黨運芝 于嬌 趙淑紅 金龍 任曉躍 王青

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是消化道最常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內發(fā)病率位列第三，死亡率位列第三［1］。手術切除是CRC最有效的治療方式，但是復發(fā)和轉移仍是手術治療失敗的主要原因［2］。另外，約20%的結直腸癌患者在診斷時已出現(xiàn)了轉移［3］。盡管近年來CRC治療方法取得了顯著進步，但轉移性CRC可選擇的有效治療方式仍較少［4-5］，目前關于CRC轉移的機制仍不清楚，亟待進一步研究。VASP是Ena/VASP家族的一個重要成員，可調節(jié)actin細胞骨架運動及細胞遷移［6-8］。過表達的VASP可促進多種腫瘤的侵襲和遷移，且與差的預后呈正相關［9-11］。但關于VASP在結直腸癌中的表達和功能報道較少。本研究檢測了VASP表達，并分析了VASP表達量與結直腸癌預后的關系。通過體外細胞實驗及裸鼠體內實驗探索了VASP在CRC轉移中的作用。

材料與方法

一、細胞系和人組織標本

人結腸永生化細胞CRL1 790，人結直腸癌細胞系SW480、S1226、DLD-1、RKO、Caco-2、SW620、LoVo、SW48、T84和Colo201引自美國模式菌種細胞庫（ATCC），由陜西省人民醫(yī)院實驗室組織細胞庫保存。

二、熒光定量PCR

用Takara試劑盒提取新鮮組織的RNA，用Takara試劑盒逆轉錄成cDNA，后行熒光定量PCR。反應程序如下：95°C，15s；55-60 °C，15s；72°C，15 s共45個循環(huán)。用如下公式計算樣本的表達量：2–ΔΔCt（ΔΔCt=ΔCtTumor– ΔCtNontumor）。

VASP的引物序列如下：

正向：5'-ATGGCAACAAGCGATGGCT-3'

反向：5'-CGATGGCACAGTTGATGACCA-3'

三、免疫組化

結腸癌及癌旁組織芯片，65℃烤片3～4 h，常規(guī)脫蠟水化，檸檬酸鈉（pH=6.0）高壓修復2 min，冷卻至室溫后于3%H2O2封閉15 min。加入VASP（abcam，ab229624）一抗，4℃孵育過夜。第二天PBS漂洗3次×5 min后，滴加二抗，室溫孵育30 min。PBS漂洗3次×5 min后，滴加辣根過氧化物酶，室溫孵育30 min。PBS漂洗3次×5 min，DAB顯色，脫水透明，中性樹脂封片。

免疫組化評分由兩位病理科醫(yī)生獨立完成，免疫染色強度分為0～3分：0（陰性），1（弱陽性），2（中度陽性），3（強陽性）。細胞陽性率分5個級別：0（陰性），1（1%～25%），2（26%～50%），3（51%～75%），4（76%～100%）。最終得分為免疫染色強度與細胞陽性率的乘積。其中0～3為陰性，4～12分為陽性。

四、蛋白免疫印跡

用中等強度的細胞裂解液（含蛋白酶及磷酸酶抑制劑）提取細胞蛋白，用SDS-PAGE凝膠電泳1.5～2.0 h，轉至PVDF膜上（恒壓25 V，30 min），10%牛奶室溫封閉1 h。一抗VASP（abcam，b229624）孵育，4℃過夜。第二天，TBST漂洗5 min×3次，二抗室溫孵育30 min。采用Bio-Rad公司的ChemiDocXRS凝膠成像儀成像。

五、Transwell侵襲和遷移實驗

選用corning公司24孔小室（直徑為8 μm）。在遷移實驗中，5×105細胞種植在無血清的上室內；在侵襲實驗中，5×105細胞被種植在無血清且基質膠包被的上室，下室均加入600 μL含20%血清的培養(yǎng)基。24～48 h后分別取出小室，用4%多聚甲醛固定10 min，7%的結晶紫染色10 min，倒置顯微鏡拍照，分析細胞侵襲和轉移的數目。

六、裸鼠尾靜脈肺轉移實驗

BALB/C裸鼠，雄性，4～6周齡，購自北京維通利華公司，飼養(yǎng)在SPF級別動物房中。將相應細胞培養(yǎng)至對數期，收取細胞并計數。將裸鼠隨機分組（n=10），每只裸鼠尾靜脈注射200 μL細胞懸液（約5×105個細胞），后每周行活體成像，9周后處死全部小鼠。

七、數據分析

采用SPSS 20.0進行數據統(tǒng)計分析，數值均記為平均值±標準差（SD）。數值變量采用Student t檢驗，分類變量采用卡方（χ2）檢驗，P＜0.05時認為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、VASP高表達與結直腸癌較差的預后相關

我們首先用實時定量PCR方法檢測了VASP在20例正常腸上皮組織及110例配對的癌旁及CRC組織中的表達水平，發(fā)現(xiàn)VASP的表達水平在CRC組織中較癌旁及正常組織明顯升高。進一步分析發(fā)現(xiàn)VASP的表達水平在復發(fā)CRC（n=59）的表達較沒有復發(fā)的CRC（n=51）升高更為顯著。在轉移的CRC（n=53）較無轉移CRC（n=45）的升高更為顯著（圖1A）。在20對配對的標本中，VASP在轉移性CRC中的表達明顯高于原發(fā)性CRC（圖1A～1B）我們進一步用免疫組化方法分析了VASP在222對配對CRC組織與癌旁組織中的表達。我們選取了222例均接受手術切除的結直腸癌患者，其中130例患者只接受了手術治療；60例患者接受了手術+化療；32例患者接受了手術+放療+化療。發(fā)現(xiàn)VASP主要為胞質著色，且VASP在CRC中的表達明顯高于癌旁（圖1C）。VAS與腫瘤大小、腫瘤分化、神經侵犯、淋巴結轉移、遠處轉移、AJCC分期呈正相關（表1）。COX多因素分析表明VASP的表達是結直腸癌患者復發(fā)及死亡的獨立預測因素之一（表2）。而生存分析發(fā)現(xiàn)，過表達的VASP與短的總體生存（χ2=62.4，P＜0.001）及高的復發(fā)率呈正相關（χ2=66.9，P＜0.001）（圖1D）。

表1 結直腸患者中VASP的表達與臨床參數的相關性

表2 VASP的表達是結直腸癌患者復發(fā)及死亡的獨立預測因素

圖1 VASP在結直腸癌中的表達。1A：實時定量PCR方法分析正常腸上皮組織、癌旁及CRC組織中VASP mRNA的表達水平；復發(fā)與未復發(fā)CRC患者VASP mRNA的表達；轉移與未轉移CRC患者VASP mRNA的表達；20對配對的正常腸上皮組織、原發(fā)CRC及轉移CRC中VASP mRNA的表達。1B：IHC檢測VASP在20例配對的癌旁，原發(fā)性CRC及遠處轉移CRC的表達情況。1C：IHC染色分析VASP在癌旁及CRC的蛋白表達情況及IHC評分情況。1D：Kaplan-Meier方法分析VASP的表達與復發(fā)及生存的關系。低倍鏡圖中bar值代表250 μm，高倍鏡圖中bar值為50 μm。*P＜0.05

二、VASP過表達促進CRC細胞的侵襲和遷移

為進一步研究VASP在CRC中的功能，我們首先檢測了正常腸上皮、結腸永生化細胞及10種CRC細胞系中VASP的表達，發(fā)現(xiàn)SW620細胞中VASP的表達最低，而SW480細胞中VASP的表達最高（圖2A）。因此，我們用慢病毒感染的方法建立兩個穩(wěn)定的細胞株：SW480-VASP和SW620-shVASP（圖2B）。體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組細胞相比，上調VASP表達可促進SW480細胞侵襲和遷移能力，而下調VASP的表達可以抑制SW620細胞的侵襲和遷移（圖2C）。

圖2 VASP可促進結直腸癌細胞的侵襲和遷移。2A：VASP在正常腸上皮、結腸永生化細胞及10種CRC細胞系中的表達；2B：慢病毒轉染后VASP在相應細胞中的表達；2C：Transwell實驗分析SW480-VASP，SW620-shVASP與相應對照組細胞的侵襲和遷移能力

三、裸鼠體內實驗VASP過表達可促進CRC細胞系的肺轉移

為進一步研究VASP在CRC中的功能，我們將SW480-VASP及SW620-shVASP細胞及其相應對照組細胞分別注射到小鼠的尾靜脈，并每周成像一次。生物活體成像發(fā)現(xiàn)VASP過表達可增加SW480細胞的信號強度，而下調VASP的表達可降低SW620細胞的信號強度（圖3A～3B）。HE染色發(fā)現(xiàn)VASP過表達可以增加SW480細胞肺臟轉移的發(fā)生率及轉移灶數目，而下調VASP的表達則可以降低SW620細胞肺臟轉移的發(fā)生率及轉移灶數目（圖3C～3E）。而生存分析發(fā)現(xiàn)VASP過表達可以降低小鼠總體生存時間，而下調VASP的表達則可以延長小鼠總體生存時間（圖3F）。

圖3 VASP可促進結直腸癌細胞的肺轉移。3A：生物發(fā)光成像顯示各組裸鼠體內轉移情況；3B：各組裸鼠尾靜脈注射后0～9周活體成像的信號值；3C：各組裸鼠肺部代表性的HE圖像；3D：各組裸鼠肺轉移發(fā)生率；3E：各組裸鼠肺臟轉移灶的數目；3F：各組裸鼠的總體生存。*P＜0.05

討 論

Ena/VASP蛋白是一個保守的actin調節(jié)蛋白家族，由EVH1、EVH2和一個富含脯氨酸蛋白的區(qū)域組成。近年來的研究表明，VASP在多種腫瘤中亦具有重要作用。在肝細胞癌中，VASP的表達水平明顯升高，與門靜脈癌栓形成及不良預后呈正相關［12］。肝臟是結腸癌最常見的轉移器官，在小鼠肝臟轉移模型及腫瘤患者中，結腸癌細胞到達肝竇并上調肝臟星形細胞的VASP表達，VASP促進肝臟星形細胞向腫瘤相關肌成纖維細胞轉化［9］。乳腺癌中，Wnt/β-catenin信號通路與VASP形成正反饋環(huán)路，促進乳腺癌細胞增殖和轉移［13］。在我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，VASP在肝細胞癌中表達明顯升高，轉錄因子HOXC10通過上調VASP的表達促進肝細胞癌的轉移［14］。而食管癌中，VASP的239位點磷酸化則可抑制腫瘤的侵襲和遷移［15］。

臨床病理學特征在預測結直腸癌預后，選擇合理治療方案上具有重要作用［16］。但目前關于VASP在結直腸癌中表達報道還較少，且結論相互矛盾。在既往的文獻中［17］發(fā)現(xiàn)VASP的過表達及磷酸化與CRC疾病的復發(fā)呈正相關。另外，在60例結腸癌中VASP的過表達與不良預后呈正相關［18］。但另一篇只有20例CRC的研究中則發(fā)現(xiàn)VASP及兩種磷酸化VASP的表達水平在癌組織顯著低于癌旁組織［19］。本研究通過實時定量PCR及免疫組化染

色的方法發(fā)現(xiàn)VASP在CRC中的表達較癌旁明顯升高。VASP與AJCC分期及淋巴結轉移呈正相關，是CRC患者復發(fā)及死亡的獨立預測因素之一。另外，在20例配對的樣本中，我們發(fā)現(xiàn)VASP在轉移性CRC組織中的表達顯著高于原發(fā)CRC組織中的表達，基于此我們對VASP在CRC轉移中的作用進行了進一步探索。首先體外細胞Transwell實驗發(fā)現(xiàn)上調VASP的表達可促進CRC細胞的侵襲和遷移，而下調VASP的表達則可以抑制CRC細胞的侵襲和遷移。體內的裸鼠尾靜脈實驗中，過表達的VASP可以促進CRC細胞的侵襲和轉移，是促進CRC進展的重要分子。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)VASP在CRC中表達升高與差的預后呈正相關。體內外實驗表明VASP可促進CRC的侵襲和轉移。本研究明確了VASP在CRC中的表達和功能，為臨床治療CRC轉移提供潛在的靶點，但VASP促進CRC轉移的機制仍需進一步的研究。