張 蕾，王 敏，張新新，張欣悅，張富鑫，曹 珍，張卉，郭增軍

(1. 西安交通大學(xué)藥學(xué)院，陜西西安 710061；2. 陜西省植物提取物工程技術(shù)中心，陜西西安 710061；3. 西安交通大學(xué)附屬西安市兒童醫(yī)院，陜西西安 710003; 4. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西西安 710061)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率伴隨著年齡的增長而增加，已嚴(yán)重威脅女性健康[1-2]。目前，對乳腺癌的治療是以手術(shù)為主，聯(lián)合放療、化療和內(nèi)分泌治療的綜合治療模式，但是手術(shù)治療和放射治療主要適用于局部治療，而用于乳腺癌化療的藥物如阿霉素、環(huán)磷酰胺和5-氟尿嘧啶等均具有較強的不良反應(yīng)，并且多藥耐藥的產(chǎn)生極大地限制了治療效果。因此，尋找高效低毒的抗腫瘤藥物是當(dāng)前抗腫瘤治療領(lǐng)域的熱點。

白屈菜紅堿(chelerythrine)是一種天然的苯并菲啶類生物堿(圖1)，具有抗菌[3-4]、抗血小板[5]、抗炎[6]、抗寄生蟲[7]、抗腫瘤[9]等多種生物活性作用。白屈菜紅堿對多種腫瘤(前列腺癌、乳腺癌、肝癌、腎癌、胃癌等)顯示出細(xì)胞毒活性[9 -13]。在抗乳腺癌方面，白屈菜紅堿可選擇性抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的生長，對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的半抑制濃度(IC50)為1.6 μmoL。其作用機制是通過產(chǎn)生活性氧而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10,14]，且白屈菜紅堿可通過抑制體外MDR1和P-gp的表達(dá)來逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞的多藥耐藥性[15]。以上研究表明白屈菜紅堿具有發(fā)展為乳腺癌治療藥物的潛力，但白屈菜紅堿抗乳腺癌的作用靶點和分子機制尚不清楚，阻礙了其進(jìn)一步的研究與臨床應(yīng)用。

圖1 白屈菜紅堿的結(jié)構(gòu)

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是近年來融合系統(tǒng)生物學(xué)、高通量篩選、計算機技術(shù)等方法研究“藥物-靶點-疾病”之間復(fù)雜關(guān)系的學(xué)科，可加速藥物靶點的確認(rèn)[16]。分子對接技術(shù)是評估有機小分子配體與靶標(biāo)蛋白相互作用的方法，其優(yōu)勢在于其速度和精度[17]，可用以確定天然產(chǎn)物小分子和靶標(biāo)蛋白的結(jié)合位點及結(jié)合力的大小。

本研究旨在運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及分子對接技術(shù)，闡釋白屈菜紅堿抗乳腺癌的作用機制，為白屈菜紅堿發(fā)展成為抗乳腺癌藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 白屈菜紅堿的反向?qū)ぐ醒芯坷肞ubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取白屈菜紅堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)，然后將該化合物結(jié)構(gòu)上傳至Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)，檢索可得白屈菜紅堿的作用靶點集。在人類疾病數(shù)據(jù)庫Malacards(http://www.malacards.org/)中檢索“Breast cancer”得到乳腺癌相關(guān)靶點基因集。使用UniPort數(shù)據(jù)庫中UniProt KB功能，輸入藥物與疾病靶點名稱，獲得相應(yīng)靶點的UniProt號。尋找成分靶點集與疾病靶點集的重復(fù)項，這些重復(fù)項即為白屈菜紅堿對乳腺癌可能的作用靶點。

1.2 白屈菜紅堿潛在作用靶點互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析將白屈菜紅堿對乳腺癌的潛在作用靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)，獲得所預(yù)測靶點的相互作用關(guān)系。使用Cytoscape 3.7.2軟件繪制 “靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)”(PPI)，通過軟件分析計算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，包括度值(degree)、介數(shù)(betweenness centrality, BC)等。

1.3 基因本體(gene ontology, GO)功能富集和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析將白屈菜紅堿抗乳腺癌的靶基因上傳至 Metascape數(shù)據(jù)庫(http://metascape.org/)，獲得GO功能富集以及KEGG信號通路富集分析結(jié)果。GO分類富集分析包括細(xì)胞組分(cellular component, CC)、生物過程(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)3個部分，通過R語言將顯著性差異排序前20位的基因富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.4 分子對接研究使用Chemdraw 14.0軟件將白屈菜紅堿的結(jié)構(gòu)進(jìn)行能量最小化。通過靶蛋白數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)獲得核心靶基因的三維結(jié)構(gòu)，用Discovery Studio 2016軟件對受體蛋白進(jìn)行預(yù)處理。使用AutoDock Vina 1.5.6軟件進(jìn)行半柔性對接，對接結(jié)果用Pymol與Ligplot軟件進(jìn)行可視化。

1.5 核心靶基因表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性分析利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(https://kmplot.com/analysis/)的乳腺癌數(shù)據(jù)集分析核心靶基因的表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，篩選條件：①mRNA-seq: breast cancer；②Probe set options: user selected probe set，其他選項按默認(rèn)設(shè)置。

2 結(jié) 果

2.1 白屈菜紅堿的反向?qū)ぐ醒芯繌腗ala Cards數(shù)據(jù)庫獲得乳腺癌相關(guān)的靶基因858個，Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測白屈菜紅堿相關(guān)的靶點100個。將藥物靶點映射到疾病靶點中，最終獲得白屈菜紅堿抗乳腺癌的潛在作用靶點37個(表1)。

表1 白屈菜紅堿作用于乳腺癌的37個靶點

2.2 白屈菜紅堿潛在作用靶點互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析基于STRING平臺獲取白屈菜紅堿抗乳腺癌靶點間的互作信息，在Cytoscape 3.7.2軟件中進(jìn)行可視化及分析。得到白屈菜紅堿抗乳腺癌靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖2)，該網(wǎng)絡(luò)包括36個節(jié)點，163條邊。對靶點互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，分析參數(shù)包括“度”和“中介”。度為某個節(jié)點連接的邊的總數(shù)目，該參數(shù)的意義在于衡量節(jié)點間直接聯(lián)系的能力，而中介性則反映了節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中所處位置的樞紐程度。將PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的度值和中介性均高于平均值的節(jié)點作為白屈菜紅堿抗乳腺癌的核心靶點。經(jīng)計算，得到8個關(guān)鍵靶點(表2)：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)，絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1, MAPK1)，酪氨酸激酶受體2(Erb-B2 receptor tyrosine kinase 2, ERBB2)，細(xì)胞周期檢控點激酶(checkpoint kinase 1, CHEK1)，磷脂酰肌醇-3-激酶α單位(phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha, PIK3CA)，組蛋白去乙?；?histone deacetylase 1, HDAC1)，人前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2, PTGS2)，絲裂原活化蛋白激酶14(mitogen-activated protein kinase 14, MAPK14)。

表2 白屈菜紅堿抗乳腺癌的關(guān)鍵靶基因

圖2 白屈菜紅堿的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.3 GO功能與KEGG通路富集分析利用Metascape數(shù)據(jù)庫對白屈菜紅堿抗乳腺癌的潛在靶標(biāo)進(jìn)行GO分類富集和 KEGG通路富集分析。根據(jù)顯著性程度，GO功能富集分析與 KEGG通路分析均以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。GO富集分析共獲得317條GO條目，KEGG富集分析共獲得80條KEGG條目。

GO分類富集分析結(jié)果中，富集比例較高、P值較小的在BP分析中為激酶活性的正調(diào)控和細(xì)胞對激素刺激的反應(yīng)等；CC分析中為微管組織中心和中心體等；在MF分析中為蛋白激酶活性和組蛋白脫乙酰酶活性等。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，白屈菜紅堿抗乳腺癌靶基因主要參與PI3K/AKT信號通路、VEGF信號通路、ErbB信號通路等。將PI3K/AKT信號通路中關(guān)鍵靶點的分布進(jìn)行可視化(圖3)。并根據(jù)P值，將排名前20位的富集結(jié)果用R軟件進(jìn)行可視化(圖4)。

圖3 PI3K/AKT信號通路中關(guān)鍵靶點的分布

圖4 GO和KEGG富集分析

2.4 核心靶基因與乳腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性分析為了明確白屈菜紅堿作用于乳腺癌的核心靶基因是否能作為乳腺癌患者預(yù)后的分子標(biāo)志物，利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析核心靶基因表達(dá)與乳腺癌患者生存期的關(guān)系(圖5)。結(jié)果顯示，CHEK1和PIK3CA基因低表達(dá)患者的生存期顯著高于這兩種基因高表達(dá)患者(P<0.05)。mTOR和PTGS2基因高表達(dá)患者的生存期顯著高于兩種基因低表達(dá)患者(P<0.05)。MAPK1、MAPK14、ERBB2和HDAC1基因的表達(dá)量與患者的生存期無關(guān)(P>0.05)。

圖5 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析核心靶基因表達(dá)與乳腺癌患者生存期的關(guān)系

2.5 分子對接分析使用Autodock Vina 1.5.6將核心靶基因與白屈菜紅堿進(jìn)行分子對接分析，對接的參數(shù)設(shè)置及相應(yīng)的計算結(jié)果見表3 。使用Ligplot及Pymol軟件進(jìn)行可視化(圖6)，結(jié)果顯示，白屈菜紅堿與核心靶蛋白的結(jié)合自由能均小于-7 kcal/mol。結(jié)合常數(shù)的絕對值越大，說明化合物所需的自由能越少，一般認(rèn)為其絕對值大于7的時候，化合物和蛋白兩者結(jié)合的可能性較大[18]。本研究結(jié)果顯示，白屈菜紅堿與核心靶蛋白結(jié)合的可能性較大。

表3 對接參數(shù)及相應(yīng)計算結(jié)果

圖6 分子對接結(jié)果

3 討 論

乳腺癌已成為女性癌癥死亡的第二大病因，現(xiàn)有的乳腺癌化療藥物存在著不良反應(yīng)大、易產(chǎn)生耐藥性、缺乏選擇性等局限性，因此研究開發(fā)治療乳腺癌的新藥物具有重要意義[19-21]。苯并菲啶類生物堿是一種天然來源的異喹啉類生物堿，研究發(fā)現(xiàn)這類化合物對多種腫瘤細(xì)胞顯示出細(xì)胞毒活性，并且能夠逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性。主要活性成分為苯并菲啶類生物堿及其衍生物的抗腫瘤藥物UkrainTM對多種腫瘤細(xì)胞顯示出細(xì)胞毒活性而對正常細(xì)胞無作用，且能對腫瘤細(xì)胞起輻射增敏作用而對正常細(xì)胞有輻射保護(hù)作用[24-25]。白屈菜紅堿為最早發(fā)現(xiàn)的一類苯并菲啶類生物堿，具有顯著的抗腫瘤活性，可通過作用于BCL-2家族[12]、誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧[14]、影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[22]、抑制PKC[23]、阻滯細(xì)胞周期[8]等發(fā)揮抗腫瘤作用。因此，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，深入挖掘白屈菜紅堿抗乳腺癌的作用靶點，旨在揭示其抗乳腺癌的作用機制并為其進(jìn)一步的臨床研究提供科學(xué)依據(jù)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為藥物的作用機制研究提供了全新的視角，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來尋找藥物作用靶點，對藥物的研究具有指導(dǎo)意義。本研究基于反向?qū)ぐ醒芯坎呗?，得到白屈菜紅堿抗乳腺癌的作用靶點37個，通過對37個作用靶點構(gòu)建PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，最終得到關(guān)鍵靶點8個，分別為mTOR、MAPK1、ERBB2、CHEK1、PIK3CA、HDAC1、PTGS2和MAPK14。有研究證實，mTOR的表達(dá)與乳腺癌預(yù)后不良有關(guān)，而很多mTOR抑制劑已經(jīng)應(yīng)用于臨床[26-27]。 MAPK對乳腺癌及三聯(lián)陰亞型的發(fā)生起重要作用[28]。ERBB2是一種致癌基因，且ERBB2高表達(dá)的乳腺癌患者對于化療藥物及激素藥物反應(yīng)較差[29-30]。在乳腺癌中CHEK1高表達(dá)，且過表達(dá)CHEK1 mRNA可促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生[31]。 PIK3CA基因是一種高突變率原癌基因，其突變可使多種信號通路異常，從而導(dǎo)致原位雜交促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和存活[32]。研究報道，HDAC1高表達(dá)的患者預(yù)后較好，患者的總生存期和無瘤生存期均較長[33]。 PTGS2基因變異與乳腺癌易感性相關(guān)[34-35]。有研究報道，白屈菜紅堿可作用于mTOR，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用[21]，支持mTOR是白屈菜紅堿抗乳腺癌關(guān)鍵靶點的預(yù)測結(jié)果。

GO功能富集分析白屈菜紅堿抗乳腺癌的靶基因，結(jié)果顯示，白屈菜紅堿發(fā)揮抗乳腺癌作用與細(xì)胞周期密切相關(guān)。已有研究顯示，白屈菜紅堿可通過誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞系凋亡和細(xì)胞周期停滯而選擇性地抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞系的生長[10]，這與本研究預(yù)測的結(jié)果一致。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，白屈菜紅堿發(fā)揮抗乳腺癌作用與PI3K / AKT信號通路密切相關(guān)。PI3K/AKT通路與乳腺癌多藥耐藥具有密切關(guān)系，且是調(diào)控侵襲轉(zhuǎn)移的重要信號通路[36]。已有研究表明，白屈菜紅堿可作用于PI3K/AKT/mTOR信號通路下調(diào)MMP-2/9的表達(dá)，從而抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移作用[22]，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測結(jié)果，可以推斷PI3K/AKT/mTOR信號傳導(dǎo)通路是白屈菜紅堿抗乳腺癌的主要作用途徑，該結(jié)論為后續(xù)研究提供了思路。

Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫包含了54 675個基因和21種癌癥的生存數(shù)據(jù)，可以進(jìn)行基因的臨床預(yù)后相關(guān)數(shù)據(jù)的分析[37]。利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析白屈菜紅堿作用于乳腺癌的核心靶基因的生存曲線，結(jié)果顯示，上述8個關(guān)鍵靶點基因中的CHEK1、PIK3CA、mTOR和PTGS2基因的表達(dá)量與乳腺癌患者的生存期有關(guān)。提示CHEK1、PIK3CA、mTOR和PTGS2基因可能作為乳腺癌生存和預(yù)后的指標(biāo)，而這些基因可能是白屈菜紅堿影響乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因。

分子對接是將配體分子放置于受體分子的活性位點，尋找其合理的取向和構(gòu)象，而使配體和受體結(jié)合達(dá)到化學(xué)互補和空間互補的最佳匹配狀態(tài)。反向?qū)邮侵笇⒛骋惶囟ɑ衔锱c多個受體蛋白相結(jié)合，從而發(fā)現(xiàn)藥物的可能作用靶點[38]?；诜聪蚍肿訉蛹夹g(shù)，將白屈菜紅堿與核心靶基因進(jìn)行對接，分析復(fù)合物的結(jié)合模式，結(jié)果顯示，白屈菜紅堿與核心靶基因具有較好的結(jié)合活性，白屈菜紅堿可能通過結(jié)合核心靶基因發(fā)揮其抗乳腺癌作用。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析預(yù)測了白屈菜紅堿抗乳腺癌的潛在靶點及作用機制，并通過分子對接技術(shù)闡釋了白屈菜紅堿與核心靶蛋白的結(jié)合模式，為抗乳腺癌藥物的研發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。