柳羽哲，江澤沅，高 欣，曾 琦，王鈺盛，劉曉婷，閔偉紅

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118）

L-甲硫氨酸又稱L-蛋氨酸，于1923年被Mueller在分離酪蛋白過程中發(fā)現(xiàn)[1]，與L-賴氨酸、L-蘇氨酸及L-異亮氨酸同屬天冬氨酸族氨基酸是生命體必需的唯一含硫氨基酸[2]。在生物體內(nèi)L-甲硫氨酸具備重要生理生化功能，在DNA、蛋白質(zhì)合成、催化功能調(diào)節(jié)和蛋白質(zhì)翻譯后修飾等過程中發(fā)揮著不可或缺的作用[3]；作為合成前體和體內(nèi)代謝中間體發(fā)揮重要作用，參與乙烯和多胺類物質(zhì)合成，并參與細胞生長發(fā)育過程[4]；還可以經(jīng)過其代謝物S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）間接調(diào)節(jié)多種代謝過程，如作為甲基供體參與核酸、磷脂、蛋白質(zhì)、腎上腺素、褪黑素、肌酸和其他化合物的代謝合成[5]。L-甲硫氨酸的生產(chǎn)方法主要包括化學(xué)合成法、生物酶拆分法、微生物發(fā)酵法[6-7]。目前，工業(yè)化生產(chǎn)L-甲硫氨酸的主要方式為化學(xué)合成法——丙烯醛法[8]，但該方法產(chǎn)物為DL-混合型甲硫氨酸，存在分離困難、生產(chǎn)成本高、反應(yīng)復(fù)雜、副產(chǎn)物多以及工業(yè)污染較嚴重的問題。酶拆分法生產(chǎn)L-甲硫氨酸所需底物較為昂貴，產(chǎn)生污染排放較大，不適合商業(yè)化生產(chǎn)。利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-甲硫氨酸具有原料來源廣、環(huán)境友好且生產(chǎn)成本低的優(yōu)點[9]，目前隨著代謝工程策略及合成生物學(xué)工具的開發(fā)，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-甲硫氨酸外的其他天冬氨酸族氨基酸已實現(xiàn)工業(yè)化[2,10]。由于L-甲硫氨酸合成途徑存在復(fù)雜的反應(yīng)及多級調(diào)控機制，L-甲硫氨酸尚未實現(xiàn)大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)。研究人員及生產(chǎn)商將研究目標投向探究微生物發(fā)酵法替代化學(xué)合成法工業(yè)生產(chǎn)L-甲硫氨酸的可能性。獲得L-甲硫氨酸菌株的傳統(tǒng)方式是利用誘變篩選或基于代謝控制發(fā)酵原理構(gòu)建，但通過誘變獲得的菌株在工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)過程中容易出現(xiàn)發(fā)酵狀態(tài)不穩(wěn)定、菌體營養(yǎng)缺陷、生產(chǎn)水平低等問題[11]。近年來，隨著代謝工程研究的深入，通過代謝工程優(yōu)化通量并最終優(yōu)化生物過程，在選育氨基酸生產(chǎn)菌株方面應(yīng)用愈發(fā)豐富，代謝工程育種已成為誘變育種的有效替代策略。在氨基酸生產(chǎn)代謝工程改造過程中谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）、大腸桿菌（Escherichia coli）等模式微生物已成為主要宿主[12-13]。本文對L-甲硫氨酸在C.glutamicum和E.coli中的生物代謝合成途徑及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機制、L-甲硫氨酸代謝工程改造策略的研究進展進行綜述，旨在為L-甲硫氨酸代謝工程的進一步探究提供理論依據(jù)。

1 L-甲硫氨酸的生物合成途徑及代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制

1.1 L-甲硫氨酸生物合成途徑

L-甲硫氨酸的生物合成途徑包括兩個部分：中心代謝途徑和天冬氨酸族氨基酸共同途徑[14]。在中心代謝過程中，葡萄糖首先經(jīng)糖酵解途徑和戊糖磷酸途徑生成磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸，隨后在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphopyruvate carboxylase，PEPC）和丙酮酸羧化酶作用下羧化生成草酰乙酸，在天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶作用下生成L-天冬氨酸。隨后L-天冬氨酸進入天冬氨酸族氨基酸共同途徑，在天冬氨酸激酶（aspartokinase，AK）作用下L-天冬氨酸生成磷酸天冬酰胺，磷酸天冬酰胺在天冬氨酸半醛脫氫酶（aspartate semialdehyde dehydrogenase，ASD）催化下生成天冬氨酸半醛，天冬氨酸半醛隨后進入兩個途徑——L-賴氨酸合成途徑以及L-甲硫氨酸及L-蘇氨酸合成途徑。在高絲氨酸脫氫酶（homoserine dehydrogenase，HSD）催化下天冬氨酸半醛生成L-高絲氨酸，進入L-甲硫氨酸的分支代謝途徑。在L-甲硫氨酸生物合成的第一個特異性反應(yīng)中，首先L-高絲氨酸的γ-羥基被激活，在C.glutamicum和E.coli中分別以乙酰輔酶A和琥珀酰輔酶A作為?；孜镉糜谶@一激活步驟。C.glutamicum中通過高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶（homoserine acetyltransferase，HAT）完成高絲氨酸的酰基化，生成的中間代謝產(chǎn)物為O-乙酰-L-高絲氨酸，對于硫的同化有兩條途徑可供選擇，可以半胱氨酸作為硫的供體，或以硫化氫為硫的供體，前者在胱硫醚γ合成酶和胱硫醚β裂解酶催化下生成胱硫醚和高半胱氨酸，后者在O-乙酰-L-高絲氨酸硫化酶作用下直接合成高半胱氨酸[15]。E.coli中高絲氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶（homoserine transsuccinylase，HTS）催化琥珀酰輔酶A和高絲氨酸縮合反應(yīng)合成O-琥珀酰高絲氨酸。E.coli中只有一條硫化途徑，是以半胱氨酸為硫源，琥珀酰高絲氨酸和半胱氨酸在琥珀酰高絲氨酸裂解酶（succinyl homoserine lyase，SHL）的作用下生成胱硫醚，胱硫醚在胱硫醚裂解酶作用下生成高半胱氨酸。L-甲硫氨酸生物合成的最后一步是分別由VB12依賴型甲硫氨酸合成酶（methionine synthase，MS）和VB12非依賴型MS催化完成，前者以葉酸循環(huán)途徑產(chǎn)生的5-甲基-四氫葉酸為甲基供體，后者以絲氨酸分解代謝產(chǎn)生的5-甲基-四氫呋喃為甲基供體，為高半胱氨酸提供甲基從而合成L-甲硫氨酸，具體合成途徑如圖1所示。

圖1 L-甲硫氨酸生物合成途徑Fig.1 L-Methionine biosynthesis pathway

1.2 L-甲硫氨酸代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制

L-甲硫氨酸生物合成途徑在C.glutamicum和E.coli中生物合成中間體和調(diào)節(jié)機制存在異同。在E.coli中，PEPC受到更復(fù)雜的激活和抑制作用，包括蘋果酸和天冬氨酸的反饋抑制作用。相比而言，C.glutamicum中PEPC在磷酸烯醇式丙酮酸到草酰乙酸的回補反應(yīng)中發(fā)揮作用，但天冬氨酸對該酶并無調(diào)控作用[16]。

在天冬氨酸族氨基酸共同途徑中，AK作為關(guān)鍵限速酶，在E.coli中包含同工酶AKI、AKII和AKIII 3 種，分別由lysC、thrA和metL基因編碼，受L-賴氨酸、L-蘇氨酸及產(chǎn)物L(fēng)-甲硫氨酸的反饋調(diào)節(jié)[9]，3 個基因均在轉(zhuǎn)錄水平上受到調(diào)控，但只有l(wèi)ysC和thrA相關(guān)酶受其代謝途徑L-賴氨酸和L-蘇氨酸的反饋控制。在C.glutamicum中，僅含有1 種AK，由lysC基因編碼，受到分支途徑L-賴氨酸和L-蘇氨酸的協(xié)同反饋抑制[17]。ASD由asd基因編碼，在E.coli中其受到L-賴氨酸、L-蘇氨酸及L-甲硫氨酸的反饋阻遏，但在C.glutamicum中該酶不受終產(chǎn)物的抑制。HSD是天冬氨酸族氨基酸共同途徑的第二個關(guān)鍵酶，在E.coli中含有兩個同型雙功能酶AKI-HSDI和AKII-HSDII，分別由thrA和metL基因編碼，其活性受蘇氨酸的抑制[18]。在C.glutamicum中HSD是一種單功能酶，由hom基因編碼，其表達受到產(chǎn)物L(fēng)-甲硫氨酸反饋阻遏，由于其結(jié)構(gòu)C-末端ACT結(jié)構(gòu)域的存在，對L-蘇氨酸的反饋抑制較為敏感[19]。在E.coli中HTS由metA基因編碼，在C.glutamicum中HAT由metX基因編碼，表達及活性均受產(chǎn)物L(fēng)-甲硫氨酸和代謝物SAM所抑制。VB12依賴型MS和VB12非依賴型MS分別由metH基因編碼和metE基因編碼[20]。SAM是在S-腺苷甲硫氨酸合成酶（S-adenosylmethioninesynthetase，SAMS）催化下由L-甲硫氨酸和ATP反應(yīng)生成，在C.glutamicum和E.coli中SAMS由metK基因編碼，其合成受L-甲硫氨酸反饋抑制[21]。C.glutamicum和E.coli中L-甲硫氨酸合成途徑的具體反饋調(diào)節(jié)信息如圖2、3所示。

圖2 C.glutamicum中L-甲硫氨酸反饋調(diào)節(jié)Fig.2 Feedback regulation of L-methionine in C.glutamicum

圖3 E.coli中L-甲硫氨酸反饋調(diào)節(jié)Fig.3 Feedback regulation of L-methionine in E.coli

L-甲硫氨酸生產(chǎn)菌經(jīng)代謝工程生物合成途徑改造后，胞內(nèi)氨基酸過量積累會使其代謝途徑中一些關(guān)鍵酶的催化活性受到抑制，降解途徑中的前體利用率增加，導(dǎo)致菌株生長受影響[22]。通過隨機突變或基因組DNA文庫的表型篩選、轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析和序列相似性搜索技術(shù)可以確認L-甲硫氨酸的轉(zhuǎn)運蛋白，對其合理利用可調(diào)節(jié)L-甲硫氨酸的攝入和輸出[23]。在E.coli中，存在MetD和MetP兩條專一性L-甲硫氨酸的胞內(nèi)運輸系統(tǒng)。MetD操縱子包含metN、metI、metQ，分別編碼腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白（ABC轉(zhuǎn)運蛋白元件）——ATP酶、L-甲硫氨酸滲透酶和L-甲硫氨酸結(jié)合蛋白，MetD能夠運輸甲硫氨酸及其結(jié)構(gòu)類似物[24]。E.coli中向胞外運輸甲硫氨酸存在YeaS和YjeH兩個系統(tǒng)。YeaS屬于RhtB運輸?shù)鞍准易澹浔磉_受亮氨酸調(diào)控蛋白Lrps的調(diào)節(jié)。YjeH屬氨基酸-多胺-膽堿運輸?shù)鞍准易?，類似于YeaS轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的作用機制，通過增強E.coli對L-甲硫氨酸及其結(jié)構(gòu)類似物的抵抗能力，促進菌體內(nèi)多余L-甲硫氨酸的主動排出，從而降低胞內(nèi)L-甲硫氨酸的濃度[25]。E.coli中MetJ是L-甲硫氨酸合成的重要阻遏蛋白，可抑制metL、metA、metB、metC和metE基因的表達。與MetJ不同，MetR是一類轉(zhuǎn)錄激活因子，過表達后可有效促進L-甲硫氨酸的合成。在C.glutamicum中BrnFE系統(tǒng)可催化L-甲硫氨酸的主動輸出[26]。C.glutamicum對L-甲硫氨酸的吸收包括兩個轉(zhuǎn)運蛋白復(fù)合體MetD和MetP，調(diào)控L-甲硫氨酸由胞內(nèi)向胞外的轉(zhuǎn)運，其中MetD由metN、metI和metQ組成的基因簇編碼，屬于ABC轉(zhuǎn)運蛋白超家族MUT亞家族，其表達受轉(zhuǎn)錄因子mcbR調(diào)控；MetP由metP和metS基因編碼，屬于鈉離子能量偶聯(lián)轉(zhuǎn)運體家族，其表達形式為組成型表達[27]。

2 L-甲硫氨酸合成途徑代謝工程改造

根據(jù)代謝工程改造菌株提高目標氨基酸產(chǎn)量的“進、通、截、堵、出”五字策略[10]，依據(jù)目標氨基酸代謝合成途徑及網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制，代謝工程L-甲硫氨酸改造策略主要包括以下5 個方面：1）解除代謝途徑對關(guān)鍵酶的反饋作用；2）阻斷或削弱支路代謝途徑；3）中心代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的優(yōu)化；4）增強輔助因子的供應(yīng)；5）轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的優(yōu)化。

2.1 解除代謝途徑對關(guān)鍵酶的反饋作用

如前所述，C.glutamicum和E.coli中L-甲硫氨酸合成途徑存在多分支、多水平的反饋調(diào)節(jié)，許多關(guān)鍵酶受相應(yīng)代謝物的反饋抑制或（和）反饋阻遏。反饋抑制指在生物合成過程中代謝途徑終產(chǎn)物對相關(guān)酶引起的活性抑制調(diào)節(jié)[28]。生物合成途徑的終產(chǎn)物達到一定水平時對代謝途徑關(guān)鍵酶表達量的調(diào)節(jié)會引起反饋阻遏[29]。在菌株發(fā)酵產(chǎn)氨基酸的正向代謝工程中，解除代謝途徑關(guān)鍵酶受到的反饋調(diào)節(jié)可有效促進目標產(chǎn)物L(fēng)-甲硫氨酸的合成，代謝流的疏通可作為一種策略提高L-甲硫氨酸產(chǎn)量[30]。

L-賴氨酸和L-蘇氨酸合成途徑作為L-甲硫氨酸合成的分支代謝途徑，分別通過天冬氨酸-4-半醛和L-高絲氨酸實現(xiàn)代謝流的競爭[31]。除來自于末端代謝產(chǎn)物的反饋抑制，L-甲硫氨酸合成途徑中還有一些關(guān)鍵酶受胞內(nèi)中間代謝產(chǎn)物的抑制作用。在E.coli中AK的表達分別受L-蘇氨酸、L-賴氨酸和L-甲硫氨酸的反饋調(diào)節(jié)[9]，其中l(wèi)ysC和thrA及由其編碼的AK分別受到L-賴氨酸和L-蘇氨酸的反饋阻遏和反饋抑制，metL受到L-甲硫氨酸反饋阻遏。在C.glutamicum中由lysC編碼的AK表達受L-蘇氨酸和L-賴氨酸的協(xié)同反饋阻遏[32]，在酶活力水平上受L-賴氨酸和L-蘇氨酸的反饋抑制。C.glutamicum中構(gòu)建AK定點突變體A279T和G359D，其中A279T突變體氨基酸由疏水性變?yōu)橛H水性致使AK分子構(gòu)象改變，與配體間的非共價鍵作用被打破，G359D的突變使Arg151與底物結(jié)合位點Glu74之間無法形成離子鍵，可在一定程度上解除L-蘇氨酸和L-賴氨酸對AK的反饋阻遏[33-34]。在E.coli中HSD作為雙功能酶由thrA和metL編碼，其中基因thrA在轉(zhuǎn)錄水平上受L-蘇氨酸抑制。在C .glutamicum中，HSD活性受L-蘇氨酸的反饋抑制，其表達受到產(chǎn)物L(fēng)-甲硫氨酸反饋阻遏，在構(gòu)建C.glutamicum產(chǎn)L-甲硫氨酸菌株中，將HSD第377位的甘氨酸突變?yōu)楣劝彼幔上齃-蘇氨酸對HSD的反饋抑制[35]。E.coli中HTS由metA基因編碼，除受L-甲硫氨酸抑制外，其表達還受下游代謝產(chǎn)物SAM抑制，將HTS的第896位堿基由A突變?yōu)镚或第71位堿基由C突變?yōu)锳，能夠解除末端產(chǎn)物L(fēng)-甲硫氨酸和SAM的反饋抑制[36]。

2.2 阻斷或削弱支路代謝途徑

在天冬氨酸族氨基酸共同途徑中，碳流通過天冬氨酸-β半醛和L-高絲氨酸后流向分支代謝途徑，阻斷或削弱分支代謝途徑可有效調(diào)節(jié)碳源更多流向目標氨基酸L-甲硫氨酸代謝途徑，實現(xiàn)L-甲硫氨酸產(chǎn)量的提升。主要方法包括：L-蘇氨酸和L-賴氨酸營養(yǎng)缺陷型的篩選，弱化L-蘇氨酸和L-賴氨酸的合成；敲除dapA和thrB基因阻斷L-蘇氨酸和L-賴氨酸的合成。C.glutamicum中，敲除基因thrB可以獲得L-蘇氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株，在阻斷碳流流向L-蘇氨酸途徑的同時解除L-蘇氨酸對AK和HSD的協(xié)同反饋抑制作用[35,37-38]。在C.glutamicumATCC13032中通過對基因thrB敲除阻斷L-蘇氨酸合成途徑，對dapA中起始密碼子ATG用GTG代替，弱化L-賴氨酸合成途徑，與野生型對比，C.glutamicum工程菌L-甲硫氨酸產(chǎn)量增加3 倍，最終達到2.99 g/L[38]。在E.coliW3110中，通過敲除thrBC基因構(gòu)建L-蘇氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株，L-甲硫氨酸產(chǎn)量由不可檢測提升至0.008 g/L[39]。E.coliK-12/pKD46菌株中，dapA基因缺失后代謝物L(fēng)-甲硫氨酸產(chǎn)量提高2.61 倍[40]。

2.3 中心代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的優(yōu)化

一直以來，L-甲硫氨酸中心代謝途徑碳分布不平衡是迫切需要解決的問題，其阻礙了代謝物生物合成產(chǎn)量和產(chǎn)率的進一步提高。中心代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的優(yōu)化主要包括碳源利用途徑的優(yōu)化、副產(chǎn)物合成途徑的敲除、模塊化代謝工程和全局轉(zhuǎn)錄機器工程等[41]。通過細菌的轉(zhuǎn)錄、代謝組學(xué)分析可以了解菌株代謝并為后期改造提供重要線索。通量平衡分析（flux balance analysis，F(xiàn)BA）的使用能夠精確地計算和分析比對代謝網(wǎng)絡(luò)內(nèi)產(chǎn)物的理論得率和最佳代謝途徑[42]。通過系統(tǒng)分析策略對中心代謝和選定的L-甲硫氨酸生物合成途徑中的80 個基因表達進行抑制或上調(diào)，利用代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進一步揭示了中心代謝通量分布更均勻的最優(yōu)菌株L-甲硫氨酸生物合成途徑，將L-甲硫氨酸生物合成途徑模塊化，同時進行迭代遺傳修飾以揭示多層限制并逐步提高L-甲硫氨酸產(chǎn)量，最終達到16.86 g/L[43]。L-甲硫氨酸工程菌培養(yǎng)發(fā)酵過程中，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加Ca2+，F(xiàn)BA結(jié)果表明添加CaCO3加強了三羧酸循環(huán)，使細胞內(nèi)ATP濃度增加了39.28%，檸檬酸合成酶和氧化磷酸化途徑的調(diào)節(jié)是L-甲硫氨酸過量生產(chǎn)的重要原因，碳、ATP和輔因子通量的重新分布與E.coliW3110-BL協(xié)同改善L-甲硫氨酸生物合成效率，產(chǎn)量達到1.48 g/L，比未添加Ca2+的對照組高57.45%[44]。

2.4 增強輔助因子的供應(yīng)

輔助因子的供給和平衡能夠避免阻礙代謝途徑，對目標氨基酸的合成效率也發(fā)揮重要作用，是氨基酸代謝工程的一個重要影響因素。相比于其他氨基酸，合成L-甲硫氨酸需要更多的輔助因子NADPH，是合成L-賴氨酸的2 倍，合成L-谷氨酸的8 倍[38]。NADPH在C.glutamicum和E.coli中以不同的方式提供。C.glutamicum中NADPH主要通過磷酸戊糖途徑中由zwf編碼的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶以及由gnd編碼的6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶協(xié)同催化合成。在E.coli中主要通過利用膜結(jié)合的轉(zhuǎn)氫酶完成從NADH到NADPH的轉(zhuǎn)化。增強NADPH的供應(yīng)最常用的策略是重新分配糖酵解和磷酸戊糖途徑之間的代謝流量比。在C.glutamicum中將zwf基因727位點的G突變?yōu)锳，gnd基因1 083位點的T突變?yōu)镃，解除葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的反饋抑制，并異源過表達E.coli中基因gapC，細胞內(nèi)NADPH水平增加448.2%，L-甲硫氨酸產(chǎn)量增加64.1%[45]。第二種策略是通過糖酵解產(chǎn)生NADPH，通過改變天然NAD依賴性甘油醛3-磷酸脫氫酶編碼基因gapA對NADP的輔酶特異性[46]。第三種策略是過量表達來自E.coli的整合煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶，膜結(jié)合轉(zhuǎn)氫酶編碼基因PntAB可促進NADP+向NADPH的轉(zhuǎn)化[47]。過量的NADPH會被用于代謝途徑中其他代謝物的合成，僅通過NADPH的供應(yīng)促進L-甲硫氨酸的生產(chǎn)是有限的，利用系統(tǒng)代謝工程進一步提高L-甲硫氨酸產(chǎn)量非常必要[45]。

2.5 轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的優(yōu)化

用于分子轉(zhuǎn)運的載體蛋白在氨基酸代謝生物合成途徑中發(fā)揮著重要作用。L-甲硫氨酸在胞內(nèi)合成后，需要盡快將合成的多余甲硫氨酸運輸?shù)桨猓苊庠诎麅?nèi)過量積累產(chǎn)生一定毒性使細胞死亡，防止L-甲硫氨酸過量引起的反饋抑制和反饋阻遏，同時有利于L-甲硫氨酸后續(xù)提取工藝的進行[48]。對L-甲硫氨酸分泌和吸收運輸協(xié)同的改造可以促進L-甲硫氨酸的胞內(nèi)合成，有利于胞外積累。研究發(fā)現(xiàn)可通過在E.coli中敲除metN、metI、metQ基因弱化L-甲硫氨酸胞內(nèi)MetD運輸系統(tǒng)的轉(zhuǎn)運，過表達YjeH轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因yjeH能夠加強胞外轉(zhuǎn)運能力，但會影響菌株生長[49]。在E.coli中YeaS運輸系統(tǒng)的編碼基因yeaS過表達，可提升L-甲硫氨酸胞外運輸?shù)哪芰24]。對E.coli中異源引入基因cysBT149P替換E.coli內(nèi)源cysB從而構(gòu)建突變菌株能夠有效地解除CysB激活蛋白調(diào)控cys操縱子的調(diào)控，促進L-甲硫氨酸生物合成途徑中硫代謝相關(guān)基因的表達，提高代謝物的產(chǎn)量[25]。對C.glutamicum中硫代謝途徑調(diào)控因子mcbR基因進行敲除或修飾，可解除其對菌株生產(chǎn)能力的阻遏，使L-甲硫氨酸產(chǎn)量提升[37]。MetD運輸系統(tǒng)的表達也受轉(zhuǎn)錄因子mcbR的調(diào)控，敲除基因簇中任意基因均能夠使MetD運輸系統(tǒng)喪失活性[38]。C.glutamicum中過表達L-甲硫氨酸分泌系統(tǒng)BrnFE能使L-甲硫氨酸產(chǎn)量提高[37]。C.glutamicum中Lrp作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子可影響L-甲硫氨酸的合成，通過對胞內(nèi)L-甲硫氨酸濃度的響應(yīng)，激活轉(zhuǎn)運蛋白BrnFE表達從而穩(wěn)定胞內(nèi)L-甲硫氨酸濃度[50]。在未來，結(jié)合可見光熒光響應(yīng)官能團與目的轉(zhuǎn)運蛋白融合進一步改進生物傳感器的方法，可更好地用于了解細胞內(nèi)L-甲硫氨酸代謝通量[23,51]。

3 L-甲硫氨酸生物合成進展

在過去的20 年里，L-甲硫氨酸在C.glutamicum和E.coli中代謝途徑和調(diào)控機制得到深入研究，人們在改進L-甲硫氨酸發(fā)酵方面不斷做出努力和貢獻。

隨著L-甲硫氨酸代謝途徑的確認，研究人員首先集中于利用基因表達調(diào)控及突變株的選育以提高L-甲硫氨酸產(chǎn)量。Moeckel等[52]對一株已改造的賴氨酸生產(chǎn)菌株中metX和metY基因過表達，弱化產(chǎn)物對HAT及乙酰高絲氨酸硫基酶的反饋抑制，強化L-甲硫氨酸合成途徑，最終積累量達到16 g/L。Maier等[53]在一株抗反饋抑制E.coli中敲除編碼阻遏蛋白基因metJ，并過量表達運輸?shù)鞍拙幋a基因yjeH，強化合成途徑及運輸基因的表達，L-甲硫氨酸產(chǎn)量達到4.8 g/L。Kr?mer等[54]通過代謝途徑分析預(yù)測C.glutamicum和E.coli在L-甲硫氨酸的生產(chǎn)上有巨大潛力。隨后該團隊對C.glutamicum代謝途徑中調(diào)節(jié)L-甲硫氨酸生物合成和硫同化的重要基因mcbR進行敲除，使L-甲硫氨酸積累量達到3.4 g/L[55]。Park等[35]對一株已解除賴氨酸反饋抑制的C.glutamicum進行改造，通過敲除蘇氨酸途徑關(guān)鍵酶編碼基因thrB以弱化支路途徑，并提高HSD的表達量削弱反應(yīng)中間代謝物帶來的反饋抑制，在搖瓶發(fā)酵后測定胞外L-甲硫氨酸積累量為2.9 g/L。

酶的定向進化、基因敲除、基因過表達等方法在L-甲硫氨酸發(fā)酵生產(chǎn)過程中得到廣泛應(yīng)用后，研究人員漸漸投身于合成途徑的完善與整合。Qin Tianyu等[37]敲除C.glutamicum中mcbR基因釋放合成途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄抑制，上調(diào)metX轉(zhuǎn)錄水平，過表達homFbr、lysCFbr及運輸?shù)鞍拙幋a基因brnFE，增加前體供應(yīng)并增加L-甲硫氨酸胞外濃度，最終L-甲硫氨酸產(chǎn)量達到6.3 g/L。李瑩[56]以C.glutamicumATCC13032為出發(fā)菌株，敲除編碼產(chǎn)物主要吸收系統(tǒng)基因metD，通過誘變解除末端代謝產(chǎn)物對甲硫氨酸合成途徑的反饋抑制作用，敲除thrB基因以阻斷L-蘇氨酸合成，對dapA、lysC、pyc基因進行定點突變以削弱分支代謝途徑并解除相關(guān)酶的反饋抑制，過表達來自丙酮丁醇梭菌的外源基因gapC，從而增強胞內(nèi)NADPH供應(yīng)，最終L-甲硫氨酸產(chǎn)量達到9.88 g/L。Huang Jianfeng等[57]以E.coliW3110為出發(fā)菌株，敲除阻遏蛋白基因MetJ、向胞內(nèi)運輸L-甲硫氨酸的運輸?shù)鞍谆騇etI、過量表達metAFbr和運輸?shù)鞍谆騳jeH以提高碳流流向目標產(chǎn)物，加強胞外運輸能力，并用Na2S2O3為硫源，5 L發(fā)酵罐補料發(fā)酵48 h，L-甲硫氨酸終產(chǎn)量達到9.75 g/L。

由于L-甲硫氨酸代謝途徑存在復(fù)雜的基因表達與調(diào)控，通常只能進行局部代謝調(diào)控而較難實現(xiàn)對全局代謝的調(diào)控。近幾年隨著代謝工程策略與合成生物學(xué)工具的發(fā)展，以系統(tǒng)和全局的方式促進L-甲硫氨酸生產(chǎn)的相關(guān)研究逐漸顯現(xiàn)。Huang Jianfeng等[43]以E.coliW3110 IJ/pA*H為研究對象，基于CRISPR-Cas9技術(shù)對中心代謝途徑和氨基酸生物合成途徑進行系統(tǒng)分析，進一步揭示包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、變構(gòu)調(diào)節(jié)、同型半胱氨酸甲基化、甲基四氫葉酸（tetrahydrogen folic acid，CH3-THF）供應(yīng)、o-琥珀酰-L-高絲氨酸供應(yīng)和L-絲氨酸在內(nèi)的限制L-甲硫氨酸生物合成的6 層瓶頸，代謝組學(xué)分析結(jié)果表明，多個基因修飾能有效地重新分配代謝通量，促進L-甲硫氨酸的生物合成。魏磊[58]利用CRISPR-Cas9技術(shù)對L-甲硫氨酸合成過程的阻遏因子metJ及其競爭途徑——賴氨酸和蘇氨酸合成途徑的lysA和thrC以及sucCD進行敲除，同時定點改造AK編碼基因為產(chǎn)物反饋抑制不敏感型的lysCmut和thrAmut，將植物中的胱硫醚-γ-合成酶基因cgs和高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因hmt和甲硫氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因mmt組合在已改造后的菌株中進行過表達，L-甲硫氨酸產(chǎn)量最終達804 mg/L，是野生型的12 倍。Niu等[59]用FBA對重組E.coliW3110分批發(fā)酵L-甲硫氨酸的代謝通量進行分析，估算不同溶氧條件下細胞內(nèi)的通量分布，發(fā)現(xiàn)在30%溶解氧水平下獲得的L-甲硫氨酸生產(chǎn)通量高于其他溶解氧水平。Zhu Wenyuan等[60]利用發(fā)酵與生物催化相結(jié)合的方法生產(chǎn)L-甲硫氨酸，將經(jīng)系統(tǒng)分析優(yōu)化構(gòu)建的o-琥珀?；?L-高絲氨酸生產(chǎn)菌E.coliW3110(DE3)ΔIJB*TrcmetL/pTrc-metAfbr-Trc-thrAfbr-yjeH經(jīng)發(fā)酵提取上清液，在o-琥珀?；?L-高絲氨酸巰基酶和甲硫醇鈉存在的情況下轉(zhuǎn)化為L-甲硫氨酸，降低菌株修飾難度，使L-甲硫氨酸產(chǎn)量達21.1 g/L。研究人員不斷利用C.glutamicum和E.coli進行L-甲硫氨酸代謝途徑的改造，然而合成L-甲硫氨酸的多層次調(diào)控和復(fù)雜性尚未得到解決，對L-甲硫氨酸的大規(guī)模生產(chǎn)之間仍然存在一些差距。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，現(xiàn)有研究很大程度擴展了對L-甲硫氨酸生物合成多層次多級調(diào)控的認識，并為工業(yè)化生產(chǎn)L-甲硫氨酸奠定基礎(chǔ)。表1匯總了部分L-甲硫氨酸代謝途徑改造策略。

表1 L-甲硫氨酸代謝途徑改造策略部分匯總Table 1 Summary of L-isoleucine metabolic pathway modification strategies

吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院酶分子改造及食品營養(yǎng)分子調(diào)控團隊通過定向進化酶分子改造強化關(guān)鍵酶的表達，解除或削弱代謝途徑相關(guān)酶反饋抑制，并通過代謝工程構(gòu)建高產(chǎn)L-甲硫氨酸工程菌，致力于利用微生物發(fā)酵法提高L-甲硫氨酸產(chǎn)量的研究[65-69]。團隊首次發(fā)現(xiàn)與C.glutamicum同源相似性達99%的北京棒桿菌（C.pekinense）AK單體別構(gòu)酶，揭示了單體AK別構(gòu)調(diào)控機制，至今已構(gòu)建了140余株突變菌株，其中酶活力最大提高99.43 倍，異源表達AK優(yōu)化后構(gòu)建C.glutamicum工程菌PEC-lysCm-homm-metX的L-甲硫氨酸最高產(chǎn)量達6.85 g/L，較原菌提高274.32%，具體AK改造后酶活力提升情況如表2所示，為系統(tǒng)闡明關(guān)鍵酶與蛋氨酸生物合成代謝網(wǎng)絡(luò)相互作用關(guān)系，為棒桿菌L-甲硫氨酸合成代謝的調(diào)節(jié)和氨基酸菌種選育提供了良好借鑒。未來，團隊將集中在現(xiàn)有研究成果基礎(chǔ)上結(jié)合CRISPR技術(shù)，深入研究多分支、多水平調(diào)控氨基酸合成途徑方法，微生物發(fā)酵方法的研究以及溶氧、pH值等發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化，以求高效改造L-甲硫氨酸生物合成途徑，推進玉米淀粉高效生物轉(zhuǎn)化L-甲硫氨酸工業(yè)化進程。

4 結(jié)語

L-甲硫氨酸作為生命體不能自主合成的必需獨特含硫氨基酸，在食品、醫(yī)藥、動物飼料、化妝品等方面應(yīng)用廣泛[75-76]，具有重要的工業(yè)經(jīng)濟價值。近幾年，隨著代謝工程技術(shù)與合成生物學(xué)的迅速發(fā)展，適應(yīng)性進化、基因組編輯、基因表達調(diào)控等廣泛開發(fā)，研究人員已將這些方法應(yīng)用于L-甲硫氨酸的生產(chǎn)研究中。雖然已經(jīng)闡明了L-甲硫氨酸合成途徑中的代謝調(diào)控機制，但通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-甲硫氨酸尚未實現(xiàn)工業(yè)化。

在目前的研究報道中，提高L-甲硫氨酸產(chǎn)量具體策略主要包括：優(yōu)良出發(fā)菌種的選擇、高產(chǎn)菌株的高通量篩選、合成途徑的合理選擇以及發(fā)酵條件的優(yōu)化。過表達、弱化表達、定向進化和目標基因的缺失與替換等方法已被廣泛應(yīng)用于優(yōu)化L-甲硫氨酸生物合成途徑。以往對于生物合成L-甲硫氨酸相關(guān)的改造研究普遍集中于對天冬氨酸族氨基酸共同途徑的代謝調(diào)控，但中心代謝途徑中碳流量和輔助因子通量變化也會直接影響L-甲硫氨酸的合成能力，后續(xù)的研究可主要著重于：1）對中心代謝調(diào)控展開更細化的討論，并在產(chǎn)量最大化的基礎(chǔ)上盡量精簡調(diào)控路線，節(jié)約實驗成本；2）目前動態(tài)調(diào)控、精確調(diào)控已成為代謝工程研究的主要策略，合理利用動態(tài)調(diào)控、精細調(diào)控代謝過程以平衡菌株生長發(fā)育過程與L-甲硫氨酸合成的關(guān)系，能夠有效調(diào)節(jié)菌株生產(chǎn)效率并提高L-甲硫氨酸的轉(zhuǎn)化率；3）以合理設(shè)計為前提、正向代謝工程為基礎(chǔ)的系統(tǒng)代謝工程進行綜合應(yīng)用，深入應(yīng)用組學(xué)數(shù)據(jù)分析方法，建立計算機高級代謝網(wǎng)絡(luò)模型，并加強進化、反向代謝工程在高產(chǎn)L-甲硫氨酸代謝工程中的研究利用以提高氨基酸菌株育種效率；4）利用多學(xué)科領(lǐng)域交叉聯(lián)合手段綜合運用L-甲硫氨酸代謝設(shè)計，利用計算機分析建立基因組精細代謝表達調(diào)控模型指導(dǎo)L-甲硫氨酸生產(chǎn)，結(jié)合生物傳感器、新型功能元件挖掘、CRISPR基因編輯和全基因組池CRISPR干擾等技術(shù)進行L-甲硫氨酸代謝途徑改造。隨著生物信息學(xué)與合成生物學(xué)的發(fā)展與應(yīng)用，未來利用代謝工程技術(shù)生產(chǎn)L-甲硫氨酸將有望實現(xiàn)工業(yè)化，L-甲硫氨酸產(chǎn)業(yè)將會為人們帶來更高的經(jīng)濟效益。