金愛(ài)萍，李書(shū)琳，張倩榕，李 冰

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院老年心血管科，陜西西安 710004)

冠狀動(dòng)脈疾病(coronary artery disease, CAD)發(fā)病率和死亡率連年攀升。據(jù)統(tǒng)計(jì)，CAD死亡率由1951年的12.8%上升至2015年44.6%[1]。CAD主要由冠狀動(dòng)脈壁的動(dòng)脈粥樣硬化而引起[2]，而血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)異常增殖可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，加劇疾病的發(fā)生和發(fā)展[3]。全面了解VSMCs的增殖在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成中的作用，對(duì)預(yù)防和治療CAD具有重要意義。

微小RNA(miRNA)是小的非編碼RNA，可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)[4]。miRNA的表達(dá)失調(diào)可影響心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展[5]。有報(bào)道m(xù)iR-214在血管損傷和心力衰竭中介導(dǎo)血管生成[6]。miR-133a釋放入冠狀動(dòng)脈循環(huán)可能是CAD進(jìn)展和并發(fā)癥的病理機(jī)制[7]。同時(shí)，在CAD患者的血清中，miR-574-5p表達(dá)顯著增加，被認(rèn)為是診斷CAD的生物標(biāo)志物[8]。

miR-17通過(guò)靶向染色質(zhì)修飾蛋白1A(chromatin modifying protein 1A, CHMP1A)調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的增殖和分化，為視網(wǎng)膜變性疾病的治療提供了理論依據(jù)[9]。miR-17通過(guò)靶向胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin-like growth factors-1, IGF-1)調(diào)節(jié)冠心病中內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和凋亡[10]。上調(diào)的miR-17通過(guò)靶向RND3腫瘤抑制基因而促進(jìn)細(xì)胞增殖，調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)和細(xì)胞周期進(jìn)程[11]。然而，miR-17在CAD患者中的生物學(xué)功能和分子機(jī)制以及對(duì)VSMCs的調(diào)控機(jī)制還并不清楚。本研究旨在探討miR-17在VSMCs增殖中的作用及其相關(guān)機(jī)制，以期為CAD預(yù)防和治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 血清樣本分別選取2018年1月至2019年1月西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院收治CAD患者的血液樣本共32份(n=32)，收集正常的健康者血液樣本30份(n=30)。從各參與者中抽取5 mL外周血，在2 h內(nèi)進(jìn)行血清提取處理，并于-80 ℃長(zhǎng)期保存。在收集樣本前，所有參與者均提供了書(shū)面知情同意書(shū)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染VSMCs和人支氣管上皮細(xì)胞16HB來(lái)源于四川大學(xué)華西醫(yī)院(四川，中國(guó))。使用Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)培養(yǎng)細(xì)胞，該培養(yǎng)基中添加了100 mL/L FBS和1%青霉素-鏈霉素溶液(索萊寶，北京，中國(guó))，并在37 ℃ 50 mL/L CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。miR-17模擬物和帶有隨機(jī)序列的陰性對(duì)照(NC)從上?；蛑扑幱邢薰?上海，中國(guó))獲得。質(zhì)粒pcDNA-IGF-1由上?；蛩帢I(yè)有限公司(上海，中國(guó))合成。使用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen, 沃爾瑟姆，美國(guó))，按照說(shuō)明書(shū)將所有質(zhì)粒轉(zhuǎn)染VSMCs，轉(zhuǎn)染24 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 RT-qPCR測(cè)定miR-17和IGF-1的mRNA表達(dá)用Trizol試劑(Invitrogen, CA，美國(guó))分別自CAD患者血清和VSMCs中提取總RNA。使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(RNase H)試劑盒(GeneCopoeia，Rockville，美國(guó))合成cDNA。反應(yīng)條件：引物與RNA模板先于65 ℃處理5 min再置于冰上，然后加入逆轉(zhuǎn)反應(yīng)緩沖液及dNTPs，42 ℃孵育60 min，再70 ℃、5 min終止反應(yīng)。qRT-PCR的20 μL反應(yīng)體系：1 μL逆轉(zhuǎn)錄cDNA(終質(zhì)量濃度5 ng/μL)、12.5 μL 2×SYBR Green I MasterMix及0.5 μmol/L特異性正向引物、0.5 μmol/L反向引物各1 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 7 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s，共40個(gè)循環(huán)。相關(guān)引物序列見(jiàn)表1。分別選擇U6和GAPDH作為歸一化對(duì)照，使用2-△△Ct方法計(jì)算miR-17和IGF-1的相對(duì)表達(dá)。所有實(shí)驗(yàn)設(shè)3組重復(fù)。

表1 miR-17與IGF-1和相關(guān)內(nèi)參基因的引物序列

1.4 CCK-8測(cè)定VSMCs和人支氣管上皮細(xì)胞16HB的細(xì)胞增殖按照CCK-8試劑盒(Beyotime，南京，中國(guó))使用說(shuō)明書(shū)操作。將VSMCs和人支氣管上皮細(xì)胞16HB細(xì)胞(對(duì)照，NC)在96孔板中培養(yǎng)。第3天開(kāi)始，每孔中將10 μL CCK-8溶液添加到培養(yǎng)基中繼續(xù)孵育2 h，吸取各孔相應(yīng)培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至新的96孔板中，熒光酶標(biāo)儀用于檢測(cè)450 nm處的吸光度，觀察細(xì)胞增殖能力。

1.5 克隆形成測(cè)定細(xì)胞增殖分別將用miR-17模擬物或pcDNA-IGF-1轉(zhuǎn)染的VSMCs細(xì)胞懸液(500個(gè)細(xì)胞/孔)接種到6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3 d更換培養(yǎng)液并觀察細(xì)胞計(jì)數(shù)，當(dāng)大多數(shù)克隆中細(xì)胞數(shù)超過(guò)50個(gè)時(shí)，取出6孔板，棄上清、洗滌、甲醛固定，然后用結(jié)晶紫染色后進(jìn)行克隆計(jì)數(shù)。

1.6 生物信息學(xué)和熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)TargetScan和RNAhybrid用于預(yù)測(cè)靶基因。參照文獻(xiàn)方法[12]進(jìn)行雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因檢測(cè)。將野生型或突變型IGF-1擴(kuò)增到psi-CHECK2報(bào)道載體(Promega，威斯康星州，美國(guó))中。將總共2×105個(gè)VSMCs接種到12孔板中，隨后使用LipofectamineTM3000(Invitrogen，沃爾瑟姆，美國(guó))與野生型或突變型質(zhì)粒IGF-1 3′-UTR載體和miR-17模擬物或NC模擬物共轉(zhuǎn)染。在37 ℃下放置48 h。根據(jù)制造商的說(shuō)明，采用雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因分析系統(tǒng)(Promega，麥迪遜，威斯康星州，美國(guó))檢測(cè)VSMCs的熒光素酶活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用GraphPad Prism 6(San Diego, CA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間差異使用t檢驗(yàn)或單因素方差分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-17在CAD中上調(diào)RT-qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CAD患者血清和VSMCs中miR-17的表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.01，圖1)。這表明CAD患者的血清和細(xì)胞中的miR-17表達(dá)上調(diào)。

圖1 RT-qPCR檢測(cè)CAD患者血清(A)和培養(yǎng)VSMCs中(B)miR-17的mRNA表達(dá)

2.2 miR-17的過(guò)表達(dá)促進(jìn)VSMCs增殖miR-17模擬物轉(zhuǎn)染到VSMCs中，成功過(guò)表達(dá)(P<0.01)；通過(guò)CCK-8和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VSMCs增殖的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-17過(guò)表達(dá)組VSMCs細(xì)胞增殖和克隆形成數(shù)均顯著升高(P<0.05，圖2)。這表明miR-17的過(guò)表達(dá)促進(jìn)VSMCs增殖。

圖2 miR-17的過(guò)表達(dá)促進(jìn)VSMCs增殖

2.3 miR-17的低表達(dá)抑制VSMCs增殖miR-17抑制物轉(zhuǎn)染的VSMCs中miR-17呈現(xiàn)低表達(dá)(P<0.05)；CCK-8和克隆形成檢測(cè)VSMCs增殖的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-17低表達(dá)組VSMCs細(xì)胞增殖和克隆形成數(shù)均顯著降低(P<0.01，圖3)。這表明miR-17低表達(dá)可抑制VSMCs增殖。

圖3 miR-17表達(dá)下調(diào)抑制VSMCs增殖

2.4 miR-17靶向調(diào)控IGF-1應(yīng)用生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)的結(jié)果表明，在IGF-1的3′-UTR中觀察到miR-17的結(jié)合位點(diǎn)(圖4A)。同時(shí)，熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定結(jié)果顯示，與野生型IGF-1質(zhì)粒和miR-17模擬物共轉(zhuǎn)染的VSMCs的熒光素酶活性升高(P<0.01)，而轉(zhuǎn)染突變型IGF-1質(zhì)粒和miR-17模擬物的VSMCs的熒光素酶活性無(wú)改變(圖4B)。RT-qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在miR-17過(guò)表達(dá)的VSMCs中IGF-1表達(dá)上調(diào)(P<0.01，圖4C)。這表明，IGF-1是miR-17的靶標(biāo)基因，且受其正向調(diào)控。

圖4 miR-17靶向調(diào)控IGF-1

2.5 miR-17通過(guò)IGF-1促進(jìn)VSMCs增殖用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-IGF-1并成功過(guò)表達(dá)IGF-1；CCK-8和克隆形成測(cè)定的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，IGF-1過(guò)表達(dá)組VSMCs細(xì)胞增殖和克隆形成數(shù)均顯著升高(P<0.05，圖5)。這表明，miR-17通過(guò)IGF-1促進(jìn)VSMCs增殖。

圖5 miR-17通過(guò)IGF-1調(diào)控VSMCs增殖

3 討 論

CAD主要由動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成所引起，是血栓形成或急性冠狀動(dòng)脈疾病的結(jié)果。miRNA可能參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，并作為重要的潛在生理檢測(cè)指標(biāo)[13]。而VSMCs異常增殖可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，加劇疾病的發(fā)生和發(fā)展[14]。

miRNA是短鏈非編碼RNA分子，通過(guò)與靶基因的3′-UTR結(jié)合在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。miR-17家族又稱(chēng)為miR-106b家族，其結(jié)構(gòu)相近，種子序列相同(AAAGUGCU)[15-16]。近年來(lái)已在不同病理模型中證實(shí)，miR-17不但參與動(dòng)物心、肺、免疫系統(tǒng)等器官發(fā)育，并在腫瘤發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[17-18]。已有研究報(bào)道，CAD患者miR133a、208b、126、197、223和122-5p的高水平與高死亡率緊密關(guān)聯(lián)[19-23]。調(diào)節(jié)其表達(dá)可能是抑制VSMCs增殖的有效方法，從而改善血管內(nèi)皮細(xì)胞的再生、血管損傷和減輕病理性心臟肥大[24]。例如，在冠心病中，miR-17通過(guò)靶向IGF-1調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和凋亡[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-17在CAD患者血清和VSMCs中均上調(diào)；miR-17的過(guò)表達(dá)促進(jìn)VSMCs增殖，而miR-17的低表達(dá)抑制VSMCs增殖，表明miR-17可以作為CAD的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。這提示miR-17促進(jìn)CAD的病程發(fā)展，可能是一個(gè)重要的預(yù)防和治療的靶標(biāo)。

IGF-1是一種肽激素，在促進(jìn)細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)以及抑制炎癥中起著至關(guān)重要的作用[25]。然而，IGF-1的抗炎和修復(fù)功能會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化，IGF-1的部分缺乏則導(dǎo)致收縮力和血管緊張素Ⅱ敏感性降低，并改變了涉及心臟結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)基因的表達(dá)，促使心血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[26-27]。本研究結(jié)果顯示，IGF-1是miR-17的潛在靶標(biāo)，受miR-17的正向調(diào)控，IGF-1的過(guò)表達(dá)促進(jìn)誘導(dǎo)VSMCs的增殖。IGF-1可能參與CAD進(jìn)展的調(diào)控，可作為潛在的治療靶標(biāo)。

綜上所述，本研究表明，miR-17在CAD患者血清和VSMCs中表達(dá)上調(diào)；miR-17的過(guò)表達(dá)促進(jìn)VSMCs增殖，而miR-17的低表達(dá)抑制VSMCs增殖；IGF-1是miR-17的靶標(biāo)，并受其正向調(diào)控；miR-17通過(guò)IGF-1促進(jìn)VSMCs增殖。miR-17可以作為CAD預(yù)測(cè)和治療的生物標(biāo)志物，IGF-1可能是潛在的治療靶點(diǎn)。