劉新宇 羅濤 蔣志俊 劉昊天 黎樂群

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，占全部原發(fā)性肝癌的80%～90%［1］。目前國際主流的治療方式為肝切除、肝移植或經(jīng)皮局部消融，并以經(jīng)肝動(dòng)脈化療栓塞（TACE）、放療、全身藥物治療等手段配合治療，但術(shù)后1年內(nèi)復(fù)發(fā)率仍接近40%，5年生存率僅為15%～40%［2］。探索肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找新的早期診斷標(biāo)志物及預(yù)后預(yù)測的分子靶點(diǎn)對提高患者生存期具有重要意義。環(huán)狀RNA是具有共價(jià)鍵閉環(huán)結(jié)構(gòu)的特殊非編碼 RNA［3?4］，在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平具有重要的基因表達(dá)調(diào)控作用［5］。研究表明，環(huán)狀RNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，參與腫瘤發(fā)生、侵襲和遷移等惡性生物學(xué)行為［6?8］。本課題組前期根據(jù)HCC術(shù)后切除組織的高通量測序結(jié)果，篩選出一組包括57個(gè)差異表達(dá)的環(huán)狀RNA與HCC患者不良預(yù)后顯著相關(guān)，查閱文獻(xiàn)尚未見hsa_circ_0000591在HCC中的報(bào)道。因此，本研究檢測hsa_circ_0000591在HCC組織及肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)，同時(shí)構(gòu)建hsa_circ_0000591沉默的肝癌細(xì)胞模型，探討其對肝癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，為闡明hsa_circ_0000591在肝癌中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

1.1.1 臨床樣本 收集2014—2018年于廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院接受肝癌切除術(shù)的84例HCC患者癌組織及其相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)組織病理學(xué)檢查診斷為HCC，術(shù)前未行放療、化療或靶向藥物治療等抗腫瘤治療。本研究方案獲廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或家屬知情同意。通過門診或電話隨訪，術(shù)后每3個(gè)月隨訪1次，隨訪內(nèi)容包括腫瘤復(fù)發(fā)或死亡，隨訪時(shí)間截至2021年2月1日?？偵嫫诙x為自確診之日至死亡或隨訪截止的時(shí)間。

1.1.2 主要材料及試劑 人肝癌細(xì)胞系Li?7、HepG2、Hep3B、Huh7及人正常肝細(xì)胞系HL?7702均購自上海研究院生命科學(xué)細(xì)胞資源中心或美國ATCC細(xì)胞庫。hsa_circ_0000591沉默慢病毒（siRNA）及相應(yīng)的陰性對照組慢病毒（NC）由上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司構(gòu)建。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，Trizol購自美國Invitrogen公司，PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser購自日本Takara公司，熒光定量試劑盒 FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）購自德國Roche公司，CCK?8試劑購自碧云天公司，Transwell小室、Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板及基質(zhì)膠購自Corning公司。

1.2 qRT?PCR檢測hsa_circ_0000591 mRNA的表達(dá)水平

使用TRIzol法提取HCC組織及肝癌細(xì)胞系中的總RNA，根據(jù)Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的方法將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95℃，10 min變性；57 ℃，10 s退火；60 ℃，10 s延伸；共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系：5 μL的2×SYBR Green Master（ROX），上下游引物各0.3 μL，cDNA模板1 μL，RNase Free dH2O補(bǔ)至10 μL。反應(yīng)序列：GAPDH正向引物序列為5′?GGAGCCAAAAGGGTCATCATCTC?3′，反向序列為 5′?GAGGGGCCATCCACAGTCTTCT?3′；hsa_circ_0000591正向引物序列為5′?CATGGATACT?GATTCAGCACTT?3′，反向序列為 5′?ACTGTTCCAC?CATCTTGATTAG?3′。以GAPDH為內(nèi)參，使用2-△△Ct法分析目的基因的相對表達(dá)量。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和感染

所有細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Hep3B細(xì)胞使用胰酶消化后接種至6孔板，待細(xì)胞貼壁生長狀態(tài)良好時(shí)感染。感染前6 h更換培養(yǎng)基，然后用稀釋后的慢病毒與增強(qiáng)感染液混合。參照吉?jiǎng)P公司稀釋后的慢病毒使用說明書分別將hsa_circ_0000591沉默慢病毒及相應(yīng)陰性對照組慢病毒感染Hep3B細(xì)胞，分別記為siRNA組和NC組，6 h后替換常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。慢病毒感染48～72 h后，更換含嘌呤霉素（終末濃度為2 μg/mL）培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2周，然后用qRT?PCR實(shí)驗(yàn)檢測感染效率。

1.4 CCK?8法檢測肝癌Hep3B細(xì)胞增殖能力

將轉(zhuǎn)染后的Hep3B細(xì)胞消化后，吹打混勻、計(jì)數(shù)，接種至96孔板，每個(gè)樣本設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔，每孔分別加入100μL細(xì)胞數(shù)為1×104個(gè)的細(xì)胞懸液。分別于培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h時(shí)加入10 μL CCK?8試劑，繼續(xù)孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的光密度（OD）值。

1.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測肝癌Hep3B細(xì)胞增殖能力

用500 μL 0.25%胰蛋白酶覆蓋感染后的Hep3B細(xì)胞表面，消化至細(xì)胞變圓脫落后，加入5 mL全培養(yǎng)液終止消化，制成細(xì)胞懸液，移至15 mL離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清；加入3 mL完全培養(yǎng)液，按每孔200個(gè)細(xì)胞的密度接種至6孔板，培養(yǎng)2周至細(xì)胞集落形成。用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌2次，1%結(jié)晶紫染色20 min，觀察細(xì)胞集落形成情況并計(jì)算細(xì)胞克隆形成率。細(xì)胞克隆形成率（%）=（細(xì)胞克隆數(shù)量/接種細(xì)胞數(shù)量）×100%。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測肝癌Hep3B細(xì)胞遷移能力

在6孔板后面均勻劃橫線，并向每孔板添加50 μL纖維連接蛋白，置于4℃冰箱中冷藏過夜。將轉(zhuǎn)染后的Hep3B細(xì)胞制成細(xì)胞懸液（1×106/mL），混勻后接種于6孔培養(yǎng)板，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。用200 μL槍頭在細(xì)胞板上劃痕，PBS溶液沖洗3次，清除被劃下的貼壁細(xì)胞，然后加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。分別于劃痕后 0 h、6 h、24 h、48 h時(shí)取樣，拍照記錄，用ImagePro?Plus 6.0軟件測量同一時(shí)間點(diǎn)上各組細(xì)胞8個(gè)任意位置的劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=（1-其他時(shí)間點(diǎn)距離/0 h距離）×100%。

1.7 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測肝癌Hep3B細(xì)胞遷移和侵襲能力

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前12 h換成無血清培養(yǎng)基，饑餓細(xì)胞過夜。胰蛋白酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄廢液，用無血清培養(yǎng)基將下部細(xì)胞沉淀重懸，密度調(diào)節(jié)為2.5×105/mL。將200 μL細(xì)胞懸液接種于Transwell上室，下室加入600 μL包含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，置于37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后終止培養(yǎng)，棄培養(yǎng)基，PBS溶液清洗后用棉球輕輕擦拭上室，加入甲醛，固定30 min。用0.1%結(jié)晶紫溶液染色30 min，然后用300 μL 30%醋酸洗脫小室底面的結(jié)晶紫，各孔取100 μL加入96孔板，用酶標(biāo)儀讀取590 nm波長處的OD值。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，首先將稀釋好的100 μL基質(zhì)膠均勻鋪于上層小室，室溫固化30 min，其他實(shí)驗(yàn)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0（Chicago，IL，USA）統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并采用GraphPad Prism 5.0（La Jolla，CA，USA））軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖像。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，癌組織與癌旁組織中hsa_circ_0000591表達(dá)水平的比較采用配對樣本t檢驗(yàn)；非配對設(shè)計(jì)兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步多重比較采用Bonferroni檢驗(yàn)；采用Kaplan?Meier法計(jì)算生存率，組間比較采用 Log?rank檢驗(yàn)。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hsa_circ_0000591的鑒定

針對hsa_circ_0000591分別設(shè)計(jì)內(nèi)擴(kuò)型引物（Convergent primer）和外擴(kuò)型引物（Divergent primer），提取HepG2細(xì)胞的gDNA和RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，提取gDNA和cDNA后分別用兩種引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示內(nèi)擴(kuò)型引物可以在cDNA及gDNA中擴(kuò)增出條帶，外擴(kuò)型引物只能在gDNA中擴(kuò)增出條帶，見圖1A。

對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測序，比對是否與剪切位點(diǎn)序列一致。結(jié)果顯示，3′端的GTAAGT與5′端的GATGGG相連，證實(shí)hsa_circ_0000591來源于chr15：41961026?41962156反向剪切形成的環(huán)狀RNA，見圖1B。將HepG2細(xì)胞核質(zhì)分離后，qRT?PCR檢測結(jié)果顯示，hsa_circ_0000591主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，見圖1C。

圖1 環(huán)狀RNA hsa_circ_0000591的鑒定Fig.1 Identification of circular RNA hsa_circ_0000591

2.2 hsa_circ_0000591在HCC組織中的表達(dá)及其對預(yù)后的影響

qRT?PCR檢測結(jié)果顯示，hsa_circ_0000591在HCC組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織（t=2.466，P＜0.001），見圖2A。以hsa_circ_0000591表達(dá)中位數(shù)為分界，分為 hsa_circ_0000591高表達(dá)組（n=42）和 hsa_circ_0000591低表達(dá)組（n=42）。84例HCC患者至隨訪結(jié)束存活48例，5年總生存率為57.14%。高表達(dá)患者術(shù)后5年總生存率為47.2%，低表達(dá)患者為69.1%；兩組患者生存曲線比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.812，P＝0.002），見圖2B。

圖2 hsa_circ_0000591在HCC組織中的表達(dá)及其對預(yù)后的影響Fig.2 Expression of hsa_circ_0000591 in HCC tissues and its influ?ence on prognosis

2.3 hsa_circ_0000591在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)及沉默效果

qRT?PCR檢測結(jié)果顯示，hsa_circ_0000591在肝癌細(xì)胞系Li?7、HepG2、Hep3B、Huh7及人正常肝細(xì)胞系HL?7702中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2 967.884，P=0.012），其中在Hep3B細(xì)胞中的表達(dá)量高于其余肝癌細(xì)胞系及正常肝細(xì)胞系HL?7702（均P＜0.05），見圖3A。經(jīng)過嘌呤霉素篩選2周后，用qRT?PCR法檢測NC組和siRNA組hsa_circ_0000591的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，siRNA組Hep3B細(xì)胞中hsa_circ_0000591表達(dá)水平高于NC組（12.19±1.69vs1.14±0.37，t=8.190，P=0.024），見圖3B。表明成功建立沉默hsa_circ_0000591的Hep3B細(xì)胞株。

圖3 qRT?PCR檢測hsa_circ_000059在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)及沉默效果Fig.3 Expression and silencing effect of hsa_circ_000059 in liver cancer cell lines detected by qRT?PCR

2.4 沉默hsa_circ_0000591對肝癌Hep3B細(xì)胞增殖的影響

CCK?8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，感染24 h、48 h、72 h時(shí)后，siRNA組Hep3B細(xì)胞增殖能力較NC組降低（均P＜0.01），見圖4A。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組比較，siRNA組Hep3B細(xì)胞克隆形成數(shù)減少（t=24.568，P=0.002），見圖4B。

圖4 沉默hsa_circ_0000591對Hep3B細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effect of silencing hsa_circ_0000591 on the proliferation of Hep3B cells

2.5 沉默hsa_circ_0000591對肝癌Hep3B細(xì)胞遷移和侵襲的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，24 h、48 h、72h時(shí)，siRNA組細(xì)胞遷移數(shù)目均較NC組少（均P＜0.05），見圖5。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siRNA組細(xì)胞侵襲和遷移數(shù)目均較NC組少（均P＜0.05）。見圖6。

圖5 沉默hsa_circ_0000591對Hep3B細(xì)胞遷移的影響Fig.5 Effect of silencing hsa_circ_0000591 on the migration of Hep3B cells

圖6 沉默hsa_circ_0000591對Hep3B細(xì)胞侵襲和遷移的影響Fig.6 Effect of silencing hsa_circ_0000591 on the migration and invation of Hep3B cells

3 討論

肝癌的發(fā)病機(jī)制涉及諸多關(guān)鍵信號途徑［9］，環(huán)狀RNA作為非編碼RNA家族中的一員，與線性RNA不同，環(huán)狀RNA由于具有閉合環(huán)路結(jié)構(gòu)，不具備5′帽子和3′尾巴結(jié)構(gòu)，具有保守、穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)特征［10］。環(huán)狀RNA生物功能包括作為microRNA海綿、調(diào)節(jié)基因剪接和轉(zhuǎn)錄、作為RNA結(jié)合蛋白海綿和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯等［11?15］。越來越多的證據(jù)表明，環(huán)狀 RNA 具有重要的生物學(xué)意義，在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等發(fā)揮重要的調(diào)控作用［16?17］。目前多項(xiàng)研究證明環(huán)狀RNA異常表達(dá)可以促進(jìn)或抑制肝癌的發(fā)生與進(jìn)展。例如，F(xiàn)AN等［18］研究發(fā)現(xiàn)circARHGAP12在鼻咽癌中作為促癌基因發(fā)揮作用，在鼻咽癌組織和細(xì)胞系中circARHGAP12表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲。而LIU等［19］報(bào)道，在HCC組織中circRNA?5692表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)circRNA?5692可抑制HCC細(xì)胞生長，說明circRNA?5692作為抑癌基因發(fā)揮作用。也有研究顯示環(huán)狀RNA在HCC中充當(dāng)促癌基因，如HUANG等［20］報(bào)道hsa_circRNA_104348在HCC組織和細(xì)胞中均上調(diào)，并促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，而抑制細(xì)胞凋亡。

基于本課題組前期對HCC術(shù)后切除組織的測序的結(jié)果，本研究選擇在肝癌中表達(dá)差異較明顯的hsa_circ_0000591作為研究對象，首先分析hsa_circ_0000591在肝癌組織中的表達(dá)及對患者預(yù)后的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0000591在肝癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，且高表達(dá)組患者的總生存率較低，這與前期測序預(yù)測方向一致。為進(jìn)一步闡明hsa_circ_0000591在肝癌惡性生物學(xué)行為中的作用，本研究建立沉默hsa_circ_0000591的Hep3B細(xì)胞模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默hsa_circ_0000591可以顯著抑制肝癌細(xì)胞在體外的增殖、遷移及侵襲能力，并初步推測hsa_circ_0000591可能與miRNA結(jié)合并通過經(jīng)典的circRNA?miRNA?mRNA軸發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。下一步將通過生物信息學(xué)分析，利用雙熒光素酶等實(shí)驗(yàn)篩選和驗(yàn)證與hsa_circ_0000591結(jié)合的miRNA，探索miRNA下游作用的mRNA，為肝癌潛在的分子機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

綜上所述，hsa_circ_0000591在肝癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，沉默hsa_circ_0000591可抑制Hep3B細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。hsa_circ_0000591可能是參與肝癌惡性生物學(xué)功能的重要分子，有望成為肝癌預(yù)后預(yù)測指標(biāo)以及治療靶點(diǎn)。但本研究僅針對一個(gè)細(xì)胞系，且未驗(yàn)證過表達(dá)hsa_circ_0000591的作用，因此hsa_circ_0000591在肝癌發(fā)生發(fā)展中確切的作用及其分子機(jī)制仍需后續(xù)深入研究。