梁 晨，上官健，李瑞春，郭世文

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710061)

血管擬態(tài)(vasculogenic mimicry, VM)是膠質(zhì)瘤逃避抗血管生成治療的重要機制之一[1]。星形細胞上調(diào)基因-1(astrocyte elevated gene-1, AEG-1)能夠通過激活多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤的侵襲、增殖、血管生成及化療抵抗等，是一種很重要的原癌基因[2-3]。前期研究表明，利用siRNA(small interfering RNA)下調(diào)AEG-1基因表達能夠在體外顯著抑制膠質(zhì)瘤VM形成[4]。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，擬構(gòu)建AEG-1 shRNA(short hairpin RNA)慢病毒表達載體并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染U87膠質(zhì)瘤細胞，通過構(gòu)建裸鼠膠質(zhì)瘤原位模型，研究下調(diào)AEG-1基因表達對在體膠質(zhì)瘤VM形成的影響，旨在為膠質(zhì)瘤抗VM治療提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 試劑及耗材DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco)；pLVX-ShRNA2-puro、psPAX2以及pMD2.G質(zhì)粒(湖南優(yōu)寶生物)；嘌呤霉素(Gibco)；兔抗CD34多克隆抗體、免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(博士德)；PAS染色試劑盒(Solarbio)；兔抗人AEG-1抗體(Abnova)；兔抗人GAPDH抗體、兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)抗體、兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)抗體(Bioworld)；兔抗人血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)抗體(Abcam)；兔抗人血管內(nèi)皮細胞鈣粘連蛋白(vascular endothelial-cadherin, VE-cadherin)抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(Thermo)；RNA fast200總RNA抽提試劑盒(上海飛捷)；PrimeScript RT Master Mix kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix ExTaqⅡ?qū)崟r定量熒光試劑盒、XhoⅠ、T4 DNA連接酶BamHⅠEcoRⅠ(TaKaRa)；薄型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小量制備試劑盒(GENEray)；金牌超量無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(康為世紀(jì))；lipofectamine 2000(Invitrogen)。

1.2 細胞培養(yǎng)及實驗動物U87膠質(zhì)瘤細胞株及HEK293T細胞株購于中科院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心，細胞于含100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)、50 mL/L CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，2 d換液1次，2～3 d傳代。雄性Rowett裸鼠(Crl：NIH-Foxn1rnu)30只，體質(zhì)量180～240 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。裸鼠飼養(yǎng)于恒溫、恒濕，12 h明暗交替循環(huán)的超凈層流飼養(yǎng)室，動物飼料、飲水、墊料均經(jīng)過滅菌處理。動物實驗方案經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 AEG-1 shRNA質(zhì)粒構(gòu)建

1.3.1合成AEG-1 shRNA片段 根據(jù)課題組前期研究結(jié)果選擇干擾效率最高的AEG-1 siRNA序列用于構(gòu)建AEG-1 shRNA質(zhì)粒[4]。根據(jù)目的序列設(shè)計PCR引物，并引入EcoRⅠ、BamHⅠ及XhoⅠ酶切位點。引物序列如下：Forward 5′-GATCCGCCGTAATCAACCCTATATTTCAAGAGAATATAG-GGTTGATTACGGCTTTTTTCTCGAGG-3′；Reverse 5′-AATTCCTCGAGAAAAAAGCCGTAATCAACCCTATATTCTCTTGAAATATAGGGTT-GATTACGGCG-3′。上述引物與annealing buffer混合后，經(jīng)94 ℃退火5 min，自然冷卻至室溫，取1 μL退火產(chǎn)物加H2O至100 μL。

1.3.2構(gòu)建AEG-1 shRNA質(zhì)粒 質(zhì)粒pLVX-ShRNA2-Puro經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ酶切，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳回收大片段。以T4 DNA連接酶將稀釋后的AEG-1 shRNA片段與線性化的pLVX-ShRNA2-Puro載體連接，取10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，涂布于含氨芐青霉素(ampicillin, Amp)的LB平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。從培養(yǎng)皿上挑取單克隆菌落接種于5 mL Amp的LB培養(yǎng)液中，37 ℃恒溫搖床培養(yǎng)過夜。按試劑盒說明書小量提取質(zhì)粒，用XhoⅠ做酶切鑒定。挑選酶切正確的質(zhì)粒進行測序，測序無誤后按試劑盒說明書進行大規(guī)模提取AEG-1 shRNA質(zhì)粒(pLVX-ShRNA2-Puro-AEG1)。以陰性對照(negative control, NC)序列代替AEG-1 siRNA序列構(gòu)建pLVX-ShRNA2-Puro-control質(zhì)粒作為陰性對照，構(gòu)建方法同上。

1.4 AEG-1 shRNA慢病毒表達載體的構(gòu)建將3 μg pLVX-ShRNA2-puro-AEG1(陰性對照組為pLVX-ShRNA2-Puro-control)、1.5 μg psPAX2、1.5 μg pMD2.G質(zhì)粒加入含9 μL Lipofectamine 2000的500 μL無血清培養(yǎng)基中混合，加入HEK293T細胞培養(yǎng)基中。24 h時熒光顯微鏡下觀察，48 h時收獲含病毒上清液，命名為AEG-1 shRNA慢病毒(陰性對照組命名為sh-control 慢病毒)。用含有病毒的細胞上清液感染正常HEK293T細胞，48 h時熒光顯微鏡下觀察GFP表達，檢驗病毒活力。

1.5 AEG-1 shRNA U87穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的篩選

1.5.1確定嘌呤霉素最優(yōu)篩選濃度 取對數(shù)生長期的U87細胞，胰酶消化，以每孔1×104個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；分別加入終質(zhì)量濃度分別為0、1×10-4、2×10-4、4×10-4、6×10-4、8×10-4、1×10-3、1.5×10-3、2×10-3g/L的嘌呤霉素，每日檢查細胞活力，篩選出最優(yōu)質(zhì)量濃度。

1.5.2慢病毒轉(zhuǎn)染 將細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板至細胞匯合度達到60%；每孔加入0.5 mL含病毒上清液，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，更換新鮮培養(yǎng)基。

1.5.3篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株 病毒轉(zhuǎn)染48 h，檢測GFP表達，更換新鮮培養(yǎng)基并加入最佳質(zhì)量濃度嘌呤霉素；每2～3 d更換新鮮含嘌呤霉素的培養(yǎng)基，以替換含大量死細胞的培養(yǎng)基，直到抗性群落被識別出。陰性對照組以sh-control慢病毒轉(zhuǎn)染U87細胞，穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株篩選方法同上。

1.6 AEG-1 shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)U87細胞中AEG-1表達的檢測收獲AEG-1 shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞，提取總RNA及蛋白，Western blotting及Real-time PCR檢測細胞中AEG-1 mRNA及蛋白表達，方法同參考文獻[4]。

1.7 裸鼠膠質(zhì)瘤原位模型的建立及實驗分組裸鼠膠質(zhì)瘤原位模型的建立按照文獻方法[5]進行。30只裸鼠隨機分為AEG-1 shRNA組、陰性對照組、空白對照組，每組10只。AEG-1 shRNA組顱內(nèi)注射穩(wěn)定轉(zhuǎn)染AEG-1 shRNA慢病毒表達載體的U87細胞株；陰性對照組注射穩(wěn)定轉(zhuǎn)染sh-control慢病毒表達載體的U87細胞株；空白對照組注射普通U87細胞。

1.8 CD34-PAS雙染檢測裸鼠膠質(zhì)瘤模型中VM的形成顱內(nèi)注射腫瘤細胞21 d后，裸鼠經(jīng)40 g/L多聚甲醛灌注固定后取腦組織制作石蠟切片。取部分石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后，按免疫組化試劑盒說明書進行CD34免疫組織化學(xué)染色；部分切片按PAS染色試劑盒說明書進行PAS染色。所有切片用蘇木素復(fù)染，脫水并固定，顯微鏡下觀察評估CD34-/PAS+的管腔樣結(jié)構(gòu)形成情況。

1.9 免疫組織化學(xué)染色檢測膠質(zhì)瘤模型中VM形成相關(guān)基因的表達石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后，按免疫組化試劑盒說明書進行MMP-2、MMP-9、VE-cadherin、VEGF免疫組織化學(xué)染色，IPP6.0軟件分析平均吸光度(average absorbance, AA)評估蛋白相對表達水平。

2 結(jié) 果

2.1 AEG-1 shRNA慢病毒表達載體的構(gòu)建質(zhì)粒載體pLVX-ShRNA2-Puro原本含一個XhoⅠ的酶切位點，設(shè)計AEG-1 shRNA片段時人為引入了XhoⅠ的酶切位點。質(zhì)粒載體pLVX-ShRNA2-Puro被XhoⅠ酶切出約1 400 bp的DNA條帶(圖1A)，說明目的基因片段已成功插入。將3種質(zhì)粒導(dǎo)入HEK293T細胞24 h的熒光顯微鏡下觀察顯示，轉(zhuǎn)染效率達到60%以上(圖1B)。將含有病毒的細胞上清液轉(zhuǎn)染正常HEK293T細胞48 h，可檢測到GFP的表達(圖1C)，證實病毒轉(zhuǎn)染效果良好。

圖1 AEG-1 shRNA慢病毒表達載體的構(gòu)建

2.2 AEG-1 shRNA U87穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的篩選經(jīng)篩選實驗確定嘌呤霉素最優(yōu)質(zhì)量濃度為1×10-3g/L。U87細胞經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染48 h，可檢測到GFP表達，經(jīng)嘌呤霉素篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株(圖2)。

圖2 經(jīng)篩選后的U87穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的GFP表達

2.3 AEG-1 shRNA對U87細胞中AEG-1 mRNA表達的影響與空白對照及陰性對照組比較，AEG-1 shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株中AEG-1 mRNA及蛋白表達顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖3)。

圖3 AEG-1 shRNA對U87細胞AEG-1 mRNA表達的影響

2.4 shRNA沉默AEG-1基因?qū)β闶竽z質(zhì)瘤模型中VM形成的影響AEG-1 shRNA組裸鼠原位模型中，VM數(shù)量較空白對照組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，空白對照組與陰性對照組組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖4)。

圖4 shRNA沉默AEG-1基因?qū)β闶竽z質(zhì)瘤模型中VM形成的影響

2.5 shRNA沉默AEG-1基因表達對裸鼠膠質(zhì)瘤模型中VM形成相關(guān)基因的影響AEG-1 shRNA組裸鼠原位模型中，MMP-2、MMP-9、VEGF、VE-cadherin的表達較空白對照組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖5、圖6，P<0.01)。

圖5 免疫組織化學(xué)染色檢測各組裸鼠膠質(zhì)瘤模型中血管擬態(tài)形成相關(guān)蛋白表達(×100)

圖6 各組裸鼠膠質(zhì)瘤模型中血管擬態(tài)形成相關(guān)蛋白表達的比較

3 討 論

AEG-1作為Ha-ras以及cyclin D1的下游基因，能夠通過激活NF-κB、PI3K-Akt以及Wnt等信號通路，促進腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成以及化療抵抗等[2-3]。膠質(zhì)瘤中，AEG-1能夠通過誘導(dǎo)保護性自噬、減少活性氧簇生成等多種途徑促進膠質(zhì)瘤進展及侵襲[3,6]。而AEG-1與膠質(zhì)瘤VM形成之間的關(guān)系，目前少有報道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，利用siRNA下調(diào)AEG-1基因表達能夠在體外顯著抑制膠質(zhì)瘤VM形成[4]。本研究進一步構(gòu)建AEG-1 shRNA慢病毒表達載體及裸鼠原位膠質(zhì)瘤模型，發(fā)現(xiàn)下調(diào)AEG-1基因表達在體內(nèi)同樣能夠抑制膠質(zhì)瘤VM形成，這一結(jié)果從動物模型在體實驗證實了下調(diào)AEG-1基因?qū)δz質(zhì)瘤VM形成的抑制作用，是對前期研究更深入而有力的補充。

有關(guān)下調(diào)AEG-1表達對膠質(zhì)瘤VM形成的調(diào)節(jié)機制，目前還不十分清楚。已經(jīng)證實有多種不同的分子機制及信號通路參與腫瘤VM形成。研究者認為，在眾多的分子中，MMP-2有至關(guān)重要的作用，其與皮脂腺癌、顱內(nèi)血管外皮細胞瘤以及乳腺癌等多種腫瘤VM形成密切相關(guān)[7-9]。其促進VM形成的機制主要是參與細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的重塑[10]。MMP-2的活化能夠使層粘連蛋白-5γ2鏈分裂，這些分裂形成的碎片沉積在ECM中，參與ECM可塑性變化、腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲及VM形成[11]。與MMP-2類似，MMP-9也是MMP家族的重要成員。MMP-9的過度表達與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)有關(guān)[12]，后者已被證實參與VM的形成[13]。已證實FAK-ERK1/2在VM形成過程中調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-9的表達和激活[14]。抑制MMP-2/MMP-9的表達可以顯著抑制VM的形成[15-16]。

VE-cadherin是鈣黏蛋白家族中的一種黏附分子，也是VM形成的關(guān)鍵分子之一。在黑色素瘤細胞中，缺乏VE-cadherin顯著抑制VM形成[17]。VE-cadherin誘導(dǎo)EphA2重新定位到細胞膜上，隨后使EphA2磷酸化[18]?；罨腅phA2可使FAK磷酸化，從而激活ERK1/2，進而激活PI3K?；罨腜I3K調(diào)節(jié)pro-MT1-MMP向MT-MMP和MMP-2轉(zhuǎn)化。而MT1-MMP和MMP-2都能夠促進VM的形成。

此外，研究證實VEGF在VM形成中也有重要作用。VEGF能夠通過上調(diào)VE-cadherin、EphA2以及MMPs的表達參與ECM重塑及VM形成[19]。而ERK1/2通路以及PI3K/Akt通路在這一過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[20-21]。下調(diào)VEGF表達同樣能夠抑制VM形成[21-22]。

本課題組研究前期發(fā)現(xiàn)，siRNA下調(diào)AEG-1表達能明顯下調(diào)膠質(zhì)瘤細胞中MMP-2及VEGF的表達[4]。本研究進一步證實抑制AEG-1表達能夠顯著下調(diào)膠質(zhì)瘤原位模型中MMP-2、MMP-9、VEGF以及VE-cadherin的表達。考慮到上述基因?qū)M形成的促進作用，推測下調(diào)AEG-1抑制VM形成的作用機制可能部分是通過調(diào)節(jié)MMP-2、MMP-9、VEGF以及VE-cadherin表達而實現(xiàn)，其具體機制有待進一步研究。

綜上所述，下調(diào)AEG-1表達能夠在體內(nèi)外抑制膠質(zhì)瘤VM形成，這一結(jié)果或許能為針對VM進行膠質(zhì)瘤靶向治療提供新的思路。