趙杰炳 田浩 尚付生 馮建軍

骨肉瘤是常見(jiàn)的原發(fā)性骨惡性腫瘤，肺和骨是最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移部位［1?2］。手術(shù)和輔助化療能延長(zhǎng)骨肉瘤患者的生存期，但復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或不能手術(shù)切除患者的預(yù)后仍不理想［3?6］。因此，尋找治療骨肉瘤的新方法對(duì)提高患者生存期具有重要的臨床意義。近年來(lái)，研究者們探索了晚期肉瘤多種細(xì)胞免疫治療方案［7］。樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）作為體內(nèi)啟動(dòng)細(xì)胞免疫反應(yīng)的主要抗原呈遞細(xì)胞，可用于增強(qiáng)腫瘤特異性免疫反應(yīng)［8］。而細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine?induced killer cells，CIK）是體內(nèi)重要的免疫活性細(xì)胞，增殖能力和細(xì)胞毒作用強(qiáng)，也能特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞，已成為腫瘤過(guò)繼細(xì)胞免疫治療的首選方案［9］。DC?CIK治療是指將上述兩種細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，從而發(fā)揮更強(qiáng)的腫瘤殺傷作用，目前在包括骨肉瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤中得到了初步驗(yàn)證［10］，但DC?CIK治療骨肉瘤確切的作用尚未明確。研究發(fā)現(xiàn)，抑制程序性細(xì)胞死亡蛋白?1（programmed death receptor?1，PD?1）及其配體（programmed death receptor ligand?1，PD?L1）能顯著增強(qiáng)DC?CIK對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用，誘導(dǎo)更有效的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，說(shuō)明PD?1/PD?L1信號(hào)通路可能是DC?CIK療法的重要機(jī)制［11］。PD?1/PD?L1通路是否在DC?CIK治療骨肉瘤中發(fā)揮同樣作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)共培養(yǎng)DC和CIK，探討其對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞的殺傷作用及其初步的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

人骨肉瘤細(xì)胞HOS細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；6只BALC/c雌性裸鼠購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK（滬）2016?2017，鼠齡8～10周，體重25～30 g，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中，自由飲水飲食，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的操作經(jīng)本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶等細(xì)胞培養(yǎng)試劑購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK?8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)；淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)基和Annexin V?FITC/PI試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma?Aldrich公司；重組人粒細(xì)胞?巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rhG?CSF）、重組人白細(xì)胞介素（rhIL?4）、重組人干擾素?γ（rhIFN?γ）、重組人白細(xì)胞介素?2（rhIL?2）和重組人腫瘤壞死因子（rhTNF?a）均購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司；PD?1和PD?L1抗體及相應(yīng)HRP標(biāo)記的第二抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；RIPA裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；流式抗體（CD3、CD8、CD56、CD83和CD86）購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將HOS細(xì)胞凍存管放入37℃水浴中解凍，加入含有10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基5 mL，置于37℃、5% CO2的恒溫?zé)o菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞密度＞80%后，用胰蛋白酶消化傳代或種板培養(yǎng)。

1.3 DC和CIK的分離和共培養(yǎng)

根據(jù)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的研究方案，并參考文獻(xiàn)［8］，采用Ficoll密度梯度離心法從健康志愿者的外周靜脈血中分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood monoculear cell，PBMC），并以5×106/mL的密度接種至RPMI 1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h后，收集貼壁細(xì)胞和非貼壁細(xì)胞，分別分離DC和CIK。DC的分離：向貼壁細(xì)胞中加入1 000 U/mL rhG?CSF和500 U/mL rhIL?4進(jìn)行培養(yǎng)，每3 d更換培養(yǎng)基和細(xì)胞因子；于第6天向DC中加入1 000 U/mL的rhTNF?α繼續(xù)培養(yǎng)2 d，誘導(dǎo)成熟。CIK的分離：將非貼壁細(xì)胞培養(yǎng)于含1 000 U/mL rhIFN?γ的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，孵育24 h后，加入50 ng/mL小鼠抗人CD3單克隆抗體和1 000 U/mL rhIL?2，每3 d補(bǔ)充細(xì)胞因子，傳代培養(yǎng)8 d。

將上述步驟分離得到的DC和CIK常規(guī)培養(yǎng)9 d后，消化、計(jì)數(shù)并按照5∶1的比例混合培養(yǎng)7 d。分別收集當(dāng)天（0 d）和第7天培養(yǎng)的DC、CIK及共同培養(yǎng)的DC?CIK。用PBS洗滌、離心后，將DC與FITC結(jié)合的相應(yīng)抗體（CD83和CD86）、CIK與FITC結(jié)合的相應(yīng)抗體（CD3、CD8和 CD56）置于室溫下反應(yīng) 20 min，再用PBS洗滌2次后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC和CIK的免疫表型。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC和CIK的免疫表型

分別收集DC和CIK，離心，去除上清后加入溶于PBS的FITC結(jié)合相應(yīng)抗體（DC：CD83和CD86；CIK：CD3、CD8和CD56），吹打混勻后于室溫下靜置20 min，取1 mL樣品上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 CCK?8檢測(cè)骨肉瘤HOS細(xì)胞增殖能力

HOS細(xì)胞以1×105/孔的密度接種于6孔板，正常培養(yǎng)24 h后，以相同密度將DC?CIK配入Transwell 6孔板。將共培養(yǎng)的DC?CIK與HOS細(xì)胞在Transwell平板上組裝，其中單純培養(yǎng)的HOS細(xì)胞為正常對(duì)照組（HOS組），以共培養(yǎng)的DC?CIK+HOS細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組（DC?CIK+HOS組）。分別于共培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后取出6孔板，用胰蛋白酶消化，將細(xì)胞置于96孔板（3 000/孔），加入CCK?8溶液（10 μL/孔），繼續(xù)培養(yǎng)1 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A）。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨肉瘤HOS細(xì)胞凋亡能力

DC?CIK與HOS細(xì)胞共培養(yǎng)后，使用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，取1×105個(gè)細(xì)胞重新懸浮在100 μL 1×結(jié)合緩沖液中，然后在室溫下加入5 μL Annexin V和5 μL PI，避光染色 10 min，再加入 400 μL 1×結(jié)合緩沖液，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量分析。

1.7 Western blot法檢測(cè)PD?1/PD?L1信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

各組細(xì)胞加入RIPA裂解液，冰板上裂解5 min，收集細(xì)胞裂解液至離心管中，以12 000 g的速度離心5 min，收集上清液，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，并用上樣緩沖液調(diào)整蛋白濃度，使每組蛋白濃度一致。各組蛋白煮沸5 min后，取10 μg蛋白進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入封閉液封閉1 h，PBS清洗后加入抗PD?1或PD?L1的第一抗體，4℃孵育過(guò)夜；次日用PBS溶液洗膜，加入HRP標(biāo)記的相應(yīng)第二抗體，室溫反應(yīng)1 h，再次洗膜，使用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白的表達(dá)。用Image J軟件分析條帶圖片，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白的吸光度比值。

1.8 構(gòu)建裸鼠移植瘤模型

裸鼠左右腋窩或左右腹股溝每次注射0.2 mL含HOS細(xì)胞的PBS溶液（細(xì)胞密度為1×106/mL），第2天和第3天分別原位復(fù)種1次，構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型。待腫瘤生長(zhǎng)14 d后，將裸鼠隨機(jī)分為HOS+DC?CIK組和HOS組，每組3只。HOS組不作任何處理，HOS+DC?CIK組注射DC?CIK細(xì)胞（1×106個(gè)細(xì)胞），每次在腫瘤組織周?chē)?個(gè)位點(diǎn)分別注射0.05 mL含DC?CIK混合物的PBS溶液（細(xì)胞密度為1×106/mL）。第14天采用二氧化碳安樂(lè)死，剝離腫瘤，用卡尺測(cè)量并計(jì)算各組裸鼠的皮下腫瘤體積。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 6.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用Student′st檢驗(yàn)；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)進(jìn)行Bonferroni檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DC和CIK免疫表型的鑒定

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)DC分化成熟后，CD83+和CD86+陽(yáng)性細(xì)胞比例均高于未成熟的DC（P=0.009，0.006），見(jiàn)圖1A；DC?CIK共培養(yǎng)后，CD3+CD8+和CD3+CD56+的陽(yáng)性細(xì)胞比例均高于CIK單獨(dú)培養(yǎng)組（P=0.004，0.004），見(jiàn)圖1B。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC和CIK的免疫表型Fig.1 The immunophenotype of DC and CIK detected by flow cytometry

2.2 DC?CIK共培養(yǎng)對(duì)人骨肉瘤HOS細(xì)胞增殖和凋亡的影響

CCK?8檢測(cè)結(jié)果顯示，與DC?CIK共培養(yǎng)后，HOS細(xì)胞生長(zhǎng)速度受抑制，且呈時(shí)間依賴(lài)性。培養(yǎng)48 h和72 h后，HOS+DC?CIK組細(xì)胞增殖能力均較HOS組降低（P=0.036，0.002），見(jiàn)圖2A。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與DC?CIK共培養(yǎng)48 h后，HOS細(xì)胞凋亡率高于HOS組［（9.16±0.88）%vs（3.87±0.19）%，P=0.007］，見(jiàn)圖2B。

圖2 DC?CIK共培養(yǎng)對(duì)人骨肉瘤HOS細(xì)胞增殖的影響Fig.2 The effect of DC?CIK on the proliferation and apoptosis of human osteosarcoma HOS cells

2.3 DC?CIK共培養(yǎng)對(duì)PD?1/PD?L1信號(hào)通路的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與DC組和CIK組相比，DC?CIK共培養(yǎng)體系中PD?1的表達(dá)水平明顯下調(diào)（P=0.004，0.007），見(jiàn)圖3A；與DC?CIK共培養(yǎng)后，HOS細(xì)胞中PD?L1的表達(dá)水平也較HOS單獨(dú)培養(yǎng)組明顯下調(diào)（P=0.006），見(jiàn)圖3B。

圖3 DC?CIK共培養(yǎng)對(duì)PD?1和PD?L1表達(dá)的影響Fig.3 The effect of DC?CIK on PD?1 and PD?L1 expression

2.4 DC?CIK共培養(yǎng)對(duì)骨肉瘤HOS細(xì)胞誘導(dǎo)裸鼠皮下腫瘤的影響

所有裸鼠均存活，成瘤率為100%。接種14 d后，HOS+DC?CIK組裸鼠注射DC?CIK，結(jié)果顯示，皮下腫瘤平均體積明顯小于HOS組［（656.1±39.5）mm3vs（938.3±83.1）mm3，P=0.008］，見(jiàn)圖4。

圖4 DC?CIK對(duì)裸鼠皮下腫瘤生長(zhǎng)的影響Fig.4 The effect of DC?CIK on subcutaneous tumor in nude mice

3 討論

腫瘤生物治療是繼手術(shù)、放療和化療后的第四種治療選擇，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景［12?13］。目前臨床上應(yīng)用的免疫細(xì)胞治療主要包括腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞、淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞和CD3單克隆抗體激活的殺傷細(xì)胞等［14?15］。DC具有抗原呈遞能力，是治療性腫瘤疫苗開(kāi)發(fā)的潛在載體［16］。研究顯示采用rhIFN?γ、rhIL?2和CD單克隆抗體刺激人PBMC可以獲得CIK，并表達(dá)T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（natural kill?er cells，NK）的表面標(biāo)志物［17］。本研究使用這一細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)，在體外成功分離并共培養(yǎng)DC?CIK，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

CIK是一種T細(xì)胞亞群，具有NK細(xì)胞特性，DC和CIK在體內(nèi)外對(duì)多種癌細(xì)胞具有較好的細(xì)胞殺傷性，已成功應(yīng)用于多種癌癥患者。此外，CIK能主動(dòng)攻擊表達(dá)CD3/CD56的腫瘤細(xì)胞，與DC共培養(yǎng)時(shí)，殺傷效果更顯著［18］。例如，DC?CIK在體外培養(yǎng)中能對(duì)人食管癌ECA?109細(xì)胞實(shí)現(xiàn)有效地殺傷，在荷瘤小鼠模型中，DC?CIK也能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)［19］。CIK與DC聯(lián)合應(yīng)用在非小細(xì)胞肺癌、肝細(xì)胞癌和卵巢癌等多種腫瘤中也展現(xiàn)了較好的殺傷效果［20?22］。本研究首先在體外分離并共培養(yǎng)了DC?CIK，并在體外和體內(nèi)研究中證實(shí)其對(duì)人骨肉瘤HOS細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷能力，不僅能顯著抑制HOS細(xì)胞的增殖活性，增加細(xì)胞凋亡比例，同時(shí)在裸鼠移植瘤模型中也觀察到DC?CIK能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。類(lèi)似地，有研究報(bào)道，肝癌干細(xì)胞抗原負(fù)載的DC可激活針對(duì)含抗原細(xì)胞的特異性?xún)?nèi)源性細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)，從而在裸鼠模型中有效抑制腫瘤生長(zhǎng)［23］。

阻斷免疫檢查點(diǎn)相關(guān)信號(hào)通路是逆轉(zhuǎn)免疫抑制和誘導(dǎo)免疫殺傷的抗癌研究熱點(diǎn)之一。PD?1/PD?L1信號(hào)通路能抑制效應(yīng)T淋巴細(xì)胞活化，從而誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸［24］。PD?1/PD?L1作為重要的免疫檢查點(diǎn)蛋白，被認(rèn)為是腫瘤誘導(dǎo)免疫抑制的關(guān)鍵機(jī)制。最近研究［25?26］發(fā)現(xiàn)，抗PD?1治療能促進(jìn)DC?CIK增殖分化為CD3+CD56+NKT細(xì)胞和CD3+CD8+CTL細(xì)胞，同時(shí)顯著上調(diào)DC?CIK中IFN?γ、TNF?α等免疫刺激性細(xì)胞因子分泌，從而下調(diào)免疫抑制性細(xì)胞因子IL?10分泌，此外抗PD?1也能促進(jìn)DC?CIK細(xì)胞的早期活化。這些研究結(jié)果表明，抗PD?1在DC?CIK增殖、分化和早期激活中發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)控作用。為檢驗(yàn)DC?CIK共培養(yǎng)體系中PD?1/PD?L1信號(hào)通路的改變，本研究檢測(cè)DC?CIK共培養(yǎng)細(xì)胞中PD?1的表達(dá)以及HOS細(xì)胞中PD?L1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在DC?CIK共培養(yǎng)體系中，PD?1表達(dá)量顯著下降；DC?CIK與HOS細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)PD?L1表達(dá)被顯著抑制，提示PD?1/PD?L1可能是DC?CIK發(fā)揮抗腫瘤作用的關(guān)鍵通路。

本研究證實(shí)，DC?CIK共培養(yǎng)對(duì)人骨肉瘤HOS細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷能力，能抑制HOS細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且DC?CIK共培養(yǎng)可能通過(guò)靶向調(diào)控PD?1/PD?L1信號(hào)通路發(fā)揮作用。本研究結(jié)果為骨肉瘤的免疫治療提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。