程 藝 ， 馬 超 ， 陳曉雨 ， 邵鈺晨 ， 王 瀟 ，楊雪麗 ， 蘇 蓉 ， 李婷婷 *

（1. 江蘇海洋大學(xué) 江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 連云港 222005； 2. 江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005）

限制性核酸內(nèi)切酶（簡(jiǎn)稱(chēng)“限制酶”）是現(xiàn)代基因工程中最基礎(chǔ)的一大類(lèi)工具酶[1]。 天然來(lái)源的限制酶往往具有星號(hào)活性（即在非理想條件下限制酶的專(zhuān)一性發(fā)生改變）較強(qiáng)、反應(yīng)緩沖體系不一致等缺陷，所以研究者對(duì)限制酶的研究和改造一直沒(méi)有停止[2]。 不同限制酶之間的序列同源性很低，基本無(wú)法通過(guò)同源序列分析來(lái)確定核心催化位點(diǎn)，因此解析限制酶蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)和闡明限制酶的分子機(jī)制對(duì)后續(xù)定向改造具有重要的指導(dǎo)意義[3-4]。 然而，盡管目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)千種限制酶，被商業(yè)化應(yīng)用的限制酶也達(dá)到300 種左右，但迄今為止僅有50 余種限制酶的三維結(jié)構(gòu)得到解析[5-8]。

大多數(shù)限制酶蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量小于70 000，適合采用X 射線(xiàn)晶體衍射法解析三維結(jié)構(gòu)[9-10]。 由于限制酶具有切割DNA 的特性， 在對(duì)其進(jìn)行重組表達(dá)時(shí)往往會(huì)使宿主DNA 被切割， 造成宿主菌的死亡，因此需要利用該限制酶對(duì)應(yīng)的甲基化酶對(duì)宿主DNA 進(jìn)行保護(hù)， 從而獲得重組限制酶的大量表達(dá)[11]。 另一方面，由于限制酶彼此之間序列同源性低，無(wú)法參考已有的限制酶晶體結(jié)構(gòu)，使用分子置換法來(lái)推算晶體衍射的相位，只能采用同晶置換法或反常散射法[12]。 同晶置換法需要制備大量蛋白質(zhì)晶體來(lái)摸索制備重原子衍生物的浸泡條件。 反常散射法在重組表達(dá)時(shí)制備蛋白硒代衍生物，通過(guò)在多個(gè)波長(zhǎng)下收集硒原子邊緣的反常散射及其附近的衍射數(shù)據(jù)，從而推算晶體衍射相位[13-14]。 雖然硒元素對(duì)蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)及穩(wěn)定性均會(huì)產(chǎn)生不同程度的影響，硒代的效率也受諸多因素干擾[15]，但由于其操作方便，研究時(shí)會(huì)首先選擇反常散射法。 目前在大腸桿菌中表達(dá)硒代蛋白可以選擇甲硫氨酸缺陷型表達(dá)菌株，或者阻斷甲硫氨酸合成通路，利用外源硒代甲硫氨酸獲得硒代蛋白。

NcoI 是一種來(lái)源于珊瑚諾卡氏菌Nocardia corallina的Type II 類(lèi)限制酶， 是常用的限制酶之一，迄今為止尚未有三維結(jié)構(gòu)和分子機(jī)制相關(guān)的報(bào)道。 作者利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，重組表達(dá)了野生型NcoI 蛋白質(zhì)和硒代NcoI 蛋白質(zhì)， 并嘗試以坐滴法篩選晶體生長(zhǎng)條件，為下一步解析NcoI 的三維結(jié)構(gòu)、闡明其分子機(jī)制和定向改造提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

BL21 （DE3）pLysS、B834 （DE3）pLysS 和 pET-28b 質(zhì)粒載體： 購(gòu)自武漢淼靈生物科技有限公司；λDNA、無(wú)縫克隆試劑盒等分子生物學(xué)試劑：購(gòu)自莫納 （武漢） 生物科技有限公司；Ni 親和層析基質(zhì)（Toyopearl AF）：購(gòu)自東曹（上海）生物科技有限公司；UniGel-80Q：購(gòu)自江蘇納微生物科技有限公司；HiLoad 16/60 Superdex 75pg 凝膠過(guò)濾預(yù)裝柱：購(gòu)自美國(guó)GE 公司；蛋白胨、酵母粉、瓊脂糖：購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選試劑盒：購(gòu)自美國(guó)Hampton Research 公司；其余化學(xué)試劑均為國(guó)藥分析純。JN-02 細(xì)胞高壓破碎儀：購(gòu)自廣州聚能生物科技有限公司；Beckman Avanti J-26s XP 離心機(jī)：購(gòu)自 Beckman 公司；Invitrogen Qubit 4 熒光計(jì)：購(gòu)自 Thermo Fisher Scientific 公司；恒溫晶體生長(zhǎng)拍照儀：購(gòu)自美國(guó)Formulatrix 公司。

1.2 方法

1.2.1NcoI 重組蛋白的載體構(gòu)建 編碼II 型限制性?xún)?nèi)切酶NcoI 的基因序列（UniProt ID：O85489）和甲 基 化 酶NcoIM 的 基 因 序 列 （UniProt ID：A0A077QMR0）經(jīng)人工合成，同時(shí)克隆至一個(gè)目標(biāo)載體pET-28b。 將重組質(zhì)粒pET28b-NcoI 通過(guò)熱激轉(zhuǎn)化法分別導(dǎo)入 BL21 （DE3） pLysS 和 B834（DE3）pLysS 感受態(tài)細(xì)胞。 因?yàn)閜ET-28b 載體上帶有卡那霉素的抗性基因， 而兩種表達(dá)菌株 BL21（DE3）pLysS 和 B834（DE3）pLysS 均自帶氯霉素抗性基因，所以經(jīng)卡那霉素和氯霉素雙抗性L(fǎng)B 平板篩選，獲得NcoI 重組表達(dá)菌株 BL21 （DE3） pLysS-NcoI 和B834（DE3）pLysS-NcoI。

1.2.2NcoI 重組蛋白及其硒代蛋白的發(fā)酵NcoI重組蛋白的發(fā)酵：菌株 BL21（DE3） pLysS-NcoI 接種在LB 培養(yǎng)基中，經(jīng)活化和擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600nm為0.6～0.8，分別于 16、37 ℃加入 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，IPTG濃度分別為0.1、0.5、1.0 mmol/L 進(jìn)行最佳表達(dá)條件優(yōu)化。硒代NcoI 重組蛋白的發(fā)酵：菌株BL21（DE3）pLysS-NcoI 或者 B834 （DE3）pLysS-NcoI 在過(guò)渡培養(yǎng)基（LB 培養(yǎng)基與M9 培養(yǎng)基比例為2∶8）中擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為 0.6～0.8，后轉(zhuǎn)移菌體至M9 培養(yǎng)基中，補(bǔ)加硒代甲硫氨酸至質(zhì)量濃度為0.05 g/L，在37 ℃適應(yīng)性培養(yǎng) 15 min， 于 16 ℃加入 IPTG（0.5 mmol/L） 誘導(dǎo)表達(dá) 16 h。 菌株 BL21（DE3）pLysS-NcoI 在過(guò)渡培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8， 后轉(zhuǎn)移菌體至 M9 培養(yǎng)基中， 補(bǔ)加苯丙氨酸、蘇氨酸、賴(lài)氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸至各質(zhì)量濃度為0.1 g/L， 硒代甲硫氨酸0.05 g/L，在37 ℃適應(yīng)性培養(yǎng) 15 min， 于 16 ℃加入 IPTG（0.5 mmol/L）誘導(dǎo)表達(dá) 16 h。

1.2.3NcoI 重組蛋白及其硒代蛋白的分離純化收集發(fā)酵菌體，用裂解緩沖液（25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，300 mmol/L NaCl） 重懸菌體并進(jìn)行高壓破碎，然后在 4 ℃下于14 000 r/min 離心30 min，收集上清液。 上清液經(jīng)鎳親和層析法初步純化后，進(jìn)行SDS-PAGE 驗(yàn)證是否有目的蛋白質(zhì)表達(dá)條帶，然后用陰離子交換層析柱UniGel-80Q 進(jìn)一步純化。 最后蛋白質(zhì)經(jīng)HiLoad 16/60 Superdex 75pg 凝膠過(guò)濾預(yù)裝柱分離，收集相應(yīng)組分濃縮，進(jìn)行SDS-PAGE驗(yàn)證。 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度由Invitrogen Qubit 4 熒光計(jì)精準(zhǔn)測(cè)定。 整個(gè)純化過(guò)程需要低溫環(huán)境。

1.2.4NcoI 蛋白及其硒代蛋白的質(zhì)譜檢測(cè) 采用Agilent 6530 精確質(zhì)量四極桿飛行時(shí)間（Q-TOF）液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng) （美國(guó) Agilent Technologies 公司）對(duì)NcoI 重組蛋白（1.5 mg/mL）和其硒代蛋白（1.5 mg/mL）進(jìn)行分析鑒定。 HPLC 分離條件： 使用 Agilent Zorbax C18 色譜柱， 流動(dòng)相是V乙腈∶V水∶V甲酸為2.0∶98.0∶0.1，柱溫 40 ℃，流量 1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。 質(zhì)譜檢測(cè)條件：電噴霧正離子掃描（ESI+），離子源溫度325 ℃，毛細(xì)管電壓3.5 kV，每隔0.33 s采集一次圖譜，質(zhì)量掃描范圍m/z為680~1 140。 質(zhì)譜檢測(cè)由中國(guó)科學(xué)院武漢物理與數(shù)學(xué)研究所完成。

1.2.5NcoI 蛋白及其硒代蛋白的酶活檢測(cè) 取NcoI 蛋白（10 μg/μL）和硒代蛋白（10 μg/μL）各1 μL，均以 0.3 μg λDNA 為底物，使用 CutOne 緩沖液（莫納（武漢）生物科技有限公司）配制成20 μL反應(yīng)體系，37 ℃溫育15 min， 隨即高溫失活，1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)底物的酶切結(jié)果。

1.2.6NcoI 蛋白及其硒代蛋白結(jié)晶條件初篩 利用坐滴法對(duì)10 種蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選試劑盒（Crystal Screen HR2-112、Crystal Screen Lite HR2-128、Crystal Screen HR2-110、Crystal Screen 2 HR2-112、Index-HR2-144、StatRx-HR2-107、SaltRx 2-HR2 -109、Natrix -HR2 -116、PEGRx1 -HR2 -082、PEGRx2-HR2-084）進(jìn)行初篩。NcoI 重組蛋白（純度＞95%）濃縮至10 mg/mL，將蛋白質(zhì)溶液與結(jié)晶試劑按1∶1 比例混合，置于20 ℃恒溫晶體生長(zhǎng)拍照儀中，每隔12 h 拍照記錄晶體生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)載體構(gòu)建

限制性?xún)?nèi)切酶NcoI 特異性識(shí)別和切割CCATGG 位點(diǎn)，因此在大腸桿菌中重組表達(dá)會(huì)嚴(yán)重?fù)p害宿主DNA。 為避免重組表達(dá)的NcoI 蛋白質(zhì)對(duì)宿主的傷害， 同時(shí)表達(dá)了NcoI 的甲基化酶（NcoIM）， 可以識(shí)別并甲基化NcoI 的切割位點(diǎn)，被甲基化的DNA 特異性識(shí)別位點(diǎn)受到保護(hù)， 從而避免限制性?xún)?nèi)切酶的切割。在載體pET-28b 上同時(shí)構(gòu)建了NcoI 編碼基因和NcoIM 編碼基因，NcoI 編碼基因N 端帶有6×His 標(biāo)簽序列，見(jiàn)圖1。將構(gòu)建成功的 pET-28b（+）-NcoI 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）pLysS 以及甲硫氨酸缺陷型菌株B834（DE3）pLysS 感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序確定序列正確后，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

圖 1 pET-28b（+）-NcoI 質(zhì)粒圖譜Fig. 1 Schematic map of pET-28b（+）-NcoI plasmid

2.2 NcoI 重組蛋白的表達(dá)和純化

將構(gòu)建成功的重組表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)熱激轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入 BL21（DE3）pLysS 感受態(tài)菌株中，然后涂布于卡那霉素和氯霉素雙抗性的LB 平板上，37 ℃下倒置培養(yǎng)12 h 后，隨機(jī)挑選若干單克隆進(jìn)行目的蛋白質(zhì)的小量表達(dá)試驗(yàn)。 通過(guò)構(gòu)建的重組蛋白質(zhì)的氨基酸序列預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量，限制性?xún)?nèi)切酶NcoI 重組蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為34 500，SDSPAGE 檢測(cè)不同條件下蛋白質(zhì)的表達(dá)情況及表達(dá)量。 結(jié)果顯示，NcoI 重組蛋白在 16 ℃、0.5 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)能獲得最多的可溶性蛋白質(zhì)，且蛋白質(zhì)大小與預(yù)期一致，后續(xù)以此條件進(jìn)行蛋白質(zhì)的大量表達(dá)，見(jiàn)表1。

表1 不同誘導(dǎo)條件下每升發(fā)酵產(chǎn)物NcoI 重組蛋白的表達(dá)量Table 1 Expression of recombinant protein NcoI per liter of fermentation product under different induction conditions

破碎后菌液上清液通過(guò)鎳親和層析后，經(jīng)SDS-PAGE 分析，目的蛋白質(zhì)存在于200 mmol/L 咪唑洗脫組分中，純度約80%，見(jiàn)圖2（a）。將含有目的蛋白質(zhì)的組分進(jìn)行透析除去咪唑，樣品通過(guò)陰離子交換層析柱UniGel-80Q 得到了純度約90%的目的蛋白質(zhì)，見(jiàn)圖2（b）。 濃縮樣品后通過(guò)分子篩凝膠層析和SDS-PAGE 進(jìn)行分析，所收集目的蛋白質(zhì)的純度超過(guò)95%，滿(mǎn)足蛋白質(zhì)結(jié)晶生長(zhǎng)條件，見(jiàn)圖2（c）、（d），純化后重組NcoI 酶質(zhì)量濃度約為7.5 mg/L。

圖2 重組NcoI 的表達(dá)與純化Fig. 2 Expression and purification of NcoI

2.3 NcoI 硒代蛋白的表達(dá)和純化

最常用硒代蛋白培養(yǎng)方法是利用甲氨酸缺陷型菌株，在培養(yǎng)基中引入硒代甲硫氨酸來(lái)置換重組蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸，其中大腸桿菌常用甲硫氨酸缺陷型菌株是B834[16]。 因此，作者先嘗試將構(gòu)建成功的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化導(dǎo)入B834（DE3）pLysS 感受態(tài)菌株中，并進(jìn)行目的蛋白質(zhì)的小量表達(dá)試驗(yàn)。 經(jīng)SDS-PAGE 檢測(cè)， 未發(fā)現(xiàn)NcoI 重組硒代蛋白 （Se-NcoI）的表達(dá)條帶，見(jiàn)圖 3（a）。 該實(shí)驗(yàn)表明，甲硫氨酸缺陷型菌株B834 不適合同時(shí)表達(dá)NcoI 重組蛋白和NcoIM 重組蛋白。 另外嘗試?yán)帽磉_(dá)NcoI 重組蛋白的相同菌株 BL21（DE3） pLysS-NcoI，僅在發(fā)酵過(guò)程中添加了硒代甲硫氨酸、異亮氨酸等多種氨基酸，期望在抑制大腸桿菌甲硫氨酸本底合成的同時(shí)可以更好地利用外源硒代甲硫氨酸，從而獲得硒代NcoI（Se-NcoI）蛋白質(zhì)。 對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的細(xì)胞裂解液進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳檢測(cè)， 發(fā)現(xiàn)NcoI 重組硒代蛋白可以高效表達(dá)，Se-NcoI 蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)3 個(gè)純化步驟：Ni 親和層析、 陰離子交換層析和分子篩凝膠層析，純度超過(guò)95%，Se-NcoI 蛋白酶質(zhì)量濃度約為 6 mg/L，見(jiàn)圖 3（b）、（c）。

圖3 重組Se-NcoI 的表達(dá)與純化Fig. 3 Expression and purification of Se-NcoI

重組蛋白的表達(dá)過(guò)程對(duì)外源添加的硒代甲硫氨酸的利用存在一定的概率，而且硒代甲硫氨酸對(duì)于大腸桿菌具有一定的毒性[17]，然而結(jié)果表明NcoI重組蛋白和Se-NcoI 蛋白酶濃度差別不大， 因此需要測(cè)定Se-NcoI 蛋白質(zhì)中硒代甲硫氨酸的取代率。

2.4 重組NcoI 蛋白質(zhì)及其硒代蛋白的質(zhì)譜檢測(cè)

利用飛行質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)， 對(duì)重組NcoI 蛋白和Se-NcoI 蛋白進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定， 從而檢測(cè)Se-NcoI 蛋白質(zhì)中甲硫氨酸是否被硒代甲硫氨酸取代。對(duì)重組NcoI 蛋白和Se-NcoI 蛋白進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，見(jiàn)圖4。 將所得數(shù)據(jù)按照如下公式計(jì)算出蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量。

式中：X1與X2為相鄰的質(zhì)荷比，且X2＞X1。

經(jīng)計(jì)算，重組NcoI 蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為34 510，與NcoI 理論相對(duì)分子質(zhì)量 34 500 相符。 重組Se-NcoI 蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為34 744，與NcoI 蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量差為234。 已知硒元素相對(duì)原子質(zhì)量為78.96，硫元素相對(duì)原子質(zhì)量為32.065，因此平均每分子Se-NcoI 蛋白質(zhì)中被硒原子取代的硫原子數(shù)量為 234/（78.96-32.065）=4.99。 由于重組NcoI蛋白質(zhì)的氨基酸序列中含有5 個(gè)甲硫氨酸，每個(gè)甲硫氨酸殘基包含1 個(gè)硫原子，可以推測(cè)本批Se-NcoI蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸已經(jīng)全部被硒代甲硫氨酸取代，適合進(jìn)行后續(xù)的反常散射實(shí)驗(yàn)。

2.5 NcoI 蛋白質(zhì)及其硒代蛋白的酶活檢測(cè)

在獲得重組NcoI 以及Se-NcoI 蛋白質(zhì)之后，分別對(duì)其進(jìn)行酶活力檢測(cè)，以驗(yàn)證硒代蛋白是否與野生型蛋白質(zhì)具有相同的生物學(xué)功能。 分別用10 μgNcoI 和 10 μg Se-NcoI 蛋白對(duì) 0.3 μg λDNA 進(jìn)行15 min 快速酶切。 瓊脂糖凝膠電泳均能顯示出明顯的特征酶切條帶，見(jiàn)圖 5（a）。 這與 Thermo Fisher 公司網(wǎng)址中公布的NcoI 特征酶切條帶相似， 見(jiàn)圖5（b），表明被完全硒代的Se-NcoI 蛋白質(zhì)與野生型蛋白質(zhì)具有相似的生物學(xué)活性，即硒代并不影響NcoI蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。

圖 4 NcoI 和 Se-NcoI 質(zhì)譜圖Fig.4 Serum mass spectrometry of NcoI and Se-NcoI

圖5 NcoI 與Se-NcoI 的酶切活力驗(yàn)證Fig. 5 Digestion activity of NcoI and Se-NcoI

2.6 NcoI 蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選

將重組NcoI 蛋白和 Se-NcoI 蛋白濃縮至10 mg/mL，在20 ℃下通過(guò)坐滴法，采用10 種蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑盒篩選了528 種結(jié)晶生長(zhǎng)條件。 樣品點(diǎn)樣后觀(guān)察，NcoI 在4 種條件下形成了初步的晶體。其中條件 a 為 0.1 mol/L 三水合醋酸鈉 （pH 4.6）、2.0 mol/L 甲酸鈉； 條件 b 為 0.1 mol/L 檸檬酸（pH 3.5）、25 g/dL PEG 3350； 條件 c 為 0.2 mol/L 硫酸銨、0.1 mol/L BIS-TRIS（pH 6.5）、 25 g/dL PEG3350；條件 d 為 0.8 mol/L 琥珀酸（pH 7.0）。 其中條件 a、b和c 下生長(zhǎng)出的NcoI 蛋白質(zhì)晶體呈針狀， 見(jiàn)圖6（a）、（b）、（c），條件 d 下生長(zhǎng)出的蛋白質(zhì)晶體呈顆粒狀，見(jiàn)圖 6（d），而 Se-NcoI 蛋白質(zhì)在此條件下未形成結(jié)晶。

圖6 NcoI 的結(jié)晶條件的篩選Fig.6 Initial screening of crystallization conditions of NcoI

條件b 和c 得到的單晶脆弱，因此無(wú)法撈取完整晶體。 條件d 得到的單晶分辨率差，低于0.8 nm。條件a 得到的單晶獲得衍射圖樣見(jiàn)圖7， 晶體存在明顯各向異性，一個(gè)方向大約在0.36 nm，另一個(gè)方向大約在0.8~1 nm，需進(jìn)一步優(yōu)化。

圖7 重組NcoI X-射線(xiàn)衍射圖Fig. 7 X-ray diffraction image of NcoI

3 討 論

目前， 限制酶NcoI 在PDB 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)里沒(méi)有找到同源結(jié)構(gòu)， 若通過(guò)X-射線(xiàn)晶體衍射的方法解析NcoI 結(jié)構(gòu)，除了需要獲得NcoI 的晶體，還需利用NcoI 同源結(jié)構(gòu)、同晶置換或者多波長(zhǎng)散射的方法進(jìn)行NcoI 的結(jié)構(gòu)解析。通過(guò)在大腸桿菌中表達(dá)硒代甲硫氨酸取代甲硫氨酸的重組蛋白質(zhì)[18]，結(jié)合多波長(zhǎng)反常散射（MAD）的方法經(jīng)過(guò)X 射線(xiàn)衍射可以收集到異常散射原子的邊緣及其附近的數(shù)據(jù)，能夠快速準(zhǔn)確測(cè)定產(chǎn)生的相位角[19]，從而進(jìn)行NcoI 的結(jié)構(gòu)解析。

限制性?xún)?nèi)切酶NcoI 對(duì)大腸桿菌體內(nèi)普遍存在的 DNA 甲基化酶基因dam和dcm均不敏感，若BL21（DE3）pLysS 菌株中只表達(dá)NcoI 重組蛋白，那么宿主DNA 會(huì)被NcoI 蛋白質(zhì)嚴(yán)重破壞。而NcoI 對(duì)應(yīng)的甲基化酶NcoIM 基因與限制性?xún)?nèi)切酶基因共表達(dá)，能夠使宿主DNA 獲得甲基化保護(hù)，從而實(shí)現(xiàn)了重組NcoI 的大量表達(dá)。

作者發(fā)現(xiàn)甲硫氨酸缺陷型菌株B834 不適合同時(shí)表達(dá)NcoI 重組蛋白和NcoIM 重組蛋白。 這可能是B834 菌株中的基因型影響了NcoI 重組蛋白或者NcoIM 重組蛋白的表達(dá)。 有研究表明，高濃度的異亮氨酸、賴(lài)氨酸和蘇氨酸能抑制天冬氨酸激酶活性，從而遏制大腸桿菌自身合成甲硫氨酸，且苯丙氨酸在此過(guò)程中起到協(xié)同作用[20]。因此，嘗試?yán)猛瑯颖磉_(dá)NcoI 重組蛋白的菌株BL21 （DE3） pLysSNcoI，僅在發(fā)酵過(guò)程中添加了硒代甲硫氨酸、異亮氨酸等多種氨基酸，期望在抑制大腸桿菌甲硫氨酸本底合成的同時(shí)， 可以更好地利用外源硒代甲硫氨酸，從而獲得硒代NcoI（Se-NcoI）蛋白質(zhì)。 經(jīng)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，硒代蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量與未硒代蛋白相差234， 符合硒原子取代5 個(gè)硫原子所增加的相對(duì)分子質(zhì)量。 因此判斷Se-NcoI 蛋白質(zhì)中的5 個(gè)甲硫氨酸全部被硒代甲硫氨酸取代。 盡管硒代法適用于大多數(shù)原核表達(dá)的蛋白質(zhì)，但是硒代甲硫氨酸容易氧化，并且會(huì)取代能夠增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的甲硫氨酸，導(dǎo)致硒代蛋白活性降低[21]。 作者對(duì)NcoI 及其硒代蛋白進(jìn)行酶活驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)NcoI 及其硒代蛋白都能消化底物λDNA， 且二者活性類(lèi)似， 從而推測(cè)Se-NcoI 與NcoI 蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上類(lèi)似。 作者采用在普通菌株發(fā)酵培養(yǎng)基中添加硒代甲硫氨酸及相關(guān)氨基酸的實(shí)驗(yàn)方案， 能夠獲得完全硒代的NcoI 蛋白質(zhì)，無(wú)需特殊的甲硫氨酸缺陷型表達(dá)菌株，這也為獲得其他限制性?xún)?nèi)切酶硒代蛋白表達(dá)提供了參考。

X-ray 衍射法需要高質(zhì)量的蛋白質(zhì)晶體， 而且晶體的生長(zhǎng)與否依賴(lài)于蛋白質(zhì)純度的高低。 獲得蛋白質(zhì)結(jié)晶的關(guān)鍵步驟是經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)高效表達(dá)以及分離純化出純度大于95%的蛋白質(zhì)，但是蛋白質(zhì)結(jié)晶條件的初步篩選沒(méi)有規(guī)律，一般需要蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選試劑盒進(jìn)行高通量篩選[22]。 作者使用了10種蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑盒，共計(jì)528 個(gè)條件，對(duì)NcoI 的蛋白質(zhì)結(jié)晶條件進(jìn)行了初篩，所得NcoI 晶體衍射的分辨率為0.8 nm 左右。分辨率低可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)穩(wěn)定性較差， 或者均一性差。 后續(xù)將進(jìn)一步優(yōu)化NcoI 的蛋白質(zhì)構(gòu)建和結(jié)晶條件， 篩選NcoI 的DNA配體， 并在此基礎(chǔ)上繼續(xù)進(jìn)行硒代Se-NcoI 的晶體生長(zhǎng)，進(jìn)一步精細(xì)優(yōu)化條件，以獲得能產(chǎn)生良好衍射效果的蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合物晶體，解析NcoI 的三維結(jié)構(gòu)， 以闡明NcoI 特異性識(shí)別并切割DNA 的機(jī)制。

4 結(jié) 語(yǔ)

作者利用限制性?xún)?nèi)切酶NcoI 和甲基化酶NcoIM 的大腸桿菌共表達(dá)體系， 獲得了大量表達(dá)的限制性?xún)?nèi)切酶NcoI， 其純度＞95%， 酶質(zhì)量濃度為7.5 mg/mL。 同時(shí)，通過(guò)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基M9 中添加高濃度的異亮氨酸、賴(lài)氨酸和蘇氨酸等，抑制大腸桿菌自身合成甲硫氨酸， 提高硒代甲硫氨酸的利用率，獲得了重組NcoI 硒代蛋白。 另外，NcoI 的完全硒代對(duì)活性無(wú)影響。通過(guò)結(jié)晶條件初篩得出NcoI 的蛋白質(zhì)結(jié)晶條件，初步獲得衍射分辨率為0.8 nm 的NcoI 晶體，為后續(xù)分析結(jié)構(gòu)活性位點(diǎn)、闡明分子機(jī)制、進(jìn)行定向改造、獲得高效和無(wú)星號(hào)活性的突變蛋白質(zhì)奠定基礎(chǔ)。