陳曦 馮雁 劉螢照 毛露 黃春桃 王琪

卵巢癌是常見的婦科生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，但死亡率居?jì)D科惡性腫瘤之首［1］。卵巢癌發(fā)病隱匿，早期無典型癥狀，臨床發(fā)現(xiàn)多為中晚期，死亡率高，預(yù)后極差，嚴(yán)重威脅患者生命。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，每年約有14萬例患者死于卵巢癌，卵巢癌也是全球女性第7種最常見的癌癥形式和第8大癌癥相關(guān)死亡原因［2?3］。從組織學(xué)和分子水平來看，卵巢癌是一種臨床上多樣化、形態(tài)和分子異質(zhì)性的疾病［4］。因此亟需探索適應(yīng)精準(zhǔn)治療的研究模型補(bǔ)充現(xiàn)有常用模型的不足。

類器官是三維培養(yǎng)具有干性潛能的細(xì)胞所形成的相應(yīng)器官的部分組織［5］。傳代后，類器官與相應(yīng)的腫瘤在基因組水平上仍然高度相似，能表現(xiàn)出某些疾病的遺傳，表觀遺傳表型的能力也可能使特定干預(yù)成為促進(jìn)個(gè)性化醫(yī)學(xué)的工具［6?7］。類器官能夠一定程度還原特定的三維結(jié)構(gòu)、細(xì)胞類型組成和真實(shí)器官的功能，同時(shí)保持簡(jiǎn)化和易于獲取的細(xì)胞培養(yǎng)模型。因此，類器官為一系列生物和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用帶來了巨大希望。在基礎(chǔ)組織和器官生物學(xué)研究中已經(jīng)揭示了利用類器官重現(xiàn)體內(nèi)現(xiàn)象的可能性。其中類器官也可以來源于腫瘤組織。腫瘤類器官不僅為癌癥研究和治療提供穩(wěn)定可靠的模型，也為癌癥個(gè)體化治療開辟新的方向。由于類器官保留了原發(fā)性腫瘤的許多特征，且能夠進(jìn)行體外生長(zhǎng)和大規(guī)模擴(kuò)增，因此縮減了傳統(tǒng)細(xì)胞系和基于原始樣本的方法之間的關(guān)鍵差距。本研究探索了卵巢癌類器官模型的制備方法，采用新的類器官培養(yǎng)體系延長(zhǎng)卵巢癌原代細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間，在三維條件下培養(yǎng)形成類器官球組織，為后續(xù)患者的個(gè)體化治療研究提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料和方法

1.1 組織來源

卵巢癌組織取自2019—2020年于廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院初次手術(shù)且未接受新輔助化療的3例晚期高級(jí)別漿液性腺癌卵巢癌患者，經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和儀器

Matrigel購(gòu)自美國(guó)Corning公司，24孔低吸附板和70 μm細(xì)胞篩均購(gòu)自德國(guó)Merck公司。DMEM/F12（含1%HEPES）培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，RSPO1 購(gòu)自美國(guó)Genscript公司，Noggin、EGF、FGF?10、rHubFGF（FGF2）購(gòu)自上海普欣生物技術(shù)有限公司，Glutamax、TrypLE、CollagenaseⅠ和B27購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，nicotinamide、N?acetylcysteine、prostaglandin E2、SB202190和Y?27632均購(gòu)自美國(guó)Selleckchem公司，A83?01購(gòu)自美國(guó)TOCRIS公司，類器官凍存液購(gòu)自北京科途醫(yī)學(xué)科技有限公司，抗體p53（貨號(hào)250143）、PAX?8（貨號(hào)R25283）、WT?1（貨號(hào)：251321）和CK7購(gòu)自成都正能，即用型快捷免疫組化MaxVision試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，倒置顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司，全景倒置掃描儀購(gòu)自江蘇斯托利儀器儀表有限公司，石蠟切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Laica公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶液的配制 類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)液：向DMEM/F12 培養(yǎng)基加入1%HEPES、1×Glutamax。類器官完全培養(yǎng)基：主要參考Hill所在研究組發(fā)表的文獻(xiàn)［8］：DMEM/F12培養(yǎng)基加入1%HEPES、1×Glutamax、1%HEPES、50 μg/mL RSPO1、100 ng/mL Noggin、50 ng/mL EGF、10 ng/mL FGF?10、10 ng/mL FGF?2、1×B27、10 mmol/L nicotinamide、1.25 mmol/L N?acetylcysteine、1 μmol/L prostaglandin E2、10 μmol/LSB202190 、500 nmol/L A83?01 以及 10 μmol/L Y?27632。組織清洗液：含10%青霉素和鏈霉素的1×PBS溶液。

1.3.2 類器官的構(gòu)建 取術(shù)中切除的卵巢癌原發(fā)灶組織，嚴(yán)格采取無菌操作原則，切取約1 cm3的樣本放入類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基中保存。取回的癌組織標(biāo)本放入60 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，用組織清洗液沖洗，去除血塊、壞死及纖維成分。清理干凈的組織中加入4 mL濃度100 U/mL CollagenaseⅠ消化，剪碎至1 mm3的小碎塊，加少量培養(yǎng)液保持組織濕潤(rùn)。將組織碎塊轉(zhuǎn)至24孔低吸附培養(yǎng)板中，每孔滴加0.2 mL的CollagenaseⅠ。繼續(xù)剪碎組織，待碎塊呈細(xì)末狀，滴入0.3 mL的CollagenaseⅠ，放入37℃培養(yǎng)箱消化約30 min。然后取出孔板，于倒置顯微鏡下觀察孔板內(nèi)細(xì)胞是否分離成單個(gè)或數(shù)個(gè)成簇的狀態(tài)，若未完全分離，用移液吸頭輕輕吹吸組織塊數(shù)次，繼續(xù)于37℃環(huán)境消化，每隔10 min觀察1次，整個(gè)消化過程不超過90 min。將孔板中的消化產(chǎn)物用70 μm細(xì)胞篩過濾，收集至50 mL離心管內(nèi)，加入30 mL 4℃預(yù)冷基礎(chǔ)培養(yǎng)基，1000rpm離心3 min，棄上清液。重復(fù)2次，收集細(xì)胞沉淀，用冰上預(yù)冷的類器官完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/mL。然后將Matrigel與細(xì)胞懸液以1∶9體積充分混合后置于冰上，種板時(shí)滴入24孔低吸附板中心位置，每孔0.3 mL。種板后將培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)箱50 min。Matrigel固化后，沿培養(yǎng)板壁緩慢加入0.3 mL類器官完全培養(yǎng)基，每3 d更換1次培養(yǎng)基，約每2周傳代。

1.3.3 類器官的傳代、凍存和復(fù)蘇 鏡下觀察細(xì)胞球體體積達(dá)到100 μm時(shí)進(jìn)行傳代。將待傳代的Matrigel和培養(yǎng)基移至15 mL離心管中，加入適量PBS，用槍頭輕柔吹打混勻，300 g離心3 min，去除上清液，收集沉淀。向沉淀中加入約2 mL的TrypLE，輕柔吹打，分散團(tuán)塊，37℃環(huán)境消化同時(shí)保持鏡下觀察，直至類器官酶解至3～5個(gè)細(xì)胞的小細(xì)胞團(tuán)狀態(tài)。終止消化時(shí)向細(xì)胞團(tuán)塊加入5 mL完全培養(yǎng)基，槍頭輕柔吹打混勻，300 g離心3 min，去除上清液，收集沉淀。傳代比例為1∶2～1∶3。一部分類器官加入類器官凍存液凍存，密度約為1×106/mL，放入梯度凍存盒于-80℃環(huán)境過夜后轉(zhuǎn)移至液氮長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)凍存管用37℃水浴，溶解后快速轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，添加5 mL完全培養(yǎng)基，用移液管輕輕吹打3次，300 g離心3 min，去除上清液，種板培養(yǎng)。

1.3.4 類器官包埋切片 將從Matrigel中吹打分離出來的類器官用擦鏡紙包裹，浸入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，然后用梯度（50%、70%、80%、95%、100%×2，每梯度30 min）乙醇脫水；放入二甲苯乙醇對(duì)半溶液30 min，再轉(zhuǎn)入純二甲苯中浸漬2次，每次1 h。類器官進(jìn)行石蠟包埋，切成厚度約為5 μm薄片，黏玻片并干燥。

1.3.5 HE染色 石蠟切片用二甲苯脫蠟2次，每次20 min；在無水乙醇與二甲苯對(duì)半混合液中透明30 min，梯度（100%×2、95%、90%、85%、去離子水，每梯度5 min）乙醇復(fù)水。用蘇木素染色15 min，用體積分?jǐn)?shù)2%鹽酸乙醇分色2 min，流水沖洗使切片返藍(lán)約15 min，浸入95%乙醇30 s。用伊紅染色液染色5 min，浸入95%乙醇2次（每次30 s），然后放入100%乙醇中脫水30 min，在無水乙醇與二甲苯對(duì)半混合液中透明30 min，浸入純二甲苯30 s，中性樹膠封片，室溫陰干。

1.3.6 免疫組化 烤片、脫蠟、復(fù)水方法同上。沸騰抗原修復(fù)3 min，3%過氧化氫阻斷非特異性，正常動(dòng)物非免疫羊血清封閉，一抗4℃孵育過夜，孵育二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染后脫水透明，中性樹膠封片，室溫陰干。

1.3.7 組織鑒定 由本院病理科醫(yī)師對(duì)患者原發(fā)灶腫瘤組織和類器官的HE染色和IHC染色結(jié)果進(jìn)行鑒定。IHC評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：以腫瘤細(xì)胞胞膜和（或）胞漿著色為基準(zhǔn)，隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野，以陽性表達(dá)強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)綜合判斷。A：按顯色細(xì)胞數(shù)記分，陽性細(xì)胞數(shù)＜1/3為1分，陽性細(xì)胞數(shù)1/3～2/3為2分，陽性細(xì)胞數(shù)＞2/3為3分。B：按細(xì)胞顯色深淺記分，無陽性反應(yīng)細(xì)胞為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。積分?jǐn)?shù)=A×B。A×B=0判斷為（-），A×B=1～2判斷為（+），A×B=3～4判斷為（++），A×B=6～9判斷為（+++）。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌組織分離后形成球體結(jié)構(gòu)

本研究培養(yǎng)和鑒定卵巢癌類器官的流程見圖1，結(jié)果顯示，003號(hào)卵巢癌類器官培養(yǎng)成功，見表1。在培養(yǎng)過程中觀察到來自003號(hào)卵巢癌患者的腫瘤組織被分離后，在Matrigel內(nèi)存活下來，形成緊密的球形細(xì)胞團(tuán)，初代培養(yǎng)至14 d時(shí)球體直徑最高能達(dá)到100 μm以上，見圖2；且該類器官傳代后仍可存活，見圖3。

圖1 卵巢癌類器官構(gòu)建及鑒定操作流程圖Fig.1 Operation flow chart of organoid construction and identi?fication

圖2 003號(hào)卵巢癌類器官初代培養(yǎng)第14天（100×）Fig.2 Primary culture organoids of patient No.003 on the 14th day(100×)

圖3 003號(hào)卵巢癌類器官第2代培養(yǎng)第14天（100×）Fig.3 2nd generation of cultured organoids of patient No.003 on the 14th day(100×）

表1 卵巢癌類器官的病理類型和構(gòu)建情況Tab.1 Pathological classification and construction of ovarian cancer organoids

2.2 卵巢癌類器官保留了原腫瘤的組織細(xì)胞特征

HE染色結(jié)果顯示，003號(hào)患者原腫瘤組織和類器官均表現(xiàn)出細(xì)胞核異型性和染色質(zhì)濃聚的腺癌特征，兩者在結(jié)構(gòu)上高度相似，見圖4。003號(hào)患者原腫瘤組織和培養(yǎng)至第2代的類器官免疫組化結(jié)果顯示，兩者p53、PAX?8、WT?1、CK7的表達(dá)程度均高度相似，尤其是p53和PAX?8，見圖5。

圖4 003號(hào)患者原腫瘤組織與類器官第2代的HE染色結(jié)果對(duì)比（200×）Fig.4 Comparison of HE staining results of the second generation of the original tumor tissue organoids of patient No.003(200×)

圖5 003號(hào)患者原腫瘤組織和類器官p53、PAX?8、WT?1、CK7的免疫組化結(jié)果對(duì)比（200×）Fig.5 Comparison of the immunohistochemical results of p53,PAX?8,WT?1 and CK7 between the primary tissues and the organoid of patient No.003(200×)

表2 003號(hào)患者原卵巢癌組織和類器官免疫組化結(jié)果Tab.2 Immunohistochemical results of primary ovarian cancer tissue and organoid of patient No.003

3 討論

目前已構(gòu)建的卵巢腫瘤類器官涵蓋多種類型，其中高級(jí)別漿液性癌（HGS）最常見［8?11］。其他構(gòu)建成功的類型還包括低級(jí)別漿液性癌（LGS）、子宮內(nèi)膜樣癌（EMC）、黏液性癌（SBT）、透明細(xì)胞癌（CCC），也有黏液性囊腺瘤（MBT）、交界性Brenner瘤（BBT）、漿液性交界性腫瘤（MC）［9?10］。組織的取材部位多為原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的腫瘤組織［9?12］，也有取用腹水中的卵巢癌細(xì)胞［13］。早期發(fā)表的文獻(xiàn)中有先將組織培養(yǎng)成卵巢癌原代細(xì)胞系再種至Matrigel里培養(yǎng)成類器官，但這種方法近年未見采用［14?15］。類器官的鑒定方法主要依靠與原組織進(jìn)行HE染色和免疫組化染色對(duì)比，有條件還會(huì)進(jìn)行全外顯子組測(cè)序（WES）［8］。本研究構(gòu)建了高級(jí)別漿液性卵巢癌類器官并使用HE染色和免疫組化染色進(jìn)行鑒定。培養(yǎng)到第2代的類器官和原腫瘤組織均表現(xiàn)出了腺癌特征，p53、WT?1、PAX?8和CK7的表達(dá)情況也相似，因此初步認(rèn)為本次構(gòu)建的卵巢癌類器官在組織和細(xì)胞層面可以代表原腫瘤組織。

培養(yǎng)液成分是成功構(gòu)建類器官至關(guān)重要的條件。KESSLER團(tuán)隊(duì)針對(duì)輸卵管上皮細(xì)胞（FTE）類器官研發(fā)的培養(yǎng)液成分是目前大多數(shù)卵巢腫瘤類器官培養(yǎng)的參考基礎(chǔ)，包括將輸卵管類器官補(bǔ)充有絲分裂原EGF、抑制BMP活性的Noggin、調(diào)節(jié)旁分泌Wnt信號(hào)的Wnt3a和RSPO1、抑制失巢凋亡的ROCK抑制劑、抑制TGF?β受體激酶的ALK4/5和FGF?10［16］。其他添加在卵巢癌類器官培養(yǎng)液的因子還有A83?01（可以抑制TGF?β途徑）、SB202190（可以抑制MAPK途徑、阻止分泌譜系分化）［17］。本課題組成功培養(yǎng)的類器官也添加了上述因子。KESSLER等［16］認(rèn)為，添加EGF增加了類器官的增殖數(shù)量，而添加RSPO1激活增大了類器官的體積，維持了類器官的穩(wěn)定生長(zhǎng)。然而，卵巢癌類器官與正常組織類器官關(guān)于Wnt信號(hào)通路的作用反應(yīng)不同。活躍的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)保留了正常輸卵管上皮類器官的干性，且在類器官培養(yǎng)中被認(rèn)為是傳代培養(yǎng)的重要成分［16］。而與之相反，HOFFMANN等［11］在構(gòu)建卵巢高級(jí)別漿液性癌類器官時(shí)發(fā)現(xiàn)其干性的維持受益于低Wnt信號(hào)和活躍的BMP信號(hào)，激活Wnt通路會(huì)抑制其生長(zhǎng)。由此可見，Wnt信號(hào)通路在卵巢癌類器官生長(zhǎng)中的作用還存在爭(zhēng)議。

在國(guó)內(nèi)鮮見培養(yǎng)卵巢腫瘤類器官的情況下，本研究參考國(guó)外已發(fā)表的研究成果，成功構(gòu)建出與原腫瘤在組織和形態(tài)上相似的卵巢癌類器官，初步證實(shí)了這些方法的可行性，但是也還有許多問題有待改進(jìn)，其中傳代就是一大挑戰(zhàn)。經(jīng)分析，001號(hào)與002號(hào)的類器官均因傳代后無法存活而構(gòu)建失敗，可能由于操作時(shí)酶解消化過度導(dǎo)致。此外，類器官培養(yǎng)成適用于實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵策€有許多問題需要解決，如類器官在培養(yǎng)過程易受不同程度的正常細(xì)胞污染，低腫瘤純度可以影響類器官衍生效率，以及類器官與組織之間的基因組相關(guān)性［9］。由于類器官在三維培養(yǎng)下生長(zhǎng)存在一定的邊緣效應(yīng)，即處于基質(zhì)膠外圍的類器官一般尺寸較大，而處于基質(zhì)膠中間的尺寸偏小，這些異質(zhì)性給高通量類器官細(xì)胞數(shù)定量及尺寸統(tǒng)計(jì)分析帶來了一定困難［18］。還值得注意的是，本研究中由于用于包埋的類器官已經(jīng)是從基質(zhì)膠中解離出的細(xì)胞團(tuán)塊，包埋制片難度大，成片體現(xiàn)出的組織結(jié)構(gòu)較扁平松散且有基質(zhì)膠殘留，這為組織鑒定帶來了一定難度。為了促進(jìn)類器官更加穩(wěn)定的培養(yǎng)，本團(tuán)隊(duì)今后將從取材部位、細(xì)胞分離、培養(yǎng)液成分、基質(zhì)膠成分、包埋切片等方面進(jìn)一步完善卵巢癌類器官的培養(yǎng)和標(biāo)本制備方法，使卵巢癌類器官能大規(guī)模培養(yǎng)和廣泛鑒定，為類器官應(yīng)用于卵巢腫瘤研究打下更堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。