曾松榮， 龐彥韜， 柯 野， 何璐娜， 劉玉萍

（韶關(guān)學(xué)院 英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 韶關(guān)512005）

大豆肽通常是以大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）為原料，在最適溫度和 pH 下進(jìn)行蛋白酶解反應(yīng)后所獲得的小分子肽類經(jīng)加工精制生產(chǎn)出的活性短肽類產(chǎn)品。如果將大豆分離蛋白（SPI）直接應(yīng)用于食品工業(yè)中，制造出來(lái)的產(chǎn)品就不易被吸收。 因此，先將其水解為短肽，再應(yīng)用于食品的生產(chǎn)中，這樣的產(chǎn)品不僅有利于消化吸收，而且還可以使大豆肽的生物學(xué)功能得以充分發(fā)揮，提高其附加值。 酶水解法是目前生產(chǎn)大豆肽的主要方法，隨著大量蛋白酶在活性肽制備中的應(yīng)用，微生物蛋白酶水解催化效率更高，且價(jià)格便宜，其中真菌來(lái)源的蛋白酶具備pH 適應(yīng)性廣、底物選擇性大等優(yōu)點(diǎn)，因此也非常適用于大豆肽的生產(chǎn)[1-2]。

醬油曲霉（Aspergillus sojae）可以產(chǎn)生多種運(yùn)送到胞外的蛋白酶，其中某些胞外蛋白酶可以水解植物蛋白， 這些蛋白酶大多為中性和堿性， 日本的Hayashi 等對(duì)其性質(zhì)做了研究， 發(fā)現(xiàn)醬油曲霉蛋白酶具有典型的肽鏈內(nèi)切酶特性，一般在消化蛋白質(zhì)時(shí)切斷肽鏈的8%~15%就終止反應(yīng)[3]。 在國(guó)內(nèi)，醬油曲霉已被廣泛用于生產(chǎn)傳統(tǒng)豆類發(fā)酵食品，對(duì)醬油曲霉的研究主要集中在其蛋白酶學(xué)性質(zhì)方面，而利用其重組蛋白酶法制備大豆肽鮮見報(bào)道。

作者所在實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建好的醬油曲霉重組堿性蛋白酶畢赤酵母（Pichia pastoris）工程菌株來(lái)表達(dá)醬油曲霉重組堿性蛋白酶（rAp），以大豆分離蛋白（SPI）為底物經(jīng)酶解后得到大豆分離蛋白重組蛋白酶水解肽（以下簡(jiǎn)稱大豆肽），然后探討這些大豆肽對(duì)小鼠免疫功能及抗氧化能力的影響，為大豆的高值化利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 小鼠、飼料與菌株來(lái)源 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠（Musmusculus）： 購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；飼養(yǎng)小鼠的普通飼料：購(gòu)自沈陽(yáng)市于洪區(qū)前民動(dòng)物實(shí)驗(yàn)飼料廠；醬油曲霉重組堿性蛋白酶（rAp）畢赤酵母工程菌株：韶關(guān)學(xué)院英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，-80 ℃冰箱保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）BMGY 液體培養(yǎng)基：蛋白胨2 g/dL，酵母粉1 g/dL， 甘油體積分?jǐn)?shù)1%， 采用0.1 mol/L 的 pH 6.0磷酸鹽緩沖液配制。

2）BMMY 液體培養(yǎng)基：蛋白胨2 g/dL，酵母粉1 g/dL， 甲醇體積分?jǐn)?shù)1%， 采用0.1 mol/L 的 pH 6.0磷酸鹽緩沖液配制。

1.1.3 生化與化學(xué)試劑 測(cè)定谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、過氧化氫酶（CAT）和丙二醛（MDA）的試劑盒：購(gòu)自南京建成科技有限公司；鎳柱親和層析預(yù)裝柱和Sephadex G-75 層析柱： 購(gòu)自BIORAD 公司；大豆分離蛋白（SPI）：購(gòu)自上海藍(lán)平實(shí)業(yè)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 重組堿性蛋白酶 （rAp） 的誘導(dǎo)表達(dá)及純化將保藏于-80 ℃冰箱的醬油曲霉重組堿性蛋白酶畢赤酵母 （Pichia pastoris） 工程菌株活化后， 接種于BMGY 液體培養(yǎng)基中。 180 r/min、28 ℃搖瓶振蕩恒溫培養(yǎng)24 h 后，將菌液無(wú)菌離心、洗滌，取其菌體重懸于BMMY 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，30 ℃繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)，每隔24 h 添加BMMY 培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)1%的甲醇對(duì)工程菌株進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)7 d 后離心收集發(fā)酵液，采用Folin 酚法測(cè)定發(fā)酵液中rAp 的酶活[4]。 酶活單位的定義為：在40 ℃下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1 個(gè)酶活力單位。

在發(fā)酵液中添加固體硫酸銨80 g/dL，4 ℃放置過夜后，8 000 r/min 離心10 min, 收集蛋白質(zhì)沉淀，采用蒸餾水溶解蛋白質(zhì)沉淀后，利用鎳柱親和層析對(duì)rAp 進(jìn)行分離純化， 采用不同濃度的洗脫液進(jìn)行洗脫，收集含有100 mmol/L 咪唑的洗脫液，對(duì)洗脫液超濾濃縮后， 利用Sephadex G-75 層析柱進(jìn)行層析，收集洗脫液，超濾濃縮，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）初步鑒定rAp，蛋白質(zhì)印跡（Westernblotting）做進(jìn)一步鑒定，保存酶液備用。

1.2.2 利用rAp 制備大豆肽 用0.01 mol/L Gly-NaOH 緩沖液（pH 10）配置質(zhì)量濃度為 7.0 g/dL 的大豆分離蛋白（SPI）溶液，在95 ℃以上的水浴中處理15 min，冷卻后調(diào)至pH 10，按酶/底物比為3 000 U/g 添加純化的rAp 后，在40 ℃保溫水解1 h，水解期間不定時(shí)攪拌，水解完成后將含有大豆肽的酶解液 pH 值調(diào)為 7.2[5-6]。

1.2.3 大豆分離蛋白（SPI）的酶解情況鑒定試驗(yàn)

1）大豆肽的分離：將上述大豆分離蛋白（SPI）的rAp 水解液調(diào)至pH 4.2 進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀，于12 000 r/min 離心15 min，取上清液，再經(jīng)抽濾裝置進(jìn)行抽濾，得到澄清的水解液，即為重組蛋白酶水解產(chǎn)物大豆肽溶液。

2）大豆分離蛋白酶解情況初步鑒定：制備質(zhì)量濃度為5 g/dL 的濃縮膠，12 g/dL 的分離膠， 再經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳、染色、脫色和觀察，拍照記錄結(jié)果。

1.2.4 對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的處理及飼養(yǎng) 選取合格小鼠40 只，隨機(jī)分為兩組（實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組），每組20 只。對(duì)每只小白鼠進(jìn)行打耳標(biāo)編號(hào)標(biāo)記，稱量體質(zhì)量并一一對(duì)應(yīng)編號(hào)記錄，體質(zhì)量記為W0。 其中實(shí)驗(yàn)組參照小鼠體質(zhì)量以2 mg/g 的劑量灌胃由rAp 酶解得到的大豆分離蛋白（SPI）水解液；對(duì)照組直接灌胃等劑量的由未加酶水解液制備得到的大豆分離蛋白水溶液。 在每天同一時(shí)間灌胃一次，連續(xù)灌胃30 d后對(duì)其禁食24 h，然后對(duì)小鼠采用眼球采血法收集血液， 置于已編號(hào)的離心管中用于小鼠血清的制備。 采用頸椎脫臼法處死小鼠，隨后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組對(duì)小鼠免疫功能和抗氧化能力的研究。

1.2.5 大豆肽對(duì)小鼠免疫功能的影響

1）小鼠免疫器官指數(shù)的測(cè)定：將供試小鼠眼球取血前稱體質(zhì)量，取血后頸椎脫臼法處死，取出胸腺和脾臟等免疫器官， 濾紙吸干水分后分別稱質(zhì)量，計(jì)算免疫器官指數(shù)[7-8]。

免疫器官指數(shù)=臟器質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

2）小鼠血清溶菌酶活性的測(cè)定：受試小鼠連續(xù)灌胃30 d，末次灌胃結(jié)束后24 h 采用摘除眼球采血法取血，于 4 ℃、2 000 r/min 離心 15 min，取上清液作為待測(cè)血清備用。

采用牛肉膏蛋白胨瓊脂雙層平板法培養(yǎng)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），采用上層混菌法，待上層培養(yǎng)基凝固后，在上層平板打孔，將200 μL 小鼠血清點(diǎn)樣于瓊脂平板的小孔中， 每組中每個(gè)小鼠血清點(diǎn)樣3 個(gè)孔，置37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定溶菌圈的直徑[9]。

3） 小鼠血清抗菌活力的測(cè)定： 以大腸桿菌（Escherichia coli）為受試菌株，用生理鹽水緩沖液配制成一定濃度的菌懸液 （OD600=0.282）。 取5 mL菌懸液與100 μL 的上述血清混勻，于600 nm 處測(cè)定光密度值A(chǔ)1[9]；然后置于37 ℃培養(yǎng)30 min，再于600 nm 處測(cè)定光密度值A(chǔ)2。

血清抗菌活力=（A1-A2）/A1。

1.2.6 大豆肽對(duì)小鼠抗氧化性的影響 受試小鼠連續(xù)灌胃30 d 后處死，分離血清，按照各試劑盒說(shuō)明書的操作方法檢測(cè)小鼠血清中過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）的水平[10-11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 rAp 的誘導(dǎo)表達(dá)純化結(jié)果

通過對(duì)rAp 工程菌株的培養(yǎng)和添加甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，采用Folin-酚法測(cè)定發(fā)酵液中蛋白酶的酶活，然后對(duì)發(fā)酵液中蛋白質(zhì)進(jìn)行鹽析、親和層析和分子篩層析后，SDS-PAGE 電泳獲得較為單一的蛋白質(zhì)條帶，見圖1。該蛋白質(zhì)條帶與rAp 的基因序列推導(dǎo)的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量35 000 基本一致。 Western blotting 分析結(jié)果顯示，該純化的目的蛋白質(zhì)條帶可以被His 標(biāo)簽抗體識(shí)別，大小為35 000 左右，見圖2。試驗(yàn)結(jié)果表明，rAp 被工程菌株成功誘導(dǎo)表達(dá)，并且通過純化鑒定后獲得了目的重組蛋白酶rAp。

圖1 rAp 的純化SDS-PAGE 電泳圖Fig. 1 SDS-PAGE of the purified rAp

2.2 rAp 水解大豆分離蛋白質(zhì)的結(jié)果

對(duì)大豆分離蛋白 （SPI） 進(jìn)行95 ℃以上預(yù)處理后，利用rAp 對(duì)其在40 ℃酶解1 h，進(jìn)一步將酶解液離心去掉沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，見圖3。

由圖3 可知，大豆分離蛋白中35 000 以上的大分子蛋白質(zhì)基本都被rAp 水解，并且被水解后的大豆分離蛋白中相對(duì)分子質(zhì)量大于18 400 以上具有明顯條帶的蛋白質(zhì)僅有3 條，這表明大豆分離蛋白被rAp 水解成小分子蛋白質(zhì)，并且多數(shù)可能被水解為小肽。

圖 2 rAp 的 Western blotting 鑒定Fig. 2 Western blotting analysis of the rAp

圖3 rAp 對(duì)大豆分離蛋白的水解產(chǎn)物的電泳圖Fig. 3 SDS-PAGE of soybean peptides from soybean protein isolate hydrolyzed by rAp

2.3 大豆肽對(duì)小鼠免疫功能的影響結(jié)果

2.3.1 大豆肽對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響 大豆肽對(duì)小鼠體內(nèi)免疫器官指數(shù)的影響見表1。

表1 大豆肽對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響Table 1 Effect of soybean peptides on the immune organ indices in mice

由表1 可知，大豆肽對(duì)小鼠胸腺和脾臟指數(shù)分別為 0.1639 %、0.4682 %；與大豆分離蛋白（SPI）相比，未有顯著差異，這表明大豆肽對(duì)小鼠整體的免疫器官?zèng)]有明顯影響。

2.3.2 大豆肽對(duì)小鼠血清溶菌酶活性的影響 以金黃色葡萄球菌（S. aureus）作為受試菌株，大豆肽對(duì)小鼠血清溶菌酶活性試驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 小鼠血清溶菌酶活性試驗(yàn)Fig. 4 Serum lysozyme activities in mice

測(cè)量溶菌酶對(duì)金黃色葡萄球菌（S. aureus）的抑菌菌直徑見表2。

表2 大豆肽對(duì)小鼠血清溶菌酶活性的影響Table 2 Effect of soybean peptides on the serum lysozyme activity in mice

由表2 可知，在相同的濾紙片直徑下，灌胃由rAp 水解的大豆肽的小鼠血清具有明顯的抑菌作用，且抑菌圈直徑達(dá)到了1.4 cm。 由此可知，大豆肽有顯著提高小鼠血清溶菌酶活性的作用。

2.3.3 大豆肽對(duì)小鼠血清抗菌活力的影響 以大腸桿菌（E. coli）作為受試菌株，大豆肽對(duì)小鼠血清的抗菌活力影響見表3。

表3 大豆肽對(duì)小鼠血清抗菌活力影響Table 3 Effect of soybean peptides on the serum antibacterial activity in mice

由表3 可知，大豆肽的小鼠血清的抗菌能力達(dá)到28.58 %，顯著高于大豆分離蛋白（SPI）10.16%，表明大豆肽有顯著提高小鼠血清抗菌活力的作用。

2.4 大豆肽體內(nèi)抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

以大豆分離蛋白（SPI）做對(duì)照，大豆肽灌胃30 d 后檢測(cè)小鼠血清中過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）的活性以及丙二醛（MDA）水平，結(jié)果見表4。

表4 各組小鼠血清中GSH-PX、CAT、MDA 測(cè)定結(jié)果Table 4 Activities of GSH-PX，CAT and the contents of MDA in different mice serum

由表4 可以看出，與大豆分離蛋白（SPI）對(duì)照組相比，谷胱甘肽過氧化物酶GSH-PX 活性沒有顯著變化， 而CAT 活性顯著提高，MDA 濃度顯著降低。谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）作為細(xì)胞內(nèi)酶保護(hù)系統(tǒng)的主要成分之一，它和超氧化物歧化酶、過氧化氫酶一起能去除超氧陰離子自由基和H2O2，還原氫過氧化物，以減輕和阻斷脂質(zhì)過氧化作用，保護(hù)細(xì)胞免受過氧化損傷[12]。 但實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在增強(qiáng)小鼠血清中GSH-Px 活力方面無(wú)明顯改變。

細(xì)胞內(nèi)氫氧自由基（OH－）經(jīng)過一系列反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞有極強(qiáng)的破壞性，而這種氫氧自由基（OH－）能被過氧化氫酶分解，保證機(jī)體細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和細(xì)胞的正常生活。 CAT 值越高，分解過氧化氫能力越強(qiáng)，機(jī)體的抗氧化能力就越高。 實(shí)驗(yàn)組小鼠血清CAT 值較高，表明大豆肽可以提高小鼠體內(nèi)的CAT值，從而增強(qiáng)小鼠的體內(nèi)抗氧化性。

體內(nèi)MDA 濃度反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，MDA 濃度越高，受自由基攻擊越嚴(yán)重[13-14]。實(shí)驗(yàn)組小鼠體內(nèi)MDA 濃度較少， 說(shuō)明該組小鼠體內(nèi)細(xì)胞受自由基攻擊最少，其體內(nèi)的抗氧化性較高。

3 討 論

酶的選擇和酶解條件是大豆肽制備的關(guān)鍵，目前商業(yè)用酶主要是微生物酶（酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶及復(fù)合酶）、植物蛋白酶及少量的動(dòng)物蛋白酶。 通過這些特異性蛋白酶的作用，可以形成大小不等的多種活性肽。 已經(jīng)證明，不同的大豆活性肽具有抗高血壓、抗氧化、抗癌、降血脂、減肥、抗病毒及抑菌等生理保健功能[15]。 Stephen 等利用大豆肽對(duì)大腸桿菌（E. coli）、金黃色葡萄球菌（S.aureus）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）和白色念珠菌（Candida albicans）等進(jìn)行抗菌活性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，從大豆中提取的活性肽（PGTAVFK）能夠顯著抑制這些病原微生物的生長(zhǎng)，推測(cè)大豆肽抗菌活性可能與大豆肽中氨基酸帶電性及疏水性有關(guān)，從而表現(xiàn)出抑菌性[16]，該結(jié)果與本研究的抑菌結(jié)果基本一致。

對(duì)具有抗氧化活性的多肽而言，其氨基酸序列和結(jié)構(gòu)對(duì)其抗氧化功能起著基礎(chǔ)性的作用。 有研究表明，其抗氧化性與氨基酸組成如酪氨酸殘基或者氫鍵網(wǎng)絡(luò)性具有直接相關(guān)性，但其抗氧化機(jī)制仍不是十分清楚[17]。對(duì)于大豆肽的抗氧化性，也與其氨基酸組成和序列密切相關(guān)，如富含色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等殘基的大豆肽具有較強(qiáng)的抗氧化性[18-19]。作者利用rAp 制備的大豆肽，由于重組蛋白酶對(duì)底物P1 位點(diǎn)具有苯丙氨酸類疏水性的氨基酸殘基底物具有偏好性[20]，表明本研究獲得的大豆肽的序列中富含苯丙氨酸，這可能是其具有較強(qiáng)抗氧化性的原因之一。 在本研究中，大豆肽提高了小鼠血清的抗氧化性和抗菌性，這可能是由于大豆肽這些小分子肽類不需進(jìn)一步降解就可直接被機(jī)體吸收進(jìn)入血清，提高了血清的抗氧化性和抗菌能力[21-22]，但其具體的機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 語(yǔ)

作者對(duì)醬油曲霉重組堿性蛋白酶（rAp）畢赤酵母工程菌株進(jìn)行了活化、 搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化。 通過SDS-PAGE 電泳進(jìn)行初步鑒定，在35 000位置獲得單一的蛋白質(zhì)條帶，與預(yù)期的重組rAp 相對(duì)分子質(zhì)量大小一致，表明醬油曲霉重組堿性蛋白酶（rAp）已成功得到表達(dá)和純化鑒定。

利用上述已分離純化的醬油曲霉重組堿性蛋白酶（rAp）水解大豆分離蛋白制備大豆肽，將大豆肽灌胃小鼠，然后探究這些大豆肽對(duì)小鼠免疫功能及抗氧化能力的影響。 在大豆肽對(duì)小鼠免疫功能的影響方面，盡管由重組醬油曲霉蛋白酶（rAp）水解大豆分離蛋白所得到的大豆肽與大豆分離蛋白（SPI）對(duì)照組相比，對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)沒有明顯影響， 但顯著提高了血清抗菌能力和血清溶菌酶活性， 表明大豆肽對(duì)小鼠有顯著的免疫增強(qiáng)活性；在大豆肽的體內(nèi)抗氧化驗(yàn)證試驗(yàn)方面，重組醬油曲霉蛋白酶（rAp）水解大豆分離蛋白所得到的大豆肽與大豆分離蛋白（SPI）對(duì)照組相比，盡管二者在GSHPx 活性影響方面無(wú)明顯差別，但實(shí)驗(yàn)中的大豆肽可使CAT 的活性顯著提高、MDA 濃度顯著降低，表明大豆肽與對(duì)照組相比可顯著提高小鼠的抗氧化性。綜上所述，醬油曲霉重組堿性蛋白酶（rAp）水解大豆分離蛋白獲得的大豆活性肽能在較大程度上增強(qiáng)小鼠機(jī)體的免疫功能和抗氧化活性，這些生理活性在營(yíng)養(yǎng)、化妝品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊。