潘怡霞，劉 睿，衛(wèi) 嬋，馬 強，王慰敏

(1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710061；2. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，浙江杭州 310012；3. 西安市長安區(qū)婦幼保健計劃生育服務(wù)中心，陜西西安 710100；4. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院周圍血管科，陜西西安 710061)

妊娠期高血壓疾病是妊娠期與高血壓并存的一組疾病，發(fā)生率為5%～12%，其中之一的子癇前期為孕產(chǎn)婦最常見的并發(fā)癥，發(fā)病率為2%～8%，嚴(yán)重影響母嬰健康，每年可致大約70 000孕產(chǎn)婦和500 000圍產(chǎn)兒死亡[1]。特別在我國“二孩”政策開放后，隨著高齡孕產(chǎn)婦數(shù)量的增加，子癇前期的發(fā)病率亦有上升趨勢[2]。子癇前期的病因和發(fā)病機制至今仍未闡明，其中“兩階段”學(xué)說目前被廣為接受，氧化應(yīng)激反應(yīng)介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷是子癇前期的基本病理變化之一[3]。Hippo信號通路是在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的高度保守信號通路，主要通過一系列激酶級聯(lián)磷酸化反應(yīng)來抑制細(xì)胞增殖和促凋亡。Yes-相關(guān)蛋白(Yes-associated protein, YAP)是Hippo信號通路上最核心的一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，YAP1已被證實在多種實體腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞株(肝臟、胃、結(jié)直腸、卵巢、膀胱等)中過表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞增殖及抗凋亡。有研究提示，YAP1在乳腺癌中發(fā)揮抑癌基因的作用[4]。最新的研究指出，Hippo-YAP1通路在正常妊娠和妊娠并發(fā)癥中發(fā)揮著獨特作用，如著床失敗、子癇前期和習(xí)慣性流產(chǎn)[5]，然而，YAP1在子癇前期發(fā)生發(fā)展中的具體作用鮮有報道。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，YAP1參與的Hippo信號通路通過調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和增殖，可能在重度子癇前期的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[6]。前期研究主要從組織學(xué)角度證實了YAP1的表達(dá)與子癇前期發(fā)病的相關(guān)性。為了進一步研究YAP1與子癇前期發(fā)病的相關(guān)性，本研究擬在本課題組前期研究基礎(chǔ)上，利用缺氧環(huán)境模擬妊娠初期胎盤形成時的生理性低氧狀態(tài),使用YAP1抑制劑維替泊芬(verteporfin, VP)，探究缺氧環(huán)境下抑制YAP1基因表達(dá)對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)凋亡、遷移、侵襲及血管形成能力的影響及參與子癇前期發(fā)生的可能機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及培養(yǎng)條件細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)：培養(yǎng)細(xì)胞系采用HUVEC系。將HUVEC從液氮中取出復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中(Gibco C11875500BT)，置于含50 mL/L CO2、37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。將復(fù)蘇成功的細(xì)胞培養(yǎng)傳至2代后開始實驗。缺氧處理條件參考楊曉濤等[7]探索的最佳模擬PE體外細(xì)胞模型條件，即10 mL/L O2培養(yǎng)。后續(xù)實驗細(xì)胞在常氧或缺氧環(huán)境下(10 mL/L O2+940 mL/L N2+50 mL/L CO2)培養(yǎng)，缺氧組使用的細(xì)胞培養(yǎng)基提前缺氧處理12 h。

1.2 MTT法確定維替泊芬實驗藥物濃度選擇處于對數(shù)生長期的HUVEC，胰酶消化重懸后按105/mL細(xì)胞密度接種于96孔板，每孔100 μL，共分5組藥物濃度，每組設(shè)8個復(fù)孔，共10板。細(xì)胞貼壁后在缺氧環(huán)境孵箱中培養(yǎng)24 h后，各組分別加入0、4、8、12、16 μg/mL的維替泊芬[VP，溶解于二甲基亞砜(DMSO)]，缺氧環(huán)境下繼續(xù)孵育12、24 h后分別吸棄培養(yǎng)液，加入100 μL完全培養(yǎng)基，并加入10 μL MTT。繼續(xù)避光復(fù)氧孵育4 h后，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min后，酶標(biāo)儀測定各孔490 nm波長處吸光度(A)值。以各孔A值與空白對照A值的比值作為細(xì)胞活性值。實驗重復(fù)3次。根據(jù)MTT結(jié)果計算維替泊芬的IC50值，根據(jù)所得IC50值后續(xù)實驗選用16 μg/mL的維替泊芬進行。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況實驗分為缺氧對照組和缺氧實驗組(即缺氧VP組，使用維替泊芬16 μg/mL)。收集HUVEC，用胰蛋白酶消化并重懸細(xì)胞，接種于6孔板中，每孔5×105個。待細(xì)胞貼壁后，實驗組加入維替泊芬使其終質(zhì)量濃度為16 μg/mL，對照組加入等量DMSO。各組在缺氧環(huán)境下分別孵育細(xì)胞 12、24 h。收集細(xì)胞原培養(yǎng)基至對應(yīng)標(biāo)號的15 mL離心管，PBS洗滌2次，胰酶消化后用完全培養(yǎng)基吹打使細(xì)胞完全分散，移至對應(yīng)離心管后離心棄上清。使用PBS洗滌2次，加結(jié)合緩沖液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL；取100 μL重懸的細(xì)胞至流式管，加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI，輕輕混勻，室溫(20～25 ℃)避光孵育15 min。每管加入400 μL結(jié)合緩沖液，用300目(孔徑40～50 μm)尼龍網(wǎng)過濾，1 h內(nèi)上機檢測細(xì)胞凋亡情況并計算凋亡率。

1.4 細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷徙能力實驗分組同前。收集HUVEC，用胰蛋白酶消化并重懸細(xì)胞，接種于6孔板中。待細(xì)胞匯合度約90%后，用100 μL微量移液器槍頭在6孔板內(nèi)垂直劃痕，PBS漂洗3次，去除脫落細(xì)胞，每孔加入2 mL無血清RPMI 1640培養(yǎng)基,于倒置光學(xué)顯微鏡下拍照，記為0 h劃痕寬度。各實驗組加入維替泊芬使其終質(zhì)量濃度為16 μg/mL，對照組加入等量DMSO。各組在缺氧環(huán)境下分別孵育細(xì)胞12、24 h后，分別在相同位置拍照測量劃痕寬度，并計算劃痕愈合率，以此反映細(xì)胞的遷移能力。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-12 h或24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.5 Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲能力實驗分組同前。用無血清培養(yǎng)基按體積比1∶7稀釋Matrigel，將Transwell小室放入24孔板中，加入50 μL稀釋后的Matrigel于上室中，于37 ℃恒溫?zé)o菌培養(yǎng)箱中孵育30 min，吸出Matrigel表面的液體。收集細(xì)胞，用胰蛋白酶消化并重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL。上室加入200 μL細(xì)胞懸液，下室加入500 μL含100 mL/L FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液。向各組上室中分別加入終質(zhì)量濃度為16 μg/mL的維替泊芬和等量DMSO，于37 ℃缺氧環(huán)境培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24 h。取出小室，用棉簽擦去小室內(nèi)未侵襲的細(xì)胞，40 g/L多聚甲醛固定10 min，晾干后加入結(jié)晶紫染色10 min，PBS漂洗3次，晾干后在高倍顯微鏡下隨機選擇5個視野，計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，并計算平均值。

1.6 小管形成實驗檢測血管生成能力實驗分組同前。將基質(zhì)膠置于4 ℃冰箱融化，同時將96孔板和槍頭在4 ℃冰箱預(yù)冷。在96孔板中鋪32 μL基質(zhì)膠，實驗操作在冰上進行，37 ℃孵育30 min，等待基質(zhì)膠完全凝固。收集HUVEC，用胰蛋白酶消化并重懸細(xì)胞，PBS洗滌2次后使用無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL。分別取1 mL加入EP管中，按照實驗分組情況加入相對應(yīng)的藥物，取100 μL各組細(xì)胞懸液，缺氧環(huán)境培養(yǎng)12 h后在倒置顯微鏡下隨機選取5個視野拍照觀察成血管情況。使用ImageJ軟件對結(jié)果進行分析。

1.7 Western blotting檢測YAP、TEAD1蛋白表達(dá)實驗分為常氧對照組、常氧VP組(維替泊芬16 μg/mL)、缺氧對照組和缺氧VP組(維替泊芬16 μg/mL)。按照實驗分組在常氧或缺氧環(huán)境下孵育細(xì)胞，培養(yǎng)12 h及24 h后分別收集樣本。提取各組HUVEC中的總蛋白。用含PMSF的裂解液在冰上裂解30 min，用BCA(Bicinchoninic acid)蛋白定量試劑盒對提取的蛋白進行定量后分裝，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。各組取30 μg總蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳分離后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。封閉后加入相應(yīng)一抗及二抗。PVDF膜采用化學(xué)發(fā)光法顯色，以β-actin為內(nèi)參照計算各目的蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 維替泊芬在缺氧環(huán)境下對HUVEC增殖、凋亡的影響用不同濃度的維替泊芬處理HUVEC，在缺氧環(huán)境下分別培養(yǎng)12 h及24 h，通過MTT法測定A值，計算細(xì)胞存活率。結(jié)果證實，在缺氧環(huán)境下，維替泊芬可抑制HUVEC增殖，除最低藥物濃度4 μg/mL除外，在相同作用時間下，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞存活率呈下降趨勢；且在同濃度藥物處理時，隨著作用時間延長，細(xì)胞存活率降低。通過GraphPad Prism 8.0計算出缺氧環(huán)境下維替泊芬處理HUVEC 12、24 h的IC50值分別為13.26、16.74 μg/mL，后續(xù)均選擇維替泊芬16 μg/mL進行實驗。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，在缺氧環(huán)境下，維替泊芬處理細(xì)胞12、24 h后細(xì)胞凋亡率均高于對照組[12 h：(9.75±1.56)%vs.(41.61±4.54)%；24 h：(10.11±1.86)%vs.(50.18±4.78)%]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.51、13.55，P<0.01，圖1)。

圖1 維替泊芬在缺氧環(huán)境下對HUVEC增殖、凋亡的影響

2.2 維替泊芬對缺氧環(huán)境下HUVEC遷移、侵襲能力的影響細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示，缺氧環(huán)境下，維替泊芬(后續(xù)實驗VP濃度均為16 μg/mL)處理12、24 h后細(xì)胞遷徙能力均低于對照組[12 h：(20.51±2.16)%vs.(12.75±2.03)%；24 h：(30.10±2.96)%vs.(17.52±2.75)%]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.54、5.41，P<0.05，圖2A、圖2B)。Transwell小室實驗結(jié)果顯示，在缺氧環(huán)境下，維替泊芬處理12、24 h后細(xì)胞侵襲能力均低于對照組[12 h：(48.60±2.61)vs.(20.80±2.86)；24 h：(61.00±2.74)vs.(29.60±1.52)]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=16.05、22.43，P<0.01，圖2C、圖2D)。結(jié)果表明，在缺氧環(huán)境下，維替泊芬能夠抑制HUVEC的遷移、侵襲能力。

圖2 維替泊芬在缺氧環(huán)境下對HUVEC細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

2.3 維替泊芬對缺氧環(huán)境下HUVEC血管生成能力的影響血管生成實驗結(jié)果顯示，維替泊芬(16 μg/mL)處理HUVEC 12 h后細(xì)胞分支數(shù)低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.38，P<0.001，圖3A、圖3B)。結(jié)果表明，在缺氧環(huán)境下，維替泊芬可以抑制HUVEC的血管生成能力。

圖3 維替泊芬在缺氧環(huán)境下對HUVEC細(xì)胞血管生成能力的影響

2.4 維替泊芬對YAP1及其下游信號通路的影響Western blotting結(jié)果顯示，在常氧環(huán)境下，維替泊芬(16 μg/mL)處理HUVEC 12 h后YAP1及其下游TEAD1蛋白表達(dá)均低于對照組(t=13.94、19.04，P<0.001，圖4A-4C)；處理24 h后，YAP1及其下游TEAD1蛋白表達(dá)均低于對照組(t=14.42、5.62，P<0.01，圖4A-4C)。在缺氧環(huán)境下，維替泊芬處理HUVEC 12 h后YAP1蛋白表達(dá)均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.26，P<0.001，圖4D、圖4E)，但TEAD1培養(yǎng)12 h后兩組表達(dá)變化不明顯(P=0.127，圖4D、圖4F)；在維替泊芬處理24 h后，HUVEC中YAP1和TEAD1蛋白表達(dá)低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=14.09、9.39，P<0.01，圖4D-4F)。結(jié)果表明，無論在常氧或缺氧環(huán)境下，不同作用時間的維替泊芬均能抑制YAP1蛋白的表達(dá)，增加藥物作用時間后，其下游轉(zhuǎn)錄因子TEAD1表達(dá)也發(fā)生降低。

圖4 維替泊芬對YAP1及TEAD1蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

子癇前期是一種與妊娠相關(guān)的多系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重威脅母嬰健康。子癇前期的病因和發(fā)病機制有很多學(xué)說，目前認(rèn)為多種因素、機制及通路均參與子癇前期的發(fā)病[8]。有學(xué)者認(rèn)為，子癇前期與胎盤淺著床及缺血再灌注誘發(fā)的氧化應(yīng)激有關(guān)[9]，導(dǎo)致終端絨毛體積/面積減少、促炎細(xì)胞因子升高、炎癥反應(yīng)過度及血管生成失衡[10]。這些改變引起了內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和炎癥，最終導(dǎo)致母胎不良結(jié)局。近年來研究表明，Hippo信號通路通過調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡參與器官發(fā)育、干細(xì)胞全能性維持等過程，并被證實在腫瘤發(fā)生進展及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用。YAP1基因是Hippo信號通路中最核心的轉(zhuǎn)錄共激活因子，非磷酸化的YAP1/TAZ轉(zhuǎn)運入細(xì)胞核內(nèi)，作為輔激活因子與轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合調(diào)控目的基因的表達(dá)。TEAD1-4作為主要的轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)了YAP1/TAZ絕大部分的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)[11]。其中TEAD1與YAP1具有高水平的表達(dá)相關(guān)性，二者形成YAP-TEAD復(fù)合物，共同調(diào)節(jié)下游原癌基因c-myc、Axl和血管生成因子等表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞增殖和存活[12]。YAP-TEAD復(fù)合物參與的生物學(xué)過程主要包括細(xì)胞黏附、血管新生、DNA轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞轉(zhuǎn)移等。本課題組前期的研究證實，與正常妊娠胎盤組織相比，重度子癇前期患者胎盤中YAP1、TAZ的mRNA及蛋白表達(dá)水平下降，而其上游的蛋白激酶MST1/2表達(dá)明顯上升。另外，本課題組前期的研究還證明，在滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/SVneo中，抑制YAP1表達(dá)組細(xì)胞的侵襲能力明顯減弱，過表達(dá)YAP1組細(xì)胞則侵襲能力明顯增強[6]。

綜上所述，Hippo-YAP1信號通路通過調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和增殖，可能在重度子癇前期的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。

既往的研究表明，缺氧狀態(tài)能夠促進毛細(xì)血管生成及內(nèi)皮細(xì)胞遷移[13]。在妊娠初期，由于胚胎及胎盤抗氧化能力尚未建立，子宮內(nèi)處于生理性低氧狀態(tài)，以保護胚胎及胎盤免受氧化損傷。低氧促進血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及毛細(xì)血管管狀形成，是保持絨毛內(nèi)血管生成的重要因素。GENBACEV等[14]研究表明，細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞及絨毛組織在2%氧濃度下，細(xì)胞有絲分裂增加、增殖活躍；DUNWOODIE等[13]研究表明，妊娠早期低氧通過調(diào)節(jié)絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生成因子(VEGF)及其受體表達(dá)，促進絨毛小葉中血管生成，而氧濃度過大則會抑制血管的生成。這些研究都提示，低氧對胎盤的正常形成起到至關(guān)重要的作用。

結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果，我們推測Hippo-YAP1信號通路的激活可能影響低氧環(huán)境下胎盤血管生成及功能，從而促進子癇前期的發(fā)生。目前子癇前期胎盤中YAP1蛋白表達(dá)的下降是否影響胎盤血管的生成尚未見報道。維替泊芬是一種光學(xué)增強劑，它可以阻斷YAP-TEAD 復(fù)合物的形成并阻斷下游因子的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，影響血管生成[15]。本研究應(yīng)用維替泊芬下調(diào)HUVEC中YAP1蛋白表達(dá)，以檢測缺氧環(huán)境下下調(diào)YAP1是否影響HUVEC的活性及功能。結(jié)果顯示，在缺氧環(huán)境下使用低濃度維替泊芬(4 μg/mL)時，HUVEC增殖增加，這可能與低氧環(huán)境刺激促進血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖有關(guān)，但隨著藥物濃度的增加，缺氧環(huán)境下維替泊芬能夠抑制HUVEC增殖、促進細(xì)胞凋亡，并且能夠降低其遷移、侵襲能力和血管生成能力。說明在缺氧環(huán)境下，YAP1蛋白的表達(dá)降低可能通過降低血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、侵襲能力，促使細(xì)胞過度凋亡而影響胎盤血管生成，導(dǎo)致多器官功能紊亂，參與子癇前期發(fā)生。蛋白免疫印跡的結(jié)果說明，無論在常氧或缺氧環(huán)境下，維替泊芬均能有效抑制YAP1蛋白的表達(dá)。TEAD1作為YAP1的下游轉(zhuǎn)錄因子，隨著抑制時間的延長，其蛋白表達(dá)水平也出現(xiàn)了下降。

綜上所述，本研究表明，在缺氧環(huán)境下維替泊芬通過抑制YAP1及其下游TEAD1的表達(dá)，能夠抑制HUVEC增殖，促進細(xì)胞凋亡，并顯著降低其遷移、侵襲能力和血管生成能力，進一步證實了Hippo-YAP1信號通路可能通過調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和侵襲，影響子癇前期胎盤血管形成，參與子癇前期的發(fā)生。但本研究僅為體外細(xì)胞學(xué)實驗，其具體參與機制還需進一步探索和確證。