宋偉 袁文正 任俊 付濤

環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是由特定的反向剪接機制形成[1]。近年來，高通量RNA測序和生物信息學(xué)算法已經(jīng)在真核生物中發(fā)現(xiàn)了數(shù)千種環(huán)狀RNA，其中一些具有明確的生物功能[2]。與線性RNA不同，環(huán)狀RNA不是由經(jīng)典的剪接模式產(chǎn)生，而是通過反向剪接產(chǎn)生。雖然反向剪接的效率通常比線性剪接低，但是環(huán)狀RNA具有很高的穩(wěn)定性，可以以時間調(diào)節(jié)的方式在特定的細胞類型中累積[3]。此外，盡管環(huán)狀RNA通常表達的水平低于其線性mRNA，但對于許多基因而言，環(huán)狀RNA是主要的轉(zhuǎn)錄物[4]，這表明一些蛋白質(zhì)編碼基因的主要功能可能是產(chǎn)生環(huán)狀RNA，而不是線性mRNA或蛋白質(zhì)。環(huán)狀RNA的生成有多種途徑，常見形成機制包括剪接體介導(dǎo)的環(huán)化、內(nèi)含子配對介導(dǎo)的環(huán)化及RNA結(jié)合蛋白介導(dǎo)的環(huán)化等[5-7]。研究表明，環(huán)狀RNA具有多種功能，主要包括作為miRNA的海綿、與蛋白質(zhì)相互作用、翻譯功能以及調(diào)控親本基因的轉(zhuǎn)錄[8-10]。

一、環(huán)狀RNA在結(jié)直腸癌中的表達譜

RNA測序和環(huán)狀RNA微陣列是環(huán)狀RNA全基因組分析的最常用方法。環(huán)狀RNA表達譜的鑒定是判定其作為促癌基因或抑癌基因的前提。結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)病人的組織、細胞、外泌體中已鑒定出數(shù)千種環(huán)狀RNA。Zheng等[11]通過基因芯片分析10例結(jié)腸癌及癌旁組織中環(huán)狀RNA的表達譜，共發(fā)現(xiàn)126個差異表達的環(huán)狀RNA，其中有110個上調(diào)的環(huán)狀RNA和16個下調(diào)的環(huán)狀RNA。這些環(huán)狀RNA大多位于外顯子區(qū)域。Li等[12]通過對4對CRC及癌旁組織進行環(huán)狀RNA測序，共測到21 458個環(huán)狀RNA。經(jīng)過P值和FC篩選后，鑒定出448個差異表達的環(huán)狀RNA(394個上調(diào)環(huán)狀RNA和54個下調(diào)環(huán)狀RNA)，其中有15個環(huán)狀RNA為首次發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀RNA。他們對其中10個在20對CRC組織中進行qRT-PCR驗證。結(jié)果表明，circASPHD1、circHOMER1、circAPLP2、circVAPA和circTRAPPC9表達上調(diào)，circPRKAG2、circITFG2、circDDX17、circTRPM4和circLMF1表達下調(diào)，與測序結(jié)果一致。最后，通過對差異倍數(shù)最大的環(huán)狀RNA并結(jié)合KEGG通路分析，將circDDX17作為候選基因，進行后續(xù)的功能研究。同樣，Chen等[13]通過對CRC芯片分析發(fā)現(xiàn)38個環(huán)狀RNA，挑選其中9個有統(tǒng)計學(xué)差異的環(huán)狀RNA作為候選對象。在97例CRC病人的腫瘤及癌旁組織中進行驗證，結(jié)果表明，circNSUN2在CRC組織中表達明顯上調(diào)。此外，與沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和正常對照的CRC病人相比，存在肝轉(zhuǎn)移(liver metastasis,LM)的CRC病人血清中circNSUN2水平也明顯升高。

研究表明，外泌體是傳遞miRNA、lncRNA、蛋白質(zhì)以及環(huán)狀RNA進行細胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的載體[14]。Dou等[15]在三種結(jié)腸癌細胞系分泌的外泌體中檢測到環(huán)狀RNA，并且環(huán)狀RNA在細胞外囊泡中比在細胞中更豐富。Xie等[16]通過對50份CRC和50份正常對照血清外泌體樣品進行RNA序列分析，鑒定出1 924個CRC相關(guān)的環(huán)狀RNA。根據(jù)FC和P值，共篩選出122個差異表達的環(huán)狀RNA，包括100個上調(diào)的環(huán)狀RNAs和22個下調(diào)的環(huán)狀RNAs。

二、環(huán)狀RNA與CRC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系

有研究表明，環(huán)狀RNA可以作為促癌或抑癌基因調(diào)控CRC細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡。相關(guān)機制包括環(huán)狀RNA作為miRNA海綿、與蛋白質(zhì)結(jié)合以及編碼多肽等。

1.環(huán)狀RNA作為CRC致瘤基因：CiRS-7，也稱為CDT1as，是由CDR1基因的反義轉(zhuǎn)錄物通過反向剪接而來。研究最多的是它作為miR-7的海綿功能。在CRC，ciRS-7通過拮抗miR-7介導(dǎo)的EGFR/RAF1/MAPK通路而發(fā)揮致癌作用。過表達ciRS-7可以抵消miR-7對CRC細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用，減少miR-7誘導(dǎo)的細胞凋亡。在體外，ciRS-7減弱了miR-7對EGFR和RAF1的抑制作用。同樣，ciRS7也減弱了miR-7對Erk磷酸化的抑制作用。因此，證實ciRS-7-miR-7-EGFR/RAF1/MAPK調(diào)控軸在CRC進展中的作用[17]。同樣，hsa_circ_101555通過hsa_circ_101555-miR-597-5p-CDK6/RPA3軸影響CRC的進展。hsa_circ_101555在CRC組織和細胞系表達升高，且與臨床病理特征及預(yù)后相關(guān)。沉默hsa_circ_101555可以抑制CRC細胞的增殖、誘導(dǎo)其細胞周期停滯、細胞凋亡和DNA修復(fù)受損。進一步實驗表明，hsa_circ_101555作為miR-597-5p內(nèi)源競爭性RNA上調(diào)CDK6和RPA3的表達水平，從而促進CRC的進展[18]。CircHIPK3來源于HIPK3基因2號外顯子，其剪切成熟序列長度為1099核苷酸。circHIPK3在CRC組織和細胞系中明顯上調(diào)。敲低circHIPK3可以顯著抑制CRC細胞的增殖、遷移、侵襲和誘導(dǎo)凋亡，且可以抑制體內(nèi)CRC細胞的生長和轉(zhuǎn)移。通過雙熒光素酶報告實驗和RNA pull-down實驗證實circHIPK3作為miR-7的海綿。circHIPK3有效地逆轉(zhuǎn)了miR-7對CRC細胞惡性表型的抑制。circHIPK3敲低聯(lián)合miR-7過表達比單獨敲低circHIPK3或過表達miR-7對腫瘤抑制的效果更好[19]。

環(huán)狀RNA除了作為miRNA的海綿，還可以與蛋白質(zhì)結(jié)合，甚至編碼多肽。在CRC中，尤其是在有LM的CRC中，circNSUN2的表達水平升高。體內(nèi)外實驗表明，敲低circNSUN2可以明顯抑制CRC細胞侵襲和遷移。RNA pull-down及RNA免疫共沉淀實驗證明，circNSUN2的CAUCAU基序通過KH3-4雙結(jié)構(gòu)域與IGF2BP2蛋白結(jié)合。circNSUN2可以促進IGF2BP2與HMGA2 mRNA之間的相互作用，并通過circNSUN2/IGF2BP2/HMGA2 RNA-蛋白三元復(fù)合物的形成來增強HMGA2穩(wěn)定性，促進CRC的轉(zhuǎn)移[13]。CircPPP1R12A是由PPP1R12A基因24和25外顯子反向剪接形成。過表達和敲低實驗表明，circPPP1R12A在結(jié)腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲中發(fā)揮了重要作用。通過生信分析預(yù)測，circPPP1R12A可以編碼一個含有73氨基酸的蛋白質(zhì)，實驗證明，circPPP1R12A確實可以編碼蛋白質(zhì)。進一步體內(nèi)外實驗表明，circPPP1R12A-73aa可以促進結(jié)腸癌的增殖、遷移和侵襲。circPPP1R12A-73aa通過激活Hippo-YAP信號通路促進了結(jié)腸癌的生長和轉(zhuǎn)移[11]。Zhi等[20]發(fā)現(xiàn)circLgr4在CRC組織中表達升高，且與非轉(zhuǎn)移性腫瘤相比，轉(zhuǎn)移性腫瘤circLgr4表達更高。敲低circLgr4可以抑制CRC干細胞的自我更新、CRC的發(fā)生和侵襲，而circLgr4過表達則起相反的作用。通過蛋白質(zhì)免疫印跡和共聚焦檢測等證實了circLgr4具有編碼多肽的能力，且circLgr4編碼多肽在腫瘤干細胞維持、自我更新和侵襲中起著至關(guān)重要的作用。circLgr4編碼的多肽可以作用并激活Lgr4，從而進一步促進Wnt/β-catenin信號的激活。

2.環(huán)狀RNA作為CRC抑癌基因：CircITGA7是由ITGA7第4外顯子反向拼接形成。circITGA7在CRC組織及細胞系中表達下調(diào)，且與腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)。circITGA7過表達可以抑制CRC細胞增殖和轉(zhuǎn)移，相反，敲低circITGA7可促進CRC細胞增殖和遷移。通過一系列實驗證實，circITGA7通過吸附miR-370-3p，上調(diào)神經(jīng)纖維蛋白1(NF1)抑制Ras信號通路。此外，他們還研究了circITGA7的上游機制，發(fā)現(xiàn)circITGA7可以通過Ras途徑抑制RREB1，從而上調(diào)其宿主基因ITGA7的轉(zhuǎn)錄[21]。Shen等[22]發(fā)現(xiàn)沉默circ_0026344增加了CRC細胞的遷移和侵襲能力，并增加了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程，而過表達circ_0026344導(dǎo)致相反的結(jié)果。機制上，circ_0026344過表達可以明顯下調(diào)Wnt/β-catenin途徑中核心蛋白的表達水平，而miR-183 mmic可以逆轉(zhuǎn)circ_0026344過表達對Wnt/β-catenin通路的抑制作用。circDDX17是由DDX17基因第2-8外顯子構(gòu)成，其長度約927堿基。circDDX17表達水平在CRC組織及細胞系中明顯下調(diào)。體外實驗表明，沉默circDDX17可以促進CRC細胞的增殖、遷移、侵襲及抑制細胞凋亡[12]。Jin等[23]表明hsa_circ_0000523在不同的CRC細胞系中表達下調(diào)。敲低hsa_circ_0000523可以促進CRC細胞的增殖和抑制其凋亡。hsa_circ_0000523通過海綿吸附miR-31 增加DDK1表達，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，抑制CRC的進展。

3.環(huán)狀RNA可以作為CRC潛在的診斷和預(yù)后標志物：盡管環(huán)狀RNA的研究尚處于起步階段，但是環(huán)狀RNA的一些特性表明它們可能是癌癥和其他疾病的潛在有價值的生物標志物。首先，缺乏5＇或3＇末端使得環(huán)狀RNA對RNase具有高度抗性。其次，它們通常以組織和發(fā)育階段的特定方式表達，最后，它們在各種組織和體液中含量豐富，包括血液、尿液、外泌體，使其成為理想的液體活檢生物標志物。

近年來，越來越多的研究表明，環(huán)狀RNA可以作為CRC的診斷和預(yù)后標志物。Wang等[24]表明，hsa_circ_0000567在CRC組織中表達下調(diào)。hsa_circ_0000567 ROC曲線的AUC為0.865 3，其敏感性和特異性分別為0.833 3和0.764 7。此外，他們還發(fā)現(xiàn)CRC病人血液外泌體中的hsa_circ_0000567表達也下調(diào)了，表明hsa_circ_0000567可以作為CRC的診斷標志物。Pan等[25]發(fā)現(xiàn)，與正常人相比，CRC病人血清外泌體中hsa-circ-0004771表達明顯升高,其AUC為0.88，其敏感性和特異性分別為80.91%和82.86%。在CRC術(shù)后病人的血清中觀察到hsa-circ-0004771的表達下調(diào)了，表明hsa-circ-0004771可以作為CRC病人診斷標志物。Xu等[26]表明circRNA_0001178和circRNA_0000826在CRC肝轉(zhuǎn)移組織中表達顯著上調(diào)。ROC曲線表明，circRNA_0001178和circRNA_0000826的AUC分別為0.945和0.816，表明它們具有診斷結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的潛力。同樣，Lin等[27]研究表明，三個環(huán)狀RNA(circ-CCDC66、circ-ABCC1和circ-STIL)表達水平在CRC病人的血漿中均顯著降低。ROC曲線顯示，這一組環(huán)狀RNA的AUC值為0.780，高于傳統(tǒng)的癌胚抗原和糖類抗原19-9等蛋白質(zhì)標志物。此外，將環(huán)狀RNA與CEA和CA19-9結(jié)合使用可能會提高診斷CRC的能力(AUC=0.855)。Xie等[16]揭示，與對照組相比，CRC病人的血清外泌體中hsa_circ_0101802(circPNN)表達水平顯著升高。ROC曲線表明，在實驗隊列和驗證隊列中的AUC分別為0.855和0.826，表明circPNN在診斷CRC中具有重要價值。此外，早期CRC血清外體circPNN的AUC為0.854，提示血清外體circPNN可能是CRC早期診斷的潛在生物標志物。

ciRS-7已被認為是多種腫瘤的診斷和預(yù)后標志物，包括結(jié)直腸癌。Weng等[17]表明ciRS-7在CRC中表達升高，且與腫瘤的分期、浸潤的深度、淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。單變量和多變量分析表明，ciRS-7是CRC獨立預(yù)后因子。另一項研究表明，circHIPK3在CRC組織和細胞系中表達上調(diào)，過表達與腫瘤轉(zhuǎn)移和進展分期相關(guān)。此外，多變量生存分析表明，circHIPK3高表達與CRC病人低總生存期密切相關(guān)，表明circHIPK3為CRC的獨立預(yù)后因素[19]。Jin等[28]觀察到CRC組織中hsa_circ_0005075的表達顯著上調(diào)，多變量分析表明，hsa_circ_0005075高表達的CRC病人有著更短的總生存期和無病生存期。同樣，Chen等[29]的研究表明，circ001971為CRC病人總生存期的獨立因素，具有良好的預(yù)后能力(AUC=0.792)。

三、結(jié)論和展望

環(huán)狀RNA參與CRC的各種生理和病理過程，包括增殖、凋亡、侵襲和遷移等。研究最多的功能是環(huán)狀RNA可以作為miRNA的海綿，其他功能還包括與蛋白質(zhì)作用、調(diào)控親本基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯。此外，由于環(huán)狀RNA本身的特性，環(huán)狀RNA作為CRC診斷和預(yù)后的生物標志物，甚至新的治療靶點具有巨大的潛力。越來越多的環(huán)狀RNA研究已經(jīng)揭示了環(huán)狀RNA生物發(fā)生和調(diào)節(jié)的核心內(nèi)容，但要了解這些分子在健康組織和疾病中的調(diào)控和功能，仍需要進行更加深入的功能研究。例如，在特定細胞類型中，尤其在單細胞水平上，確定空間和時間環(huán)狀RNA的表達模式。此外，通過將過表達與CRISPR-Cas9敲除環(huán)狀RNA結(jié)合起來，未來可能會發(fā)現(xiàn)更多環(huán)狀RNA的功能。

綜上所述，近幾年環(huán)狀RNA的研究為我們帶來很多重大的發(fā)現(xiàn)，意味著環(huán)狀RNA具有重要的生物學(xué)意義。隨著RNA技術(shù)的穩(wěn)步發(fā)展，進一步了解環(huán)狀RNA定位、運輸、降解、單細胞分析及環(huán)狀RNA的表觀修飾等可能是未來發(fā)展的方向。