趙新華 馬怡茗 賀龍梅 汪紅英

RNA選擇性剪切是調(diào)控蛋白多樣性的重要機(jī)制，在腫瘤發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。伴隨著深度測(cè)序技術(shù)在腫瘤研究中的應(yīng)用，RNA選擇性剪切（Alternative splicing，AS）在腫瘤發(fā)生與發(fā)展過程中的作用引發(fā)研究者的重視［1-3］。RBPMS（RNA-binding protein with multiple splicing）屬于RNA結(jié)合蛋白家族，編碼蛋白的N端有一個(gè)保守的RRM（RNA recognition motif）區(qū)域［4］。其在軸突導(dǎo)向［5］、平滑肌可塑性［6］以及癌細(xì)胞增殖和遷移［7］的調(diào)控過程中發(fā)揮作用，但是在結(jié)腸癌發(fā)生與發(fā)展中的作用還是未知。

氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）-葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）模型是比較成熟的結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌動(dòng)物模型，可在3個(gè)月內(nèi)模擬急性炎癥修復(fù)期、輕度不典型增生、腺瘤到腺癌的結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌發(fā)生與發(fā)展動(dòng)態(tài)過程。本研究將初步探索RBPMS小鼠和人結(jié)腸癌中的變化，并檢測(cè)其在結(jié)腸癌細(xì)胞增殖中的作用。

材料與方法

一、結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌模型的構(gòu)建

將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和給藥組，對(duì)照組不做任何處理。給藥組在實(shí)驗(yàn)第1天單劑量腹腔注射AOM（12.5 mg/kg），1周后給予含2.5%DSS的飲用水5天，停藥2周，作為1個(gè)DSS周期；共給予4個(gè)周期的DSS。每組各5只小鼠。

二、動(dòng)物樣本采集

分別在第1、2、3、4個(gè)DSS周期結(jié)束時(shí)，處死給藥組小鼠，相應(yīng)的命名為AD1（急性炎癥修復(fù)期）、AD2（輕度不典型增生）、AD3（腺瘤）和AD4（腺癌）組，對(duì)照組小鼠命名為Con組。小鼠解剖后取遠(yuǎn)端結(jié)腸（結(jié)腸一半至肛門），結(jié)腸剖開，用生理鹽水清洗干凈，置于液氮中速凍，并存放于-80度冰箱中長期保存。

三、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

HCT116細(xì)胞使用RPMI-1640（含10%FBS和1%青鏈霉素）常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)融合度高于90%時(shí)，使用0.25%胰酶消化傳代。細(xì)胞轉(zhuǎn)染使用lipofectamineTM2000將小干擾RNA及其對(duì)照分別轉(zhuǎn)入HCT116細(xì)胞系。

RBPMS特異性小干擾RNA序列：

siRBPMS#1：

5′-GGAGGUCCGGACCCUAUUUTTAAAUAGG

GUCCGGACCUCCTT-3′；

siRBPMS#2：

5′-CCGCUUCGAUCCUGAAAUUTTAAUUUCA

GGAUCGAAGCGGTT-3′；

siRBPMS#3：

5′-GCUUUCACCUAUCCCGCUUTTAAGCGG

GAUAGGUGAAAGCTT-3′。

RBPMS的引物序列：

RBPMS-F：TATGAGCTCACAGTGCCTGC；

RBPMS-R：GCTAACTCCGCTGGGTACAG。

四、總RNA的提取和質(zhì)量檢測(cè)

使用Trizol法提取小鼠結(jié)腸組織的總RNA。使用NanoDrop K5600檢測(cè)提取的總RNA的濃度和純度。

五、全基因組表達(dá)譜芯片的檢測(cè)

按照Agilent mRNA表達(dá)譜芯片的說明書操作，應(yīng)用檢測(cè)合格的總RNA熒光擴(kuò)增后進(jìn)行芯片雜交，掃描芯片獲取圖像，記錄數(shù)據(jù)。

六、組織固定、包埋與免疫組織化學(xué)染色

使用10%福爾馬林對(duì)AD4組小鼠結(jié)腸組織固定24 h，石蠟包埋后切取4 μm厚組織切片。60℃烘烤過夜后，經(jīng)二甲苯和濃度梯度酒精脫蠟。于95℃的0.01 M（pH 6.0）檸檬酸鹽緩沖液中熱修復(fù)15 min，自然冷卻至室溫。滴加3%雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，利用兔源性RBPMS抗體（1∶100）于4℃孵育過夜。滴加酶標(biāo)抗兔二抗試劑孵育30分鐘，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染，經(jīng)梯度酒精和二甲苯脫水后，使用中性樹脂封片。

七、蛋白質(zhì)提取

使用RIPA（添加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）裂解液提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，使用NE-PER?Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents（Thermo Fisher Scientific）提取細(xì)胞核蛋白和胞漿蛋白。使用BCA法檢測(cè)蛋白含量。

八、Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)

取50 μg蛋白質(zhì)，使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，380 mA橫定電流轉(zhuǎn)膜1 h；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入一抗4度過夜；使用TTBS洗膜5 min×3次；加入二抗室溫孵育1 h，使用TTBS洗膜5 min×3次；加入ECL發(fā)光液，使用Amersham Imager 6000化學(xué)發(fā)光成像儀記錄結(jié)果。

九、四甲基偶氮唑藍(lán)法（MTT）檢測(cè)細(xì)胞增殖

細(xì)胞常規(guī)消化、計(jì)數(shù)后接種于96孔板，每孔接種3 000個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。于接種1天、3天和5天后，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清后，每孔加入200 μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩1 min后，檢測(cè)OD490 nm處的吸光度值。

十、克隆形成實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞常規(guī)消化、計(jì)數(shù)后接種于24孔板，每孔接種500個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。于接種7天后，棄上清，每孔加入100 μL結(jié)晶紫染料，5 min后，沖洗孔板并拍照計(jì)數(shù)。

十一、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

細(xì)胞常規(guī)消化后，75%乙醇固定過夜。離心后采用細(xì)胞周期染色液室溫孵育15分鐘，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)周期。

十二、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graph Pad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料如果呈正態(tài)分布，比較采用單因素或兩因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD方法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

結(jié) 果

一、RBPMS在小鼠結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌模型中表達(dá)升高

AOM-DSS模型能夠有效模擬人的結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌病程。小鼠模型不同時(shí)期結(jié)腸全基因組芯片數(shù)據(jù)顯示，RBPMS的表達(dá)水平在結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌發(fā)生與發(fā)展過程中逐漸升高（t=7.165，P＜0.01）（圖1）。提示RBPMS可能與結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)。進(jìn)一步通過免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)小鼠結(jié)腸癌組織中RBPMS蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示腫瘤組織中該蛋白的表達(dá)顯著高于癌旁組織（圖2）。

圖1 AOM/DSS小鼠結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌模型中RBPMS表達(dá)水平的芯片檢測(cè)結(jié)果。AD1：急性炎癥恢復(fù)期；AD2：輕度不典型增生；AD3：腺瘤；AD4：腺癌。**P＜0.01。

圖2 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)AOM/DSS小鼠結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌模型中RBPMS表達(dá)。（標(biāo)尺：100 μm）

二、RBPMS特異性小干擾RNA效率檢測(cè)

將小干擾RNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，72 h后收集細(xì)胞總蛋白質(zhì)，Western blot檢測(cè)RBPMS的表達(dá)。Western blot檢測(cè)顯示si-RBPMS#2和si-RBPMS#3能夠顯著降低RBPMS的表達(dá)水平（圖3）。

圖3 Western blot檢測(cè)RBPMS特異性小干擾RNA的敲降效率

三、敲降RBPMS抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和克隆形成能力

隨后，進(jìn)一步檢測(cè)敲降RBPMS對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和克隆形成的影響。結(jié)果顯示，敲降RBPMS能夠顯著抑制HCT116細(xì)胞的增殖能力（圖4）。對(duì)照組細(xì)胞的克隆形成數(shù)為（226±25）個(gè)。敲降RBPMS組的細(xì)胞克隆形成能力顯著降低，克隆形成數(shù)分別為（167.7±12.5）個(gè)（t=3.615，P＜0.05），（103.3±8.6）個(gè) （t=8.034， P＜0.01）和 （82.6±10.7）個(gè)（t=9.13，P＜0.001）（圖5）。

圖4 MTT法檢測(cè)敲降RBPMS對(duì)細(xì)胞增殖的影響。*P＜0.05，***P＜0.001

圖5 敲降RBPMS對(duì)細(xì)胞克隆形成能力的影響。5A：克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)晶紫染色代表性結(jié)果圖片；5B：各組克隆形成數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

四、敲降RBPMS影響結(jié)腸癌細(xì)胞細(xì)胞周期

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)敲降RBPMS對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。結(jié)果顯示，使用siRNA敲降RBPMS，處于G1期的細(xì)胞比例由（79.65±1.17）%上升為（88.61±1.21）%（t=4.564，P＜0.05），（83.65±2.49）%（t=2.784，P＜0.05）和（83.52±1.34）%（t=3.763，P＜0.05）；而處于S期的細(xì)胞比例由（10.43±0.48）%下降為（5.73±1.2）%（t=3.634，P＜0.05），（6.17±0.83）%（t=4.044， P＜0.05） 和 （5.47±1.16）% （t=3.952，P＜0.05）。敲降RBPMS能夠造成HCT116細(xì)胞G0/G1期阻滯，且S期細(xì)胞比例顯著降低（圖6）。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)敲降RBPMS對(duì)細(xì)胞周期的影響。6A：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)周期結(jié)果圖；6B：各組G1期、S期和G2期統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖。*P＜0.05

討 論

RNA選擇性剪接是多外顯子基因組中翻譯蛋白多樣性的重要機(jī)制，通過選擇性地對(duì)前體mRNA剪接位點(diǎn)的組合加工，形成不同的成熟mRNA，可以使一個(gè)基因翻譯成不同結(jié)構(gòu)和功能的異構(gòu)體，進(jìn)而改變功能結(jié)構(gòu)域，親和力及穩(wěn)定性［11-12］。約90%的基因存在選擇性剪接，且60%的剪接產(chǎn)生的異構(gòu)體編碼不同的蛋白［13］。選擇性的對(duì)前體mRNA剪接位點(diǎn)的組合加工，形成不同的成熟mRNA，可以使一個(gè)基因翻譯成不同結(jié)構(gòu)和功能的異構(gòu)體，進(jìn)而改變功能結(jié)構(gòu)域，親和力及穩(wěn)定性［14］。例如：BCL2L1 pre-mRNA選擇性剪接產(chǎn)生的BCL-XL在很多腫瘤中是抗凋亡功能，而腫瘤中低表達(dá)的BCL-XS則有明顯的促凋亡作用［14-16］。在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中任何作用蛋白的變化、作用元件或剪切位點(diǎn)的突變都會(huì)導(dǎo)致促癌基因或抑癌基因的異常剪接，導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化［17］，過度增殖［18］，轉(zhuǎn)移［18］及藥物抗性增強(qiáng)［19］等。

本研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌組織中RBPMS mRNA表達(dá)水平升高，并且敲降該基因可以顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116的增殖和克隆形成能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)敲降RBPMS造成結(jié)腸癌細(xì)胞G0/G1期阻滯，S期細(xì)胞減少。這提示RBPMS可能發(fā)揮癌基因的作用。但是目前關(guān)于RBPMS在腫瘤中的作用報(bào)道較少，大多數(shù)研究顯示該基因可能發(fā)揮抑癌基因的作用。在多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM），其低表達(dá)與晚期MM相關(guān)，EZH2通過啟動(dòng)子的甲基化在轉(zhuǎn)錄水平抑制RBPMS的表達(dá)，并參與耐藥過程［20-21］。而且，RBPMS調(diào)控 MYC， Bcl-2， p15INK4b， p21CIP1/WAF1，p57KIP2等基因的表達(dá)抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡［22-23］。雖然RBPMS在結(jié)腸癌中的促癌作用還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證，但是我們的研究提示該基因在不同的腫瘤中，可能發(fā)揮截然不同的作用。未來我們需要更多的研究明確結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌中RBPMS的靶基因及其調(diào)控機(jī)制。