鄧 晨 ， 李 琳 ， 張林威 ， 程云輝 ， 陳茂龍 ， 許 宙 *

（1. 長沙理工大學(xué) 化學(xué)與食品工程學(xué)院， 湖南 長沙 410114； 2. 上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院， 上海200093）

鎘（Cd）是一種重要的金屬元素，常被應(yīng)用于顏料、電池、電鍍和熒光涂料加工等領(lǐng)域，因此廣泛分布于空氣、水、土壤等環(huán)境中[1]。同時(shí)，Cd 作為一種潛在的有毒重金屬元素，可通過食物鏈進(jìn)入人體引起慢性中毒，對(duì)人體的腎臟、肝臟、心血管、神經(jīng)等方面都有損害[2-5]，嚴(yán)重威脅到了人類健康，已被列為環(huán)境與食品污染的主要公害之一[6]。 世界衛(wèi)生組織規(guī)定，飲用水中 Cd2+的限量標(biāo)準(zhǔn)為 3 μg/L[7]。 為了控制環(huán)境污染物，保證人類生活質(zhì)量，探索一種高效的Cd2+分析方法具有重要意義。 目前常用的重金屬檢測(cè)方法主要有原子吸收光譜法[8-9]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[10]、表面增強(qiáng)拉曼光譜法[11]等。 這些檢測(cè)方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)重金屬Cd 的高靈敏度分析， 但常需要專業(yè)人員操作，而且成本較高，樣品預(yù)處理復(fù)雜耗時(shí)。 因此，迫切需要建立一種方便快捷、低成本、高靈敏度的Cd2+快速檢測(cè)方法。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）是一種均相分析檢測(cè)技術(shù)，其概念最早是由F?rster 于1948 年提出的。 他提出在滿足兩個(gè)熒光基團(tuán)的空間距離在1~10 nm 之間，并且熒光能量供體的發(fā)射光譜和熒光能量受體的吸收光譜存在重疊的前提下，如果用入射光激發(fā)供體，供體能量就可以傳遞給受體[12]。 上轉(zhuǎn)換納米顆粒 （upconversion nanoparticles，UCNPs）的低能量長波經(jīng)近紅外光照射后可以變?yōu)楦吣芰慷滩╗13]，可作為一種理想的FRET 體系的能量供體； 同時(shí)金納米顆粒（gold nanoparticles，AuNPs） 因其可見光吸收范圍寬、猝滅效率和消光系數(shù)較高的特點(diǎn)而被廣泛用作FRET 體系的能量受體[14]。因此，UCNPs 與 AuNPs 可構(gòu)成FRET 體系。

本研究基于 UCNPs 和 AuNPs 間的FRET 機(jī)制和抗原抗體的識(shí)別作用構(gòu)建了Cd2+的免疫檢測(cè)平臺(tái)。 UCNPs 和 AuNPs 通過 Cd-抗原、Cd-抗體組裝在一起時(shí)，發(fā)生FRET 過程，導(dǎo)致UCNPs 熒光猝滅；當(dāng)體系中目標(biāo)物Cd2+存在時(shí)， 會(huì)與Cd-抗原特異性競(jìng)爭(zhēng)Cd-抗體，使組裝體分散，抑制FRET 過程，熒光強(qiáng)度與Cd2+濃度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)， 從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Cd2+的快速定量檢測(cè)。該方法具有操作簡便、靈敏度高、成本較低的特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試劑

六水合氯化釔（YCl3·6H2O）、聚丙烯酸（PAA）、六水合氯化鐿（YbCl3·6H2O）、油酸（OA）、六水合氯化鉺（ErCl3·6H2O）、1-十八烯（ODE）：購于北京百靈威科技有限公司；1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽 （EDC）、 硫代羥基琥珀酰亞胺（sulfo-NHS）： 購于上海麥克林生化科技有限公司；氫氧化鈉、氟化銨、檸檬酸三鈉、氯金酸、磷酸氫二鈉、 磷酸二氫鈉，4-（2-羥乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）：購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉、氯化鉀：購于廣東光華科技股份有限公司。

1.2 儀器

MDL-Ⅲ-980-2W 型激光發(fā)射器： 中國長春新產(chǎn)品光電技術(shù)有限公司生產(chǎn)；F96PRO 型熒光分光光度計(jì)： 上海棱光技術(shù)有限公司生產(chǎn)；ZNCL-TS 型磁力攪拌電熱套：河南鞏義市宏華儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)；JEOLJEM-2100 型透射電子顯微鏡：日本電子株式會(huì)社生產(chǎn)；UV-1800 型紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

利用Cd-抗原修飾的UCNPs 與Cd-抗體修飾的AuNPs 構(gòu)建基于FRET 體系的免疫檢測(cè)平臺(tái)。 當(dāng)檢測(cè)體系中沒有目標(biāo)物Cd2+時(shí)，F(xiàn)RET 過程致使UCNPs 的熒光被淬滅；當(dāng)檢測(cè)體系中有目標(biāo)物Cd2+時(shí)，F(xiàn)RET 程度降低，UCNPs 的熒光值增加。Cd2+質(zhì)量濃度越高，Cd-抗原修飾的UCNPs 與Cd-抗體修飾的AuNPs 結(jié)合得越少， 熒光強(qiáng)度越高。 通過建立Cd2+質(zhì)量濃度與熒光強(qiáng)度之間的線性關(guān)系即可實(shí)現(xiàn)Cd2+的定量檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)原理見圖1。

圖1 熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系檢測(cè)Cd2+原理圖Fig. 1 Schematic diagram of Cd2+detected by FRET

1.3.1 水溶性UCNPs 的制備 參照文獻(xiàn)[19]的報(bào)道來合成油溶性 UCNPs： 稱取 0.473 2 g YCl3·6H2O、0.156 0 g YbCl3·6H2O、0.015 0 g ErCl3·6H2O 于100 mL三頸燒瓶中，加入12 mL OA 和30 mL ODE，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于1 500 r/min 進(jìn)行攪拌的同時(shí)逐漸升溫至160 ℃，至混合物形成均一溶液后自然冷卻至室溫；準(zhǔn)確稱取0.260 0 g NaOH 和0.260 7 g NH4F 溶于10 mL 甲醇中，充分溶解混合，將溶液逐滴加入上述三頸燒瓶中，1 500 r/min 磁力攪拌30 min，隨后緩慢加熱至300 ℃以蒸發(fā)甲醇，并于氮?dú)獗Ｗo(hù)下繼續(xù)加熱1 h。 溶液自然冷卻后，用乙醇將其從溶液中沉淀出來，用乙醇和環(huán)己烷（體積比為5∶1）的溶液清洗3 次，烘干，即得油溶性UCNPs。

參照文獻(xiàn)[15]采用的配體交換法來制備水溶性UCNPs，油溶性UCNPs 在水中的分散性極差，故利用PAA 對(duì)該材料表面進(jìn)行修飾。 于20 mL 乙醇溶液和10 mL 氯仿溶液中分別加入10 mL PAA 和5 mL 油溶性UCNPs，再將兩種溶液混合攪拌24 h，乙醇清洗3 次后將得到的UCNPs 分散于水中。

1.3.2 AuNPs 的制備 AuNPs 采用檸檬酸三鈉還原氯金酸（HAuCl4）法[16]合成，步驟如下：在錐形瓶中加入 97.5 mL 超純水及 2.5 mL HAuCl4（10 mmol/L）溶液，攪拌至沸騰。 在沸騰7~8 min 后，于錐形瓶中加入2 mL 質(zhì)量濃度為1 g/dL 的檸檬酸三鈉溶液，待溶液變成酒紅色，繼續(xù)加熱10 min 后立即停止加熱。繼續(xù)攪拌15 min 后，取下錐形瓶，得到的酒紅色液體即為AuNPs。

1.3.3 能量供體探針的制備 用Cd-抗原對(duì)UCNPs 進(jìn)行功能化修飾制備能量供體探針。取1 mg水溶性 UCNPs 加到 0.1 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4） 中， 然后將混合液加到稱有 EDC、NHS 各0.2 mg 的錐形瓶中， 搖床孵育 15 min。 準(zhǔn)確量取0.01 mL Cd-抗原（0.2 mg/mL）溶于 2 mL PBS 緩沖液， 再加入之前的錐形瓶中，6 000 r/min 離心4 h。用PBS 緩沖液離心洗滌3 次，4 ℃下避光貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 能量受體探針的制備 用Cd-抗體對(duì)AuNPs進(jìn)行功能化修飾制備能量受體探針。 將Cd-抗體用硼酸鹽緩沖液（BB，pH 8.2）稀釋至 5 μmol/L，并用0.1 mol/L 碳酸鉀溶液將 0.5 mL AuNPs 溶液（2 nmol/L）的 pH 值調(diào)至 8.2，搖勻后加入 1 mL 抗體溶液（5 μmol/L）中，緩慢攪拌 50 min 后，在室溫下用 50 μL、10 g/dL 的 BSA 溶液封閉 2 h，于 7 000 r/min離心25 min，除去上清液，將沉淀物重懸于1 mL 含有5 g/dL 海藻糖的BB 溶液中供下一步使用。

1.3.5 螯合劑體系 Cd-抗體無法直接識(shí)別Cd2+，需先將Cd2+與EDTA 反應(yīng)生成螯合物， 才能與抗體結(jié)合。

50 mmol/L HEPES （pH 7.4）緩沖溶液的配制：將 HEPES （2.38 g，10 mmol）溶于 180 mL 去離子水中，搖晃至全溶，一邊攪拌一邊慢慢滴加0.1 mol/L的NaOH 溶液至pH 為7.4，然后用去離子水定容至200 mL。

螯合劑體系：將0.02~0.1 mol/L 的HEPES 緩沖液（pH 7.2~8）和 1 mmol/L 的 EDTA 按體積比 10∶1混合搖勻。取100 mL 的待測(cè)樣品液加到2 mL 錐形瓶中，并向錐形瓶中加入100 μL 終濃度為1 mmol/L 的螯合劑，室溫條件下?lián)u床孵育2 h。

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用超純水把1 mg/mL 的Cd2+標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋成各個(gè)梯度：0.1、0.2、0.5、1、5、10、50、100 ng/mL。于 500 μL UCNPs-抗原溶液中，分別加入10 μL 以上不同質(zhì)量濃度的Cd2+標(biāo)準(zhǔn)液，混合均勻，再加入500 μL AuNPs-抗體溶液，終體系中Cd2+的質(zhì)量濃度分別為：0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、5、10 ng/mL。 常溫下孵育 30 min 后，6 000 r/min 離心10 min 除去多余的AuNPs，并用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)543 nm 波長處的熒光強(qiáng)度。

1.3.7 特異性實(shí)驗(yàn) 分別配制10 ng/mL 的Cu2+、Hg2+、Zn2+、Pb2+、Co2+標(biāo)準(zhǔn)品溶液。 利用上述免疫檢測(cè)新方法測(cè)定熒光強(qiáng)度，通過比較，評(píng)價(jià)該Cd2+免疫傳感器的特異性。

1.3.8 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 對(duì)自來水樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。 將 0.1、1、10 ng Cd2+標(biāo)準(zhǔn)液分別添加到1 mL 自來水中，得到待測(cè)樣品溶液。 利用上述免疫檢測(cè)新方法檢測(cè)Cd2+濃度，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 功能化UCNPs 和功能化AuNPs 的表征

納米材料的分散性會(huì)直接影響到材料的功能化修飾與特異性競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的效果。 由圖 2（a）、（c）透射電鏡圖可看出， 制備的UCNPs、AuNPs 分散性較好，顆粒大小相對(duì)均勻，其平均粒徑分別為200、13 nm。 如圖 2（e）所示，功能化 AuNPs 和功能化UCNPs 順利組裝， 得到UCNPs-AuNPs 復(fù)合物的平均粒徑為250 nm，且滿足FRET 過程空間距離的要求。 材料的水合粒徑表征也再次證實(shí)了功能化UCNPs 和功能化 AuNPs 的順利組裝，圖 2（b）、（d）、（f）分別為功能化 UCNPs、功能化 AuNPs 和 UCNPs-AuNPs 復(fù)合物的水合粒徑圖，材料平均粒徑分別為227、60、302 nm，比透射電鏡表征結(jié)果略大，這是由于DLS 測(cè)得的結(jié)果是流體動(dòng)力學(xué)直徑[17]。

圖 2 UCNPs、AuNPs、UCNPs-AuNPs 復(fù)合物 的透射電 鏡和水合粒徑圖Fig. 2 The TEM and DLS images of UCNPs，AuNPs and UCNPs-AuNPs nanocomposites

2.2 UCNPs 與 AuNPs 的能量轉(zhuǎn)移

如圖3 所示，UCNPs 在 980 nm 激發(fā)光照射下的熒光發(fā)射光譜在 525、543、659 nm 附近有 3 個(gè)吸收峰，分別對(duì)應(yīng)摻雜 Er3+離子2H11/2→4I15/2（綠光區(qū)）、4S3/2→4I15/2（綠光區(qū)）和4F9/2→4I15/2（紅光區(qū)）的能級(jí)躍遷[18]。543 nm 處的發(fā)射峰表明，UCNPs 可作為 FRET體系中的能量供體， 而AuNPs 在520 nm 附近顯示出強(qiáng)而寬的吸收帶， 可作為能量受體或猝滅劑，且UCNPs 的熒光發(fā)射光譜與AuNPs 的紫外-可見光吸收光譜有較好的重疊， 說明UCNPs 和AuNPs 之間能發(fā)生FRET 過程。

圖3 UCNPs 的熒光發(fā)射光譜與AuNPs 的紫外-可見吸收光譜圖Fig. 3 Fluorescence spectra of UCNPs and UV -vis absorption spectra of AuNPs

2.3 工作曲線與檢出限

通過Cd2+與UCNPs-抗原競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合AuNPs-抗體來抑制FRET 過程，考察不同質(zhì)量濃度Cd2+對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響。 如圖4 所示，隨著Cd2+質(zhì)量濃度的增加，543 nm 波長處的熒光強(qiáng)度逐漸提高， 熒光強(qiáng)度與Cd2+質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。 如圖5 所示， 熒光強(qiáng)度與Cd2+的質(zhì)量濃度在0.01~10 ng/mL范圍內(nèi)存在線性關(guān)系：y=18.771 ln（x）+280.23（R2=0.993 8），檢測(cè)限為 0.01 ng/mL。如表 1 所示，與檢測(cè)Cd2+的其他方法比較，該方法的檢測(cè)限較低，具有一定的優(yōu)勢(shì)。

圖4 不同Cd2+質(zhì)量濃度反應(yīng)體系對(duì)應(yīng)的熒光發(fā)射光譜Fig. 4 Fluorescence spectra corresponding to different Cd2+concentrations reaction systems

圖5 Cd2+質(zhì)量濃度與543 nm 處的熒光信號(hào)強(qiáng)度的線性關(guān)系Fig. 5 Linear relationship between the fluorescence intensity and the Cd2+concentration at 543 nm

表1 幾種檢測(cè)Cd2+的方法比較Table 1 Comparison of several detection methods of Cd2+

2.4 特異性試驗(yàn)

選用 Cu2+、Hg2+、Zn2+、Pb2+、Co2+作為可能存在的共存重金屬離子進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，10 ng/mL的其他重金屬元素不能起到恢復(fù)反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度的作用，該Cd2+免疫檢測(cè)方法特異性良好，見圖6。

圖6 檢測(cè)不同重金屬離子的反應(yīng)體系在543 nm 處的熒光信號(hào)強(qiáng)度Fig. 6 Fluorescence signal intensity of reaction system at 543 nm when different heavy metal ions were detected

2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

選用自來水樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。 當(dāng)加標(biāo)水平為 0.1、1、10 ng/mL 時(shí)，回收率分別為109%、98%、101%。

表2 自來水樣品中Cd2+的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)（n=3）Table 2 Recovery results of added standard Cd2+in samples（n=3）

3 結(jié) 語

作者基于UCNPs 和AuNPs 間的 FRET 機(jī)制和抗原抗體的識(shí)別作用建立了一種Cd2+的免疫檢測(cè)新方法。 體系中的熒光強(qiáng)度信號(hào)值與Cd2+質(zhì)量濃度在0.05~20 ng/mL 的范圍內(nèi)呈線性正相關(guān)：y=18.771 ln（x）+280.23（R2=0.993 8），檢測(cè)限為 0.01 ng/mL。 將該方法用于實(shí)際樣品分析時(shí)可獲得較好的回收率，具有操作簡便、靈敏度高、成本較低的特點(diǎn)，有望用于水、土壤等環(huán)境中Cd2+的快速定量檢測(cè)。