儲(chǔ)文梅 熊旭東 何淼 計(jì)高榮 陳莉云 童佳 張卓成 李黎

胃癌是發(fā)病率與死亡率均較高的消化道惡性腫瘤，據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告，胃癌在2020年的全球癌癥新發(fā)病例中排名第五，致死率全球排名第四［1］。手術(shù)切除是胃癌的主要治療方式，并以5?氟尿嘧啶（5?fluorouracil，5?FU）為主的化療方案為輔［2］。然而部分患者不可避免地出現(xiàn)耐藥，致使藥物療效降低甚至無效，且化療藥物耐藥胃癌患者目前尚沒有有效的治療方法。白藜蘆醇（resveratrol，RES）是一種來源于虎杖、葡萄與花生等植物的多酚化合物，具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗血栓與抗腫瘤作用，且生物安全性高，毒副作用小，價(jià)格低廉，來源廣泛［3?4］。近年有研究表明，RES可以降低腫瘤多藥耐藥性，提高化療敏感性［4?5］。本研究通過檢測RES及其聯(lián)合 5?FU對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞SGC?7901/5?FU的生物學(xué)效應(yīng)，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

人胃癌細(xì)胞5?FU耐藥株（SGC?7901/5?FU細(xì)胞株）購自北納生物；5?FU購自齊魯制藥有限公司；RES（純度＞98%）購自杭州華安生物技術(shù)有限公司；TRIzolTMReagent購自Invitrogen公司；POWER SYBR GREEN PCR MASTER購自Applied Biosystems公司；ReverTra Ace qPCR RT Kit購自TOYOBO公司；GAPDH抗體購自Proteintec公司；多藥耐藥基因1（multi?drug resistance gene 1，MDR1），P?糖蛋白（P?glycoprotein，P?gp）、Bcl2和Caspase 3抗體購自Abcam公司；Annexin V?FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（C1062S）、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（C1091、Cell Counting Kit?8、C0037）均購自Beyotime公司；實(shí)時(shí)定量PCR儀購自ABI公司；FACS Calibur購自BD Bioscience公司；倒置熒光顯微鏡OLYMPAS IX71購自O(shè)LYMPAS公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

從液氮罐取出裝有SGC?7901/5?FU細(xì)胞的凍存管，放入37℃水浴鍋中復(fù)蘇，800 r/min離心5 min，棄上清液，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞團(tuán)，轉(zhuǎn)移至10 cm2培養(yǎng)皿中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每72 h更換1次培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%后，胰蛋白酶消化，并按1∶3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，96孔板中每孔加入200 μL的2.0×105/mL濃度細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后進(jìn)行不同的加藥處理。實(shí)驗(yàn)分為不同濃度（濃度依次為 0 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L）RES 組、5?FU 組（5 μmol/L 5?FU單獨(dú)作用）和聯(lián)合組（RES與5?FU聯(lián)用）。

1.3 CCK?8檢測SGC?7901/5?FU細(xì)胞增殖能力

采用不同濃度（0 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L）RES作用 SGC?7901/5?FU細(xì)胞24 h、48 h與72 h，以及RES與5?FU單獨(dú)或聯(lián)合作用細(xì)胞48 h后進(jìn)行CCK?8實(shí)驗(yàn)。每孔中加入10 μL CCK?8溶液，在培養(yǎng)箱中孵育2 h，使用酶標(biāo)儀測量450 nm處光密度（OD）值，計(jì)算不同處理組細(xì)胞抑制率，抑制率=［1-（實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD）/（對(duì)照組OD-空白組OD）］×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測SGC?7901/5?FU細(xì)胞凋亡能力

將對(duì)數(shù)生長期的空白對(duì)照組、RES組、5?FU組及聯(lián)合組 SGC?7901/5?FU細(xì)胞，胰酶消化，PBS洗滌，然后用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)后，根據(jù)Annexin V?FITC/PI試劑盒說明書，取5×105個(gè)細(xì)胞，加入適量195 μL AnnexinV?FITC 結(jié)合液，再分別加入 5 μL Annexin V?FITC溶液與10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，室溫孵育15 min，轉(zhuǎn)移至上樣管中，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞待測表面抗原的表達(dá)。

1.5 Tunel免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測SGC?7901/5?FU細(xì)胞形態(tài)

空白對(duì)照組、RES組、5?FU組以及聯(lián)合組SGC?7901/5?FU細(xì)胞用4%多聚甲醛固定10 min，避光條件下，加入Tunel溶液于37℃孵育60 min，最后加入DAPI溶液封片。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡數(shù)量及形態(tài)變化。

1.6 RT?PCR檢測SGC?7901/5?FU細(xì)胞中MDR1、Bcl2和Caspase 3 mRNA的表達(dá)

收集各組細(xì)胞，用TRIzol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，測定其純度和濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書用逆轉(zhuǎn)錄酶將其合成cDNA。以cDNA為模板，GAPDH作為內(nèi)參，對(duì)MDR1、Bcl2和Caspase 3基因進(jìn)行RT?PCR。反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：95℃DNA聚合酶激活20 s，95 ℃變性3 s、60 ℃退火/延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。RT?PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果采用2-△△Ct進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列見表1。

表1 RT?PCR的引物序列Tab.1 Sequences of primers for RT?PCR

1.7 Western blot檢測SGC?7901/5?FU細(xì)胞中P?gp、Bcl2和Caspase 3蛋白的表達(dá)

收集各組細(xì)胞，用BCA試劑盒測定提取的蛋白濃度，制備10%的SDS?PAGE膠，電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入待測一抗P?gp（稀釋濃度為1∶500）、Bcl2（稀釋濃度為1∶1 000）與Caspase 3（稀釋濃度為1∶2 000），于4℃搖床上孵育過夜。第二天加入相應(yīng)濃度的二抗，于室溫條件下孵育2 h。用TBST洗膜3次，每次5 min。在膜上加200 μL發(fā)光液（100 μL A液+100 μL B液），等待2 min后放入顯影儀顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。Image J軟件分析條帶的灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，后續(xù)兩兩比較采用LSD?t，以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RES對(duì)SGC?7901/5?FU細(xì)胞增殖的影響

CCK?8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，24 h 后，與 10 μmol/L相比，200 μmol/L與 400 μmol/L濃度RES作用后細(xì)胞增殖抑制率均升高（均P＜0.001）；48 h后，與 10 μmol/L相比，50 μmol/L、200 μmol/L與 400 μmol/L RES 作用后細(xì)胞增殖抑制率也升高（均P＜0.001）；72 h后，與10 μmol/L相比，50 μmol/L、200 μmol/L與400 μmol/L濃度的RES作用后細(xì)胞增殖抑制率明顯提高（均P＜0.001），見圖1。提示RES能夠有效抑制SGC?7901/5?FU細(xì)胞增殖，且呈劑量與時(shí)間依賴性，其中（98.21±8.45）μmol/L濃度的RES作用細(xì)胞48 h后其抑制率達(dá)50%，因此本研究選擇100 μmol/L RES進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 RES對(duì)SGC?7901/5?FU細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of RES on the proliferation of SGC?7901/5?FU cells

2.2 RES與5?FU聯(lián)合對(duì)SGC?7901/5?FU細(xì)胞增殖的影響

CCK?8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，100 μmol/L RES、5?FU單獨(dú)或兩者聯(lián)合作用于SGC?7901/5?FU細(xì)胞48 h后，聯(lián)合組的細(xì)胞增殖抑制率均較單獨(dú)給藥組高（均P＜0.001），見圖2。

圖2 RES與5?FU對(duì)SGC?7901/5?FU細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of RES and 5?FU on the proliferation of SGC?7901/5?FU cells

2.3 RES與5?FU聯(lián)合對(duì)SGC?7901/5?FU細(xì)胞凋亡的影響

AnnexinV?FITC/PI細(xì)胞流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，100μmol/L RES、5?FU單獨(dú)或兩者聯(lián)合作用SGC?7901/5?FU細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比，各藥物處理組細(xì)胞凋亡率均升高（均P＜0.001）；其中聯(lián)合組凋亡率最高，見圖3。

圖3 RES與5?FU對(duì)SGC?7901/5?FU細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of RES and 5?FU on the apoptosis of SGC?7901/5?FU cells

Tunel免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，各藥物處理組細(xì)胞均出現(xiàn)明顯凋亡現(xiàn)象，其中聯(lián)合組Tunel陽性信號(hào)（核綠色熒光著色）明顯增多，且核出現(xiàn)固縮、碎裂及變形等現(xiàn)象，見圖4。

圖4 RES與5?FU對(duì)SGC?7901/5?FU細(xì)胞形態(tài)的作用（40×）Fig.4 The representative images from the effects of RES and 5?FU on the morphology of SGC?7901/5?FU cells(40×)

2.4 RES聯(lián)合5?FU對(duì)SGC?7901/5?FU細(xì)胞耐藥及凋亡相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的影響

RT?PCR與Western blot實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，100 μmol/L RES、5?FU 單獨(dú)或聯(lián)合作用于 SGC?7901/5?FU細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比，RES組和聯(lián)合組中MDR1 mRNA與P?gp蛋白表達(dá)水平均下降（P＜0.05），且聯(lián)合組變化更明顯；RES組、5?FU組及聯(lián)合組中Bcl2 mRNA與蛋白表達(dá)水平均下降（P＜0.001），Caspase 3 mRNA與蛋白表達(dá)水平均上升（P＜0.001），其中聯(lián)合組變化最明顯。單獨(dú)5?FU處理細(xì)胞時(shí)，MDR1 mRNA及P?gp蛋白表達(dá)水平變化不明顯，見圖5。

圖5 RES與5?FU對(duì)SGC?7901/5?FU細(xì)胞中耐藥及凋亡相關(guān)基因mRNA和蛋白的影響Fig.5 Effect of RES and 5?FU on mRNA and protein levels of drug?resistance and apoptosis?related genes in SGC?7901/5?FU cells

3 討論

RES是一種從百合科藜蘆屬毛葉藜蘆根部提取的多酚類化合物，具有廣泛的藥理作用，目前研究顯示其對(duì)胃癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌等腫瘤細(xì)胞具有明顯抑制作用，且能通過ATP結(jié)合盒（ABC）跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族、信號(hào)傳導(dǎo)通路、SIRTl、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用機(jī)制降低腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性，逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥［5?13］。在胃癌研究中發(fā)現(xiàn)，RES能通過抑制腫瘤生長并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡提高人胃癌阿霉素耐藥細(xì)胞SGC7901/DOX對(duì)阿霉素的敏感性［14］。5?FU是胃癌常用的系統(tǒng)化療藥物，但目前鮮見RES對(duì)胃癌5?FU耐藥細(xì)胞的報(bào)道，在5?FU耐藥細(xì)胞中RES是否發(fā)揮同樣作用尚未知。本研究采用不同濃度的RES處理胃癌耐藥細(xì)胞SGC?7901/5?FU，發(fā)現(xiàn)各濃度RES均能抑制細(xì)胞增殖，并呈劑量與時(shí)間依賴性，且RES與5?FU聯(lián)合作用后能更明顯提高細(xì)胞增殖的抑制效率，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以及出現(xiàn)明顯的凋亡樣形態(tài)改變。說明RES與5?FU聯(lián)合能夠明顯抑制胃癌耐藥細(xì)胞生長，并促進(jìn)耐藥細(xì)胞凋亡。

通過激活信號(hào)通路對(duì)抗細(xì)胞凋亡是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的一個(gè)重要因素，其中Bcl2和Caspase 3在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。當(dāng)腫瘤細(xì)胞被藥物作用而促使細(xì)胞凋亡時(shí)，線粒體膜上抗凋亡基因Bcl2的表達(dá)下降，從而促使細(xì)胞色素C等促凋亡蛋白從線粒體釋放，激活Caspase 3［15］。有研究表明RES可通過上調(diào)Caspase 3與下調(diào)Bcl2表達(dá)促進(jìn)人大腸癌奧沙利鉑耐藥細(xì)胞HCT116/OXA凋亡，從而逆轉(zhuǎn)其耐藥性［16］。本研究發(fā)現(xiàn)RES與5?FU不管是單獨(dú)作用還是兩藥聯(lián)合都能誘導(dǎo)SGC?7901/5?FU細(xì)胞凋亡，致使細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)核固縮、碎裂與變形等現(xiàn)象，而這可能是通過上調(diào)Caspase 3與下調(diào)Bcl2表達(dá)實(shí)現(xiàn)。

MDR1位于人7號(hào)染色體長臂，能夠編碼分子量為170 kD的細(xì)胞膜糖蛋白P?gp。P?gp是主要存在于細(xì)胞膜的ABC跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中最大的蛋白，能促使化療藥物泵出細(xì)胞而致使藥物濃度下降，是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性的主要蛋白。既往研究表明MDR1表達(dá)與SGC?7901/5?FU細(xì)胞對(duì)5?FU的耐藥性呈正相關(guān)［17?18］。MDR1與 P?gp以不同的表達(dá)水平存在于不同腫瘤類型中，但當(dāng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥時(shí)，兩者表達(dá)均升高，因此MDR1基因與P?gp蛋白常被作為腫瘤耐藥的標(biāo)志。已有研究表明，RES能在人乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞MCF?7/ADR與人口腔上皮癌耐藥細(xì)胞系KBv200中通過下調(diào)MDR1基因和P?gp蛋白表達(dá)逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥性，提高其對(duì)化療藥物的敏感性［19?20］。本研究同樣發(fā)現(xiàn)RES單藥及其聯(lián)合5?FU作用于SGC?7901/5?FU細(xì)胞后，MDR1 mRNA及P?gp蛋白表達(dá)水平均明顯降低，提示RES可能通過調(diào)控MDR1表達(dá)并抑制P?gp的藥物外排泵功能而提高胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。

綜上所述，RES能通過下調(diào)多藥耐藥基因MDR1/P?gp蛋白表達(dá)而降低胃癌耐藥細(xì)胞SGC?7901/5?FU的耐藥性，從而抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，RES可能是胃癌增強(qiáng)化療敏感性的藥物。未來有望以RES聯(lián)合給藥等方式應(yīng)用于胃癌治療研究領(lǐng)域，從而逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞因長期化療而產(chǎn)生的多藥耐藥性，提高胃癌治療效果。