卞偉鋼 陳平 周小寧 陳海婷 宋曙

胃癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，化療是晚期胃癌患者的主要治療方式，但有效率僅為40%，其中化療藥物耐藥是影響療效的主要原因之一［1?2］。因此，深入研究胃癌的耐藥機(jī)制，有助于提高癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，從而提高療效。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是長(zhǎng)度超過(guò)200 nt的非編碼核苷酸片段。既往研究顯示lncRNA異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生及耐藥性有關(guān)［3］。其中有研究報(bào)道長(zhǎng)鏈非編碼（lncRNA）核仁小RNA宿主基因 l（small nucleolar RNA host gene l，SNHGl）通過(guò)調(diào)控DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖［4］。也有研究發(fā)現(xiàn) miR?101?3p 在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和分化中發(fā)揮重要作用，其異常表達(dá)與腫瘤耐藥性有關(guān)［5］。FAN等［6］在胰管腺癌中過(guò)表達(dá)miR?101?3p發(fā)現(xiàn)能抑制核糖核酸還原酶M1（RRM1）表達(dá)，提高細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性。在非小細(xì)胞肺癌中上調(diào)lncRNA SNHG1表達(dá)可抑制miR?101?3p表達(dá)，激活Wnt/β?catenin信號(hào)通路從而參與非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展［7?8］。奧沙利鉑（OXA）是胃癌化療的主要組成藥物之一，但目前胃癌奧沙利鉑耐藥的機(jī)制尚未清楚。本研究探討lncRNA SNHG1對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC?823奧沙利鉑耐藥性的影響及其是否通過(guò)靶向調(diào)控miR?101?3p發(fā)揮作用，以期為胃癌奧沙利鉑耐藥性提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人胃癌細(xì)胞BGC?823購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；奧沙利鉑購(gòu)自江蘇恒瑞制藥有限公司；si?SNHG1和si?NC由Thermo公司設(shè)計(jì)并合成；Trizol試劑、LipofectamineTM2000、雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；SNHG1、miR?101?3p、人類(lèi)多藥耐藥基因（multi?drug resistance gene 1，MDR1）、U6、β?actin引物序列由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成；RIPA裂解液、BCA試劑盒、ECL試劑盒、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體等均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒、Annexin V/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；兔抗人P?gp、MRP、β?actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

人胃癌耐藥細(xì)胞株BGC?823/OXA由本實(shí)驗(yàn)前期建立。BGC?823/OXA細(xì)胞接種于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，按照LipofectamineTM2000試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。耐藥細(xì)胞BGC?823/OXA分別轉(zhuǎn)染SNHG1干擾RNA（si?SNHG1組）和陰性對(duì)照si?NC（si?NC組），空白對(duì)照組（Control組）不做轉(zhuǎn)染處理。轉(zhuǎn)染4 h后，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入2 mg/mL Puromycin進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選。

1.3 BGC?823/OXA細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的半數(shù)抑制濃度

收集si?SNHG1組和si?NC組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度接種至96孔板中，每孔加入終濃度為1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L的奧沙利鉑，同時(shí)設(shè)置DMSO對(duì)照孔。培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μL的MTT液，孵育4 h后再加入150 μL的DMSO溶液終止培養(yǎng)。用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的光密度（OD）值，繪制生長(zhǎng)曲線，計(jì)算奧沙利鉑的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.4 RT?qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)lncRNA SNHG1、miR?101?3p及MDR1 mRNA表達(dá)水平

根據(jù)RNA提取試劑盒，提取各組細(xì)胞中的總RNA，合成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系共15 μL：上下游引物各 1.5 μL，cDNA 模板 0.5 μL，SYBR Primix Ex TaqTM 8 μL，ddH2O補(bǔ)充至15 μL；PCR反應(yīng)條件：95℃變性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸10 s，進(jìn)行38個(gè)循環(huán)。miR?101?3p以U6為內(nèi)參，lncRNA SNHG1、MDR1以β?actin為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 The primer sequences

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

轉(zhuǎn)染si?NC、si?SNHG1后的BGC?823/OXA細(xì)胞分別用 10 μmol/L奧沙利鉑處理，記為si?NC+OXA 組、si?SNHG1+OXA組，以不加奧沙利鉑的DMSO溶液作為空白對(duì)照組。以每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL的MTT溶液，孵育4 h，再加入150 μL的DMSO溶液終止培養(yǎng)。用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的光密度（OD）值，并計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD/空白對(duì)照組OD）×%。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡能力

si?NC+OXA組和si?SNHG1+OXA組細(xì)胞分別接種于96孔板中培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 μL的Annexin?V?FITC和10 μL的PI，室溫避光孵育30 min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.7 Western blot檢測(cè)P?gp、MRP蛋白的表達(dá)水平

收集各組細(xì)胞，提取總蛋白并檢測(cè)蛋白濃度，取10 μg蛋白經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗P?gp、MRP和β?actin（稀釋濃度均為1∶500），4 ℃孵化過(guò)夜；次日加入HRP標(biāo)記二抗（稀釋濃度為1∶200），室溫孵育1 h，使用ECL試劑盒暗室曝光顯影，分析蛋白條帶灰度值。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

用 starBase v2.0（http：//starbase.sysu.edu.cn/star?base2/browseNcRNA.php）預(yù)測(cè)到 lncRNA SNHG1和miR?101?3p有靶標(biāo)位點(diǎn)，根據(jù)GeneBank中人SNHG1 3′UTR序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增后，將片段整合到pMIR?REPORTTM Luciferase質(zhì)粒中，獲得 SNHG1 3′UTR?熒光素酶報(bào)告載體 SNHG1?wt和 SNHG1?mut質(zhì)粒。BGC?823細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，取上述質(zhì)粒0.5 μg，分別與 miR?101?3p?mimics、miR?101?3p?NC 共轉(zhuǎn)染BGC?823 細(xì)胞 24 h，分為 SNHG1?wt+miR?101?3p?NC組、SNHG1?wt+miR?101?3p?mimics組、SNHG1?mut+miR?101?3p?mimics組和 SNHG1?mut+miR?101?3p?NC組，根據(jù)說(shuō)明書(shū)制備細(xì)胞提取物，測(cè)定各組熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）描述，多組間比較使用單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間比較采用SNK?q檢驗(yàn)，以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BGC?823/OXA細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG1和miR?101?3p的表達(dá)

RT?qPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與BGC?823細(xì)胞相比，耐藥細(xì)胞BGC?823/OXA中l(wèi)ncRNA SNHG1表達(dá)水平升高（1.97±0.21vs1.03±0.18，P＜0.001），miR?101?3p表達(dá)水平降低（0.54±0.07vs0.96±0.10，P＜0.001），見(jiàn)圖1。

圖1 RT?qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BGC?823/OXA細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG1、miR?101?3p的表達(dá)水平Fig.1 Expression of lncRNA SNHG1,miR?101?3p in BGC?823/OXA cells detected by RT?qPCR

2.2 轉(zhuǎn)染si?SNHG1后BGC?823/OXA細(xì)胞中奧沙利鉑的IC50

si?SNHG1轉(zhuǎn)染BGC?823/OXA 細(xì)胞24 h后，奧沙利鉑的IC50為10 μmol/L，低于si?NC組的IC50（22 μmol/L），見(jiàn)圖2。故采用10 μmol/L奧沙利鉑進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同濃度奧沙利鉑對(duì)BGC?823/OXA細(xì)胞活性的影響Fig.2 Effect of different concentrations of oxaliplatin on the viability of BGC?823/OXA cells

2.3 RT?qPCR實(shí)驗(yàn)鑒定BGC?823/OXA細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果

與Control組和si?NC組相比，si?SNHG1組lncRNA SNHG1（0.47±0.09vs1.13±0.19，P＜0.001；0.47±0.09vs1.01±0.16，P＜0.001）、MDR1（0.52±0.08vs1.05±0.13，P＜0.001；0.52±0.08vs0.98±0.11，P＜0.001）表達(dá)水平降低，miR?101?3p表達(dá)水平升高（2.15±0.22vs1.01±0.19，P＜0.001；2.15±0.22vs1.04±0.21，P＜0.001），見(jiàn)圖3。

圖3 RT?qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BGC?823/OXA細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果Fig.3 The transfection effect of BGC?823/OXA cells detected by RT?qPCR

2.4 lncRNA SNHG1與miR?101?3p的靶向關(guān)系驗(yàn)證

starBase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示，lncRNA SNHG1與miR?101?3p 3′UTR區(qū)有結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖4A。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，SNHG1?wt+miR?101?3p?mimics組熒光素酶活性低于SNHG1?wt+miR?101?3p?NC組（0.21±0.06vs0.88±0.09，P＜0.001），見(jiàn)圖4B。表明lncRNA SNHG1與miR?101?3p存在靶向關(guān)系。

圖4 LncRNA SNHG1與miR?101?3p的靶向關(guān)系Fig.4 Targeting relationship between lncRNA SNHG1 and miR?101?3p

2.5 敲減SNHG1對(duì)BGC?823/OXA細(xì)胞增殖能力的影響

MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與 si?NC組相比，si?SNHG1組BGC?823/OXA細(xì)胞存活率降低［（85.42±1.78）%vs（97.35±1.26）%，P＜0.001］；與 si?NC+OXA 組相比，si?SNHG1+OXA 組BGC?823/OXA細(xì)胞存活率降低［（47.25±1.24）%vs（72.36±1.43）%，P＜0.001］，見(jiàn)圖5。

圖5 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲減SNHG1后BGC?823/OXA細(xì)胞的增殖能力Fig.5 Proliferation ability of BGC?823/OXA cells after knocking down SNHG1 detected by MTT assay

2.6 敲減SNHG1對(duì)BGC?823/OXA細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，si?SNHG1組BGC?823/OXA細(xì)胞凋亡率高于si?NC組［（18.41±2.59）%vs（3.56±0.87）%，P＜0.001］；si?SNHG1+OXA 組 BGC?823/OXA細(xì)胞凋亡率高于si?NC+OXA組［（46.72±3.95）%vs（26.58±3.12）%，P＜0.001］，見(jiàn)圖6。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)敲減SNHG1后BGC?823/OXA細(xì)胞的凋亡情況Fig.6 Apoptosis of BGC?823/OXA cells after knocking down SNHG1 detected by flow cytometry

2.7 敲減SNHG1后BGC?823/OXA細(xì)胞中P?gp、MRP蛋白的表達(dá)水平

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與si?NC組比較，si?SNHG1組BGC?823/OXA細(xì)胞中P?gp、MRP蛋白表達(dá)降低（1.01±0.12vs0.85±0.09，P=0.026；1.12±0.13vs0.95±0.11，P=0.035）；與 si?NC+OXA 組相比，si?SN?HG1+OXA組BGC?823/OXA細(xì)胞中P?gp、MRP蛋白表達(dá)水平降低（0.98±0.10vs0.62±0.05，P＜0.001；1.09±0.12vs0.57±0.08，P＜0.001），見(jiàn)圖7。

圖7 Western blot檢測(cè)敲減SNHG1后BGC?823/OXA細(xì)胞中P?gp、MRP蛋白的表達(dá)Fig.7 Expression of P?gp and MRP protein in BGC?823/OXA cells after knocking down SNHG1 detected by Western blot

3 討論

奧沙利鉑具有抗癌譜廣、溶解性和穩(wěn)定性良好等優(yōu)點(diǎn)，常用于晚期胃癌治療［9］。腫瘤多藥耐藥是影響胃癌治療療效的主要原因之一。既往研究表明lncRNA 參與胃癌耐藥［10?11］。其中，有研究顯示lncRNA SNHG1在結(jié)直腸癌、肝癌、胃癌、骨肉瘤等多種腫瘤中異常表達(dá)，且SNHG1上調(diào)與腫瘤大小、TNM分期和總生存率降低相關(guān)［12］。LIU等［13］研究表明，lncRNA SNHG1在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)，且通過(guò)調(diào)節(jié)miR?15b/DCLK1/Notch1軸促進(jìn)胃癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。近年研究還發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG1與癌細(xì)胞耐藥有關(guān)，如 LI等［14］報(bào)道 lncRNA SNHG1通過(guò)上調(diào)miR?21表達(dá)激活A(yù)kt通路，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞索拉非尼耐藥。SHI等［15］發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG1在耐順鉑的非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，SNHG1敲低可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及對(duì)順鉑的抗性，且可能通過(guò)miR?140?5p/Wnt/β?catenin途徑促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的順鉑耐藥性。本研究發(fā)現(xiàn)在胃癌耐藥細(xì)胞BGC?823/OXA中l(wèi)ncRNA SNHG1的表達(dá)水平升高，提示SNHG1可能與BGC?823細(xì)胞耐藥有關(guān)。si?SNHG1轉(zhuǎn)染BGC?823/OXA 細(xì)胞24 h后，奧沙利鉑的IC50約為 10 μmol/L，低于 si?NC 組的 IC50，且細(xì)胞增殖活性降低，而細(xì)胞凋亡率增加，表明敲減SNHG1后BGC?823細(xì)胞對(duì)OXA的敏感性增強(qiáng)。

MDR1定位于第7號(hào)染色體的長(zhǎng)臂上，而P?gp是MDR1編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能將藥物泵出細(xì)胞外，也是腫瘤耐藥性標(biāo)志物［16］。MRP是多藥耐藥形成的機(jī)制之一，也是腫瘤化療失敗的主要原因，而MRP主要通過(guò)介導(dǎo)抗癌藥物轉(zhuǎn)運(yùn)形成耐藥［17］。本研究發(fā)現(xiàn)敲減SNHG1 后 BGC?823/OXA 細(xì)胞中 MDR1、P?gp、MRP表達(dá)水平降低，表明敲減SNHG1表達(dá)可以降低細(xì)胞耐藥性。同時(shí)敲減SNHG1后的BGC?823/OXA細(xì)胞使用10 μmol/L奧沙利鉑處理，結(jié)果細(xì)胞存活率及P?gp、MRP蛋白表達(dá)水平均降低，而細(xì)胞凋亡率增加，進(jìn)一步證實(shí)干擾SNHG1表達(dá)可降低細(xì)胞耐藥性。

研究表明miR?101?3p在大部分腫瘤中低表達(dá)，與腫瘤耐藥有一定相關(guān)性，而在肺癌中過(guò)表達(dá)miR?101?3p有助于提高細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性［18］。SUN等［19］報(bào)道在肝癌耐藥組織與細(xì)胞中miR?101?3p低表達(dá)，且miR?101?3p可以通過(guò)抑制Beclin?1介導(dǎo)的自噬增強(qiáng)肝細(xì)胞癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性。LI等［20］研究表明，在順鉑耐藥膀胱尿路上皮癌（BUC）細(xì)胞系（T24/CDDP）和組織中miR?101?3p表達(dá)下調(diào)，且與BUC對(duì)順鉑的敏感性呈正相關(guān)，而miR?101?3p可能通過(guò)靶向沉默EZH2提高BUC對(duì)順鉑的敏感性。本研究發(fā)現(xiàn)miR?101?3p在BGC?823/OXA細(xì)胞中低表達(dá)，轉(zhuǎn)染si?SNHG1后，BGC?823/OXA 細(xì)胞中 miR?101?3p 表達(dá)升高，提示 miR?101?3p與BGC?823細(xì)胞奧沙利鉑耐藥性可能有關(guān)。經(jīng)starBase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)，lncRNASNHG1與miR?101?3p 3′UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)，且雙熒光素酶基因檢測(cè)報(bào)告證實(shí)lncRNA SNHG1與miR?101?3p存在靶向關(guān)系，表明lncRNA SNHG1可能通過(guò)靶向調(diào)控miR?101?3p表達(dá)而參與BGC?823/OXA的耐藥性。

綜上，lncRNA SNHG1在胃癌奧沙利鉑耐藥細(xì)胞中高表達(dá)，且可能通過(guò)靶向調(diào)控miR?101?3p促進(jìn)奧沙利鉑耐藥性。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究胃癌奧沙利鉑耐藥機(jī)制提供了新的思路，lncRNA SNHG1可能是胃癌潛在的分子靶點(diǎn)。