/L， 從而影響細(xì)胞比生長速率和最終的葡萄糖產(chǎn)率。 為了消除殘?zhí)堑姆e累，設(shè)計了指數(shù)流加方式進料。 根據(jù)指數(shù)流加公式，分別設(shè)定了兩個比生長速率μ1=0.08 h-1和μ2=0.1 h-1來計算相對應(yīng)指數(shù)流加速率。

1） 根據(jù)公式計算， 首先設(shè)定參數(shù) μ1=0.08 h-1、V0=10 L、X0=11 g/L、Yx/s=0.42 g/g、SF=110 g/L。計算得到初始進料時的流量為F0=0.19 L/h，1 h 后流量增加為F1=0.22 L/h，以此類推一直進料28 h，總進料為20. 93 L。同時亞硒酸鈉溶液流加進料，流量控制在比硒消耗速率 0.5 mg/（g·h）， 計算方法和恒速進料一樣。

2） 再選取 μ2=0.1 h-1， 其他參數(shù)與計算方法同（1）來進行指數(shù)流加速率計算。

圖5 顯示這兩批指數(shù)流加發(fā)酵的結(jié)果。 當(dāng)葡萄糖培養(yǎng)基流加量以設(shè)定的μ1=0.08 h-1指數(shù)流加時，有機硒生產(chǎn)強度增加到 12.55 mg/（L·h）。 指數(shù)流加發(fā)酵的有機硒生產(chǎn)強度比恒速流加發(fā)酵提高了19%，酵母中有機硒的比例增加了23%。這是因為從指數(shù)流加發(fā)酵開始，發(fā)酵液中葡萄糖基本上被消耗掉，轉(zhuǎn)化成菌體，并且細(xì)胞一直維持較高的比生長速率，年輕菌體使得細(xì)胞的平均比硒消耗速率大于恒速流加的比硒消耗速率，結(jié)果最終的有機硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)大幅度提高。

圖5 葡萄糖培養(yǎng)基在設(shè)定的μ=0.08、0.1 h-1 時指數(shù)流加硒酵母發(fā)酵過程Fig.5 Fed-batch fermentation with an exponential feeding at different flow rates set at μ=0.08 h-1 and μ=0.1 h-1 respectively

當(dāng)葡萄糖培養(yǎng)基流加量以設(shè)定的μ2=0.1 h-1指數(shù)流加時，有機硒生產(chǎn)強度達 12.17 mg/（L·h）。但在實際操作時，發(fā)酵液中殘留無機硒有時瞬間升高導(dǎo)致對菌體的抑制作用以及發(fā)酵中后期的菌體部分老化，實際上平均比生長速率下降為0.083 h-1，低于0.1 h-1理論值。 通過比較發(fā)現(xiàn)，以設(shè)定的μ1=0.08 h-1指數(shù)流加的發(fā)酵結(jié)果最優(yōu)。

2.4 硒酵母有機硒代謝產(chǎn)物的測定結(jié)果和分析

通過指數(shù)流加發(fā)酵試驗后，分別得到兩個批次的硒酵母菌體，經(jīng)過洗滌和干燥得到酵母粉。 對這兩個樣品的有機硒成分做了檢測，結(jié)果見表4。

從表4 可知， 硒酵母中99% 以上是有機硒，其中甲基硒代半胱氨酸（SeMCys）占總有機硒的72%左右，硒代蛋氨酸（SeMet）占 21%~22%，大約 5%~6%余下的有機硒為各種硒代糖類。 研究認(rèn)為[25]，培養(yǎng)基中亞硒酸鈉和酵母細(xì)胞膜上特異配體結(jié)合形成復(fù)合體，通過轉(zhuǎn)運離子通道并穿過細(xì)胞膜進入細(xì)胞內(nèi)。 在細(xì)胞內(nèi)亞硒酸鈉經(jīng)過一系列代謝途徑合成重 要 的 中 間 代 謝 物 Selenocystathionine。Selenocystathionine 在 cystathionine-γ-lyase 作用下形成硒代半胱氨酸，這時硒代半胱氨酸在硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)化酶作用下產(chǎn)生甲基硒代半胱氨酸。 由于S. cerevisiaeXM2-9 突變株的 synthase γ-glu-Cys 酶失活， 所以形成的甲基硒代半胱氨酸不能繼續(xù)向下合成γ-glu-SeMetCys，從而導(dǎo)致甲基硒代半胱氨酸積累在細(xì)胞內(nèi)。 因為甲基硒代半胱氨酸不是合成蛋白質(zhì)的氨基酸， 只能存儲在細(xì)胞的液泡中，這樣酵母突變株利用這一代謝機制將亞硒酸鈉轉(zhuǎn)化為甲基硒代半胱氨酸，從而有效降低了亞硒酸鈉對細(xì)胞的毒性。

表4 硒酵母中有機硒代謝物的測定結(jié)果Table 4 Determination of organic selenium metabolites in selenium yeast product

通過上述分析發(fā)現(xiàn)，硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)化酶是合成甲基硒代半胱氨酸的關(guān)鍵酶。 Mapelli[16]為了生產(chǎn)甲基硒代半胱氨酸，構(gòu)建了能夠高效表達異質(zhì)硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)化酶的工程酵母菌，雖然轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞能產(chǎn)生一定量甲基硒代半胱氨酸，但是質(zhì)量分?jǐn)?shù)卻很低，只有2.6 μg/g。 其原因是合成的甲基硒代半胱氨酸已部分代謝成其他的中間產(chǎn)物，而不是積累在細(xì)胞內(nèi)。 Klimaszewska[17]等利用真菌Lentinula edodes生產(chǎn)甲基硒代半胱氨酸，通過不斷提高培養(yǎng)基中亞硒酸鈉的質(zhì)量濃度來馴化菌體對無機硒的抗性，同時優(yōu)化發(fā)酵條件，使馴化后菌體的有機硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)比出發(fā)菌株大幅度提高。Lentinula edodes液體發(fā)酵得到的菌體質(zhì)量濃度為10 g/L， 菌體中甲基硒代半胱氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為120 μg/g，硒代蛋氨酸為672 μg/g。雖然含甲基硒代半胱氨酸的真菌Lentinula edodes具有潛在的食品保健功能，但是遠(yuǎn)不能達到作為工業(yè)化生產(chǎn)甲基硒代半胱氨酸的要求。 與上述的研究相比，本研究在甲基硒代半胱氨酸生產(chǎn)強度和有機硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)方面有了很大的突破。

3 結(jié) 語

首先采用分批發(fā)酵，在葡萄糖培養(yǎng)基中加入不同初始質(zhì)量濃度的亞硒酸鈉進行發(fā)酵對比，確定了硒酵母在各種培養(yǎng)基中的最大比生長速率。 然后考察培養(yǎng)基中硫酸鎂質(zhì)量濃度對發(fā)酵的影響，并確定酵母細(xì)胞在有機硒轉(zhuǎn)化過程中最佳比硒消耗速率。在此基礎(chǔ)上， 首次采用雙流加發(fā)酵工藝生產(chǎn)硒酵母。 通過比較發(fā)現(xiàn)，葡萄糖培養(yǎng)基采用指數(shù)流加供料為最佳， 使細(xì)胞處于較高的比生長速率下繁殖。與此同時，建立獨立的亞硒酸鈉流加系統(tǒng)，進料速度控制在比硒消耗速率 0.5 mg/（g·h）左右。 用數(shù)學(xué)模型對兩種流加速率進行優(yōu)化控制，并以有機硒生產(chǎn)強度為優(yōu)化指標(biāo)，最終的硒酵母發(fā)酵取得了最佳結(jié)果。 以設(shè)定的比生長速率μ1=0.08 h-1指數(shù)流加葡萄糖時，有機硒生產(chǎn)強度達到最高值12.55 mg/（L·h），菌體最終質(zhì)量濃度達到35.6 g/L， 酵母中有機硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達4 937 μg/g，其中，更有價值的甲基硒代半胱氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到8 189 μg/g。 通過優(yōu)化取得了在高有機硒生產(chǎn)強度條件下生產(chǎn)甲基硒代半胱氨酸的目的。