汪 沁， 中西秀樹(shù)， 高曉冬

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

釀酒酵母是公認(rèn)的有益于人類(lèi)的真菌[1]，在營(yíng)養(yǎng)條件充足的情況下它進(jìn)行有絲分裂，此時(shí)的酵母以營(yíng)養(yǎng)態(tài)細(xì)胞狀態(tài)存在。 但是，在碳源或氮源等營(yíng)養(yǎng)條件匱乏的情況下， 釀酒酵母為了傳宗接代，會(huì)進(jìn)行減數(shù)分裂，產(chǎn)4 個(gè)孢子包裹于子囊中[2-3]。 營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母細(xì)胞壁有兩層，分別是內(nèi)層葡聚糖層和外層的甘露糖蛋白層[4-5]。 酵母孢子壁有4 層，從內(nèi)到外依次是甘露糖層、葡聚糖層、殼聚糖層和二酪氨酸層[6]。 二酪氨酸層是酵母孢子壁特有的結(jié)構(gòu)，其單體是由兩個(gè)甲基酪氨酸分子構(gòu)成[7]。 這種特殊的孢子壁結(jié)構(gòu)能幫助減數(shù)分裂后的細(xì)胞核抵御嚴(yán)酷的大自然環(huán)境，等待適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，從而發(fā)芽成長(zhǎng)，再次成為營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)，維持酵母的繁衍[4]。

巨噬細(xì)胞屬于免疫細(xì)胞的一種，能夠吞噬和降解外源顆粒以及微生物并激活免疫反應(yīng)。 巨噬細(xì)胞的吞噬過(guò)程依賴(lài)于細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR）， 該受體能夠識(shí)別微生物表面保守的分子模式 （microbe associated molecular pattern，MAMP）并且激活受體上酪氨酸基序 （immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）[8-9]。 被激活的ITAM 序列進(jìn)一步招募脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）啟動(dòng)巨噬細(xì)胞的吞噬過(guò)程[10-11]。 Syk 信號(hào)能夠激活諸如磷脂酶Cγ（PLCγ） 和磷脂酰肌醇 3-激酶（Phosphoinositide 3-kinase，PI3K）等下游信號(hào)，從而增加吞噬效率[11-13]。吞噬過(guò)程中，較大顆粒（>2 μm）吞噬依賴(lài)于 PI3K的活性[14]。 巨噬細(xì)胞對(duì)微生物表面分子模式的識(shí)別是啟動(dòng)直接吞噬的第一步[15]。 微生物表面的糖鏈結(jié)構(gòu)的特殊性使其被巨噬細(xì)胞所識(shí)別從而引起吞噬[16-17]。

自然條件下，多數(shù)酵母處于營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞態(tài)。 營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母壁的葡聚糖成分能夠被巨噬細(xì)胞表面葡聚糖受體識(shí)別從而引起吞噬，促進(jìn)巨噬細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6 和 IL-12 的釋放[18-20]，葡聚糖也能夠與細(xì)菌結(jié)合從而抑制細(xì)菌在胃腸道增殖從而達(dá)到抑菌的作用[21]。 營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母壁的幾丁質(zhì)成分也能刺激巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子TNF-α 和IL-6，并且增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)假絲酵母的殺傷作用[22]。 營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母壁上這些免疫活性物質(zhì)的存在使得營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母作為飼料添加物能夠增強(qiáng)牛和豬的免疫力[23-25]。

釀酒酵母雖為與人類(lèi)共生的真菌，但目前其子囊孢子形態(tài)對(duì)免疫系統(tǒng)的作用很大程度上未知，酵母孢子的葡聚糖層被殼聚糖層和二酪氨酸層嚴(yán)密包裹，其免疫活性物質(zhì)未知。作者以小鼠RAW264.7細(xì)胞作為巨噬細(xì)胞模型，研究了巨噬細(xì)胞識(shí)別和吞噬酵母孢子的作用機(jī)制，為后續(xù)探究野生型酵母孢子免疫作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

作者使用高效產(chǎn)孢率的AN120二倍體釀酒酵母菌株，以及dit1Δ 和chs3Δ 突變體菌株，均來(lái)自作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏菌株，相關(guān)信息見(jiàn)表1。

表1 本研究中所用的酵母菌株Table 1 S. cerevisiae strains used in this study

1.2 細(xì)胞及培養(yǎng)

RAW264.7 小鼠巨噬細(xì)胞， 購(gòu)自中科院菌種保藏庫(kù)，用含有 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，條件為 5% CO2，37 ℃。

1.3 培養(yǎng)基

YPAD 培養(yǎng)基：蛋白胨A 10 g，酵母提取物5 g，腺嘌呤15 mg 溶解于450 mL 去離子水中， 滅菌后加入50 mL 質(zhì)量濃度為20 g/dL 的葡萄糖混勻。 固體培養(yǎng)基則加入瓊脂（Agar）10 g 一起滅菌，之后加入葡萄糖混勻，倒平板。

YPAce 培養(yǎng)基：蛋白胨A 20 g，酵母提取物10 g，腺嘌呤30 mg， 醋酸鉀10 g 溶解于1 L 去離子水中，高壓濕熱滅菌。

KAc 培養(yǎng)基：稱(chēng)取20 g KAc 溶于1 L 去離子水中，固體培養(yǎng)基加入20 g 的瓊脂粉，高壓滅菌，倒平板。

1.4 主要試劑和儀器

主要試劑有：DMEM 高糖培養(yǎng)基（Gibco），胎牛血清（Gibco），昆布糖（Sigma），葡聚糖微球（Sigma），PBS（生工），胰蛋白酶（生工），蛋白酶 K（Sigma），溶菌酶（Sigma）；主要儀器有：細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo），離心機(jī)（Takara），顯微鏡（日立）等。

1.5 酵母培養(yǎng)

酵母菌株于固體YPAD 平板劃線(xiàn)培養(yǎng)3 d 后，用粗頭牙簽接種于5 mL YPAD 液體培養(yǎng)基， 轉(zhuǎn)接于100 mL 液體YPAD 培養(yǎng)基培養(yǎng)3~5 h，使酵母處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期并且OD660為0.6~0.8， 此時(shí)收集營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母， 用0.5% 吐溫-20 洗3 次后再用去離子水洗 3 次，3 000 r/min 離心，稱(chēng)質(zhì)量備用。 酵母孢子的制備： 營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母過(guò)夜培養(yǎng)后， 取10 mL 轉(zhuǎn)接到200 mL 的YPAce 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h 后離心轉(zhuǎn)移到2% KAc 培養(yǎng)基后續(xù)培養(yǎng)2 d； 離心收集子囊酵母，當(dāng)產(chǎn)孢率大于95% 時(shí)，離心收集菌體，PBS 洗2次， 加入 5 mL 原生質(zhì)體溶液 （1.2 mol/L 山梨醇，0.1 mol/L PBS）和 50 μL（10 000 U/mL）溶菌酶，于25 ℃ 搖床處理3 h；原生質(zhì)體溶液洗2 次，去離子水洗2 次，加入5 mL 去離子水超聲20 min（45%功率，超聲 5 s，停 2 s），用 0.5%吐溫-20 洗 3 次后再用去離子水洗3 次， 顯微鏡觀(guān)察孢子純化效果，將純化后孢子制備成100 mg/mL 的孢子懸液。

1.6 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)和吞噬實(shí)驗(yàn)

RAW264.7 小鼠巨噬細(xì)胞置于含10% 滅活牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，用含EDTA 的胰酶消化后傳代。 12 孔板每孔接種5×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h 后，每孔加入相同質(zhì)量的營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母或者酵母孢子， 每組設(shè)置 5 個(gè)平行，1 300 r/min 離心 3 min，使酵母落到細(xì)胞表面， 后續(xù)培養(yǎng)30 min，PBS 洗3次，胰酶消化收集細(xì)胞于離心管，4% 多聚甲醛固定10 min，PBS 洗 3 次。顯微鏡鏡檢并統(tǒng)計(jì)每 100 個(gè)巨噬細(xì)胞吞噬營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母或孢子的個(gè)數(shù)。

1.7 藥物抑制實(shí)驗(yàn)

用培養(yǎng)基將母液濃度為10 mmol/L 的Syk 抑制劑白皮杉醇稀釋為 25 μmol/L 或 50 μmol/L 的工作濃度；用培養(yǎng)基將母液質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的PI3K抑制劑渥曼青霉素稀釋為100 ng/mL 或200 ng/mL。進(jìn)行抑制實(shí)驗(yàn)時(shí)，細(xì)胞接種于12 孔板培養(yǎng)24 h，更換為含有白皮杉醇或渥曼青霉素的培養(yǎng)基并于37 ℃孵育30 min，加入1 mg 營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母或1 mg 酵母孢子或200 μg 葡聚糖微球，離心并后續(xù)培養(yǎng)30 min，統(tǒng)計(jì)相對(duì)吞噬效率。

1.8 無(wú)血清吞噬實(shí)驗(yàn)

營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母或孢子與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)前，更換不含血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基或含有10% 血清的培養(yǎng)基處理2 h， 隨后更換為處理組對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基并分別加入1 mg 的營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母或酵母孢子，1 300 r/min 離心 2 min 后共培養(yǎng) 30 min， 統(tǒng)計(jì)吞噬效率。

1.9 高鹽以及蛋白酶處理對(duì)孢子吞噬效率的影響

野生型酵母孢子經(jīng)高鹽 （0.6 mol/L NaCl 或1 mol/L PBS）洗滌后，去離子水洗3 次，離心稱(chēng)質(zhì)量。 蛋白酶處理野生型酵母孢子時(shí)，取野生型酵母孢子100 mg， 按照以下反應(yīng)進(jìn)行：50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），5 mmol/L CaCl2，加入 200 μL 蛋白酶K （600 U/mL）， 于 37 ℃ 處理 1 h， 之后用 0.5%吐溫-20 洗滌 3 次，去離子水洗滌 3 次，超聲 30 s，制備成100 mg/mL 的孢子懸液。 比較處理組與未處理組吞噬效率。

1.10 單糖或者多糖抑制實(shí)驗(yàn)

用培養(yǎng)基配制終質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的昆布糖培養(yǎng)液以及5 mg/mL 的甘露糖、甘露聚糖、半乳糖、乳糖以及鹽藻糖培養(yǎng)液，取1 mL 上述含糖培養(yǎng)液和細(xì)胞共孵育30 min 之后， 加入1 mg 的營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母或1 mg 酵母孢子或200 μg 葡聚糖微球，離心后進(jìn)行吞噬實(shí)驗(yàn)并且統(tǒng)計(jì)相對(duì)吞噬效率。

1.11 野生型孢子和突變體孢子吞噬實(shí)驗(yàn)

取 1 mg 的野生型酵母孢子、dit1Δ 孢子和chs3Δ 孢子，按照1.6 方法進(jìn)行吞噬實(shí)驗(yàn)。

1.12 統(tǒng)計(jì)分析

采用Graphprism 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析作圖，所有數(shù)據(jù)以平均值+標(biāo)準(zhǔn)差表示。 用單因素或雙因素方差分析（One-Way or Two-Way ANOVA）檢驗(yàn)組間的差異。 檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)5 次。 對(duì)于本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，標(biāo)記如下：P≥0.05 標(biāo)記為 ns；0.01＜P＜0.05 標(biāo)記為 *；0.001＜P≤0.01 標(biāo)記為 **；P≤0.001 標(biāo)記為 ***；P≤0.000 1 標(biāo)記為 ****。

2 結(jié)果與分析

2.1 巨噬細(xì)胞內(nèi)吞野生型酵母孢子效率高于營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母

營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母壁和野生型酵母孢子壁的結(jié)構(gòu)有所不同，比較巨噬細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母和野生型酵母孢子的響應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖1（a）。 隨著營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母或野生型酵母孢子質(zhì)量濃度的增加，巨噬細(xì)胞吞噬營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母和野生型孢子的數(shù)目呈上升趨勢(shì)。 當(dāng)營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母和孢子質(zhì)量均為1 mg 時(shí)， 巨噬細(xì)胞吞噬營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母和孢子的情形見(jiàn)圖1（b）。 統(tǒng)計(jì)分析表明，此時(shí)每100 個(gè)巨噬細(xì)胞吞噬酵母或孢子的個(gè)數(shù)分別為35 個(gè)和320 個(gè)。 質(zhì)量為1 mg 時(shí)，酵母孢子個(gè)數(shù)約為營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母?jìng)€(gè)數(shù)的3.7 倍， 此時(shí)孢子被吞噬個(gè)數(shù)約為營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母?jìng)€(gè)數(shù)的9 倍。 這表明巨噬細(xì)胞對(duì)酵母孢子內(nèi)吞效率顯著高于營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母。

圖1 巨噬細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母和野生型酵母孢子吞噬效率比較（± SD，n=5）Fig. 1 Phagocytosis efficiency of vegetative yeast and wild type spores（± SD，n=5）

2.2 巨噬細(xì)胞對(duì)酵母孢子的內(nèi)吞是依賴(lài)于Syk 和PI3K 的吞噬過(guò)程

巨噬細(xì)胞對(duì)大顆粒微生物的內(nèi)吞主要是通過(guò)巨胞飲和吞噬過(guò)程[29]。 巨胞飲指的是細(xì)胞依賴(lài)于細(xì)胞膜流動(dòng)性的非特異內(nèi)吞大顆粒過(guò)程[30]；吞噬過(guò)程指的是免疫細(xì)胞膜上受體介導(dǎo)的并且依賴(lài)于Syk途徑的內(nèi)吞過(guò)程[10，31]。 已有的研究表明，巨噬細(xì)胞吞噬葡聚糖微球依賴(lài)于Syk， 通過(guò)白皮杉醇抑制Syk能夠抑制巨噬細(xì)胞對(duì)葡聚糖微球的吞噬[32]。 利用Syk 抑制劑白皮杉醇阻斷Syk 所介導(dǎo)的信號(hào)通路見(jiàn)圖2（a）。 與對(duì)照組相比，增加白皮杉醇的濃度會(huì)增強(qiáng)抑制巨噬細(xì)胞對(duì)葡聚糖微球、營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母和野生型孢子的吞噬作用，這表明巨噬細(xì)胞對(duì)野生型酵母孢子和酵母的內(nèi)吞途徑是依賴(lài)于Syk 受體介導(dǎo)的吞噬過(guò)程。 有研究表明，巨噬細(xì)胞吞噬較大顆粒依賴(lài)于PI3K[33]，配制不同濃度的渥曼青霉素測(cè)定其對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母和野生型酵母孢子的影響。如圖2（b）所示，與對(duì)照組相比，渥曼青霉素對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬酵母和葡聚糖微球無(wú)顯著影響；隨著渥曼青霉素質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬野生型酵母孢子的抑制作用增強(qiáng)。 這表明盡管野生型孢子直徑小于營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母，其吞噬途徑是極其依賴(lài)于PI3K 的過(guò)程，而營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母的吞噬過(guò)程不是顯著依賴(lài)于PI3K 的過(guò)程。 因此，巨噬細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母和野生型酵母孢子的吞噬依賴(lài)Syk 下游不同激酶，表明巨噬細(xì)胞吞噬營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母和孢子所依賴(lài)的信號(hào)途徑不同。

圖 2 Sky 抑制劑白皮杉醇或PI3K 抑制劑渥曼青霉素對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)吞營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母、野生型酵母孢子和葡聚糖微球的影響（± SD，n=5）Fig. 2 Sky inhibitor picetannol or PI3K inhibitor wortmannin effect on the phagocytosis efficiency of vegetative yeasts，wild type yeast spores and glucan microspheres（± SD，n=5）

2.3 巨噬細(xì)胞對(duì)野生型酵母孢子的吞噬不依賴(lài)于血清調(diào)理

為了探究巨噬細(xì)胞對(duì)酵母孢子識(shí)別是否依賴(lài)于血清中補(bǔ)體或抗體成分，檢測(cè)無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)吞噬野生型孢子效率的影響。 如圖3（a） 所示，每100個(gè)巨噬細(xì)胞于有、無(wú)血清情況下吞噬營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母和野生型酵母孢子的個(gè)數(shù)分別為 42、38 和338、322，統(tǒng)計(jì)分析無(wú)顯著性差異，這表明巨噬細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母或野生型酵母孢子的吞噬不依賴(lài)于血清中補(bǔ)體和免疫球蛋白成分。 圖3（b）顯示，無(wú)血清條件下攝入營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母或野生型孢子的巨噬細(xì)胞占總細(xì)胞的比率分別為18%和83%，這表明巨噬細(xì)胞對(duì)野生型孢子有更高效的內(nèi)吞作用。 因此，巨噬細(xì)胞對(duì)野生型孢子的吞噬不是依賴(lài)于血清中補(bǔ)體和抗體調(diào)理導(dǎo)致的間接吞噬，這種吞噬極有可能是孢子表面存在的物質(zhì)被巨噬細(xì)胞識(shí)別從而引起吞噬。

圖 3 血清對(duì)吞噬的影響（± SD，n=5）Fig. 3 Effect of serum on phagocytosis efficiency of vegetative yeast and spores（± SD，n=5）

2.4 巨噬細(xì)胞吞噬酵母孢子的配體為共價(jià)結(jié)合到孢子壁的非蛋白質(zhì)成分

為了進(jìn)一步探究孢子壁上何種物質(zhì)作為分子配體導(dǎo)致野生型酵母孢子的高效吞噬，通過(guò)高鹽洗滌除去吸附在野生型酵母孢子壁上的分子，利用蛋白酶處理孢子壁并比較其吞噬效率。 如圖4 所示，處理后的酵母孢子吞噬效率與對(duì)照組吞噬效率無(wú)顯著差異，這表明野生型孢子表面被巨噬細(xì)胞識(shí)別的主要配體不是吸附于二酪氨酸層的物質(zhì)，而是共價(jià)結(jié)合到二酪氨酸層的物質(zhì)，并且這種分子配體物質(zhì)不是蛋白質(zhì)。

圖4 高鹽洗脫和蛋白酶處理對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬野生型酵母孢子的影響（± SD，n=5）Fig. 4 Effect of high salt treatment and proteinase K treatment on the phagocytosis efficiency of wild type spores（± SD，n=5）

2.5 巨噬細(xì)胞吞噬營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母依賴(lài)于葡聚糖配體，而酵母孢子不依賴(lài)

微生物表面的糖鏈能夠被巨噬細(xì)胞所識(shí)別，從而引起吞噬[34]。 為了探究巨噬細(xì)胞吞噬營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母和野生型酵母孢子與糖鏈配體是否有關(guān)，通過(guò)一系列糖鏈作為配體競(jìng)爭(zhēng)抑制劑。 昆布糖（直鏈的葡聚糖）能夠抑制由于酵母葡聚糖配體引起的吞噬[35-36]，因此選取昆布糖作為對(duì)照組。 從圖5 可知，昆布糖能夠顯著地抑制巨噬細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母和葡聚糖微球的吞噬，但對(duì)野生型酵母孢子的吞噬無(wú)顯著影響。 圖5 表明，甘露糖、甘露聚糖、半乳糖、乳糖以及巖藻糖對(duì)營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母以及野生型酵母孢子的吞噬均無(wú)顯著影響。 因此巨噬細(xì)胞通過(guò)識(shí)別營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母和葡聚糖微球上葡聚糖配體介導(dǎo)吞噬，但野生型酵母孢子表面被巨噬細(xì)胞識(shí)別的配體不是葡聚糖或甘露聚糖等糖鏈，巨噬細(xì)胞識(shí)別營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母和野生型酵母孢子的配體不同。

圖 5 不同糖鏈對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母和野生型酵母孢子的影響（± SD，n=5）Fig. 5 Effect of different sugars on the phagocytosis efficiency of vegetative yeast，wild type spores and glucan microspheres（± SD，n=5）

2.6 巨噬細(xì)胞對(duì)野生型酵母孢子的識(shí)別依賴(lài)于二酪氨酸層結(jié)構(gòu)

為了探究野生型孢子表面被識(shí)別的配體，比較巨噬細(xì)胞吞噬野生型酵母孢子（AN120孢子）、dit1Δ孢子和chs3Δ 孢子的效率。dit1Δ 菌株是野生型酵母敲除二酪氨酸層合成基因DIT1后得到的菌株，因此dit1Δ 孢子無(wú)二酪氨酸層[37]。chs3Δ 菌株是野生型酵母敲除酵母孢子殼聚糖層合成基因CHS3后得到的菌株，因此chs3Δ 孢子無(wú)殼聚糖層。 由于二酪氨酸層的合成是依賴(lài)于殼聚糖層的存在， 因此chs3Δ孢子也無(wú)二酪氨酸層的存在[3]。 統(tǒng)計(jì)每100 個(gè)巨噬細(xì)胞吞噬野生型酵母孢子、dit1Δ 孢子和chs3Δ 孢子的個(gè)數(shù)，從圖6 可知，巨噬細(xì)胞對(duì)野生型酵母孢子的吞噬效率顯著高于dit1Δ 孢子和chs3Δ 孢子。 如圖 6（b）所示，酵母dit1Δ 孢子和chs3Δ 孢子與野生型酵母孢子大小相似，但巨噬細(xì)胞對(duì)野生型孢子的吞噬更為高效，這表明巨噬細(xì)胞對(duì)野生型酵母孢子的高效吞噬不是因?yàn)槠渲睆叫∮跔I(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母，而是因?yàn)橐吧徒湍告咦颖谧钔鈱佣野彼釋拥拇嬖谑蛊淠鼙痪奘杉?xì)胞識(shí)別，從而介導(dǎo)吞噬的發(fā)生。

圖 6 巨噬細(xì)胞對(duì)野生型酵母孢子、dit1Δ 和 chs3Δ 突變體孢子的吞噬（± SD，n=5）Fig. 6 Phagocytosis efficiency of wild type spores，dit1Δ spores and chs3Δ spores（± SD，n=5）

3 結(jié) 語(yǔ)

釀酒酵母孢子形態(tài)對(duì)免疫細(xì)胞的作用未被詳細(xì)研究，作者通過(guò)比較巨噬細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母和野生型酵母孢子的內(nèi)吞效率，發(fā)現(xiàn)野生型酵母孢子能夠更高效地被巨噬細(xì)胞內(nèi)吞。 進(jìn)一步研究表明：野生型酵母孢子和營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母的內(nèi)吞是依賴(lài)于Syk的受體介導(dǎo)的吞噬作用，但野生型酵母孢子的吞噬相對(duì)于營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母而言極其依賴(lài)PI3K，這表明巨噬細(xì)胞吞噬野生型孢子和營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母的吞噬信號(hào)途徑也有所不同。 營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母的吞噬配體是葡聚糖，但野生型酵母孢子的吞噬不依賴(lài)于葡聚糖配體，其高效吞噬與野生型孢子壁二酪氨酸層有關(guān)。

本研究表明，巨噬細(xì)胞高效吞噬野生型酵母孢子是依賴(lài)于二酪氨酸層，對(duì)這種配體的分子研究讓我們能夠找到一種可利用的、作為載體的生物分子配體， 可將外源物質(zhì)高效傳遞到巨噬細(xì)胞體內(nèi)，為日后開(kāi)發(fā)一種無(wú)毒、高效的靶向巨噬細(xì)胞的生物介質(zhì)提供理論依據(jù)。